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发酵过程优化控制


L-赖氨酸发酵过程的优化
摘要: 利用田口法的内外表与 Box 性能规则优化赖氨酸发酵条件。 通过实验得知, 转速、硫酸铵和葡萄糖浓度对发酵影响较大。稳定的最优发酵条件为初始葡萄糖 浓度为 80g/L、硫酸铵浓度为 42g/L、转速为 225r/min、初始 pH 值为 6.7、接种 量为 8%。经实验验证,最优化发酵条件是低灵敏度的,最优目标值比较稳健。 关键词:L-

赖氨酸,发酵优化,稳健性设计 L一赖氨酸发酵属于Ⅱ类发酵,产物的形成和能量代谢部分偶联,发酵过程 中高浓度的基质对菌体的生长、产物的生成有抑制作用。微生物生长动态过程具 有高度非线性和时变性的特点,发酵过程中各变量之间的关系比较复杂,而且在 实际过程中这些变量处于在一定范围内波动的不稳定状态, 加之关键变量无法在 线测量,从而使得对发酵过程的控制非常复杂。大多数传统优化方法。如正交设 计、均匀设计等方法优化所得的发酵工艺一般缺乏弹性,在实际生产中,优化的 工艺参数的变化会带来生产结果的大的起伏,很难获得稳定的产酸水平。稳健性 设计的思想是由日本的田口玄一博士提出的,他认为优质产品应该是“稳健性产 品”,即其性能对各种干扰(外干扰、内干扰、产品间波动)极不敏感。稳健性设 计普遍适用于化工、轻工、电子、机械、冶金等行业,它的优点是选择系统中各 可控因素的最佳水平组合,从而减少各种干扰的影响,使产品稳定性最好,便于 发酵过程优控制。 一、概述 1.1 L-赖氨酸 L-赖氨酸是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种。L赖氨酸是国际市场上发展前景良好的产品,消费需求每年以7.10%的速度递增, 国内年产量则以每年20.30%以上的速度递增。研究L-赖氨酸的生产对我国有重 大而深远的影响,对提高国际竞争力具有十分重要的意义。 1.2 L-赖氨酸理化性质 L-赖氨酸又名α,ε-二氨基己酸或 2,6-二氨基己酸,分子式为 C6H14N2O2, 分子量为 146.19。结构式如下:

L-赖氨酸在水溶液中的解离常数pKl=2.20(一COOH),pK2=8.90(α—NH2), pk3=10.28(α-NH3+),等电点pI=9.59。在48%酒精溶液中的解离常数pKl=2.75, pK2=8.95 , 3=10.53。 pK 在84%溶液中的解离常数pKl=3. pK2=8. pK3=10. 55, 95, 49。 20 比旋光度[α]D =+21°(C=8g/100mL,6mol/L HCl),熔点263℃,单斜晶系,稍有 甜味,易溶于水,难溶于甲醇、乙醇、乙醚、苯、丙酮、醋酸乙酯和氯仿等有机 溶剂。赖氨酸结晶在60℃以下及相对湿度60%以下稳定,在相对湿度60%以上, 容易吸水生成C6H14N202·2H20。 1.3 L-赖氨酸的发酵

1960年日本的木下祝郎、 中山清等用紫外线照射谷氨酸捧杆菌得到一株营养 缺陷型变异株,从此开始了发酵法工业生产商品赖氨酸。发酵法是当今世界上生 产赖氨酸的主要方法。年产量在20万t以上。 细菌合成赖氨酸的途径主要是二氨基庚二酸途径(DAP),即赖氨酸合成途径

(AK天冬氨酸激酶;PS二氢吡啶二羧酸合成酶;HD高丝氨酸合成酶;HK高丝 氨酸激酶) 1.4 L-赖氨酸的功能及应用 L-赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于食物中赖氨酸含量甚低,加工过程中易被 破坏,引起赖氨酸缺乏,故常称为第一限制性氨基酸。广泛应用于食品、饲料和 医药工业,在平衡氨基酸组成方面起着十分重要的作用。全球约90%的赖氨酸用 作饲料添加剂,约5%用作食品添加剂,其余5%用作医药中间体。L-赖氨酸在食 品工业中的应用有食品强化和食品除臭剂;在饲料工业中可以促进动物生长发 育,改善肉质,提高产奶、产蛋量和节省蛋白质饲料,使饲料得到充分利用;在 医药工业中可作为营养剂和治疗药剂 二、生产菌的培养 2.1 菌种 L 一赖氨酸产生菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TK12。菌 的主要特征:细胞短杆至小棒状,有时微弯曲,两端钝圆,不分枝,单个或成八 字排列,菌体 0.7~0.9×1.0~2.5 微米。革兰氏阳性。无芽孢,不运动、菌落 湿润、圆形。 2.2 培养基 2.2.1 种子培养基(/L) 蔗糖20.0g,玉米浆(含氮2.0%)30.0mL,(NH4)2SO4 2.0g ,乙酸铵6.0g,

MgSO4· 20 0.4g, 2PO41.0g,L一丙氨酸0.35g,味精0.1g,FeS04· 20 0.01 7H KH 7H
g,MnS04·H20 0.01g,生物素0.1mg,烟酰胺5mg,硫胺素0.2mg,pH7.0—7.2, 0.1Mpa压力灭菌15 min。 2.2.2 发酵培养基(/L)

葡萄糖120.0g, 玉米浆(含氮2.0%)40.0 mL, 4)2SO4 45.0g, 2PO4 3.0g, (NH KH

MgSO4·7H20 1.5g,FeSO4·7H2O 0.015g,MnSO4·H2O 0.015g,生物素0.8mg,
烟酰胺0.8mg,硫胺素0.45mg,CaCO3 30g(单独灭菌),pH7.0-7.2,0.1 Mpa 压力灭菌15 min。 2.3 培养方法 2.3.1 斜面活化培养 取菌种保藏斜面划线接种于活化斜面,31.5±0.5℃培养20—24 h 2.3.2 种子培养 从生长良好的活化斜面刮一满环菌苔转入装有30 mL种子培养基的500 mL三 角瓶中,置巡回式摇床上,31.5±0.5℃振荡培养至对数生长中后期。 2.3.3 摇瓶发酵 将种子液接入装有30 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中,置巡回式摇床上, 31.5±0.5℃振荡培养60 h。添加碳酸钙至30g/L,间歇流加氢氧化钠控制pH值为 7.0左右(每4h 1次)。 2.4 分析方法 2.4.1 菌体生长量 吸取发酵液0.2mL,注入9.8 mL 2% 的HC1溶液中,摇匀后测定D620nm值。 2.4.2 还原糖采用生物传感分析仪测定。 2.4.3 L_赖氨酸含量采用纸层析法、氨基酸分析仪测定。 2.4.4 数据处理与分析方法 Box性能准则。 田口根据工业生产中的实际需要,将质量特征分为如下3类:“望目”,希 望质量特征达到或接近特定的目标值; “望大” 使所关注的质量特征越大越好; , “望小”,使质量特征越小越好。 把产品质量特性Y看作随机变量,这时数学期望为μ、方差为σ2,又设质量 特性值为望目特性,存在目标值T。对于望目特性YT来说,希望其数学期望μ=T, 且方差σ2越小越好。在概率论中,常用变异系数C=σ/μ,作为随机变量欠佳指 标。而以1/Y=μ/ Y作为随机变量优良指标,η=μ2/σ2作为望目特性Y的优良性 指标,μ2 可作为信号,σ2 看作噪声,故称η为信噪比(SN),它是反映产品质 量特性稳定性的重要指标。 Box在田口方法的基础上提出了改进的性能准则, 他采用简单的统计量 Y (响 应平均值)和SD(标准离差)作为性能准则。望目特性质量损失函数为L(y)=K(Y—
Y ) ,表明质量损失与实验结果的平均值 Y 的偏差平方成正比,不仅不合格产品
2

会造成损失, 即使合格产品也会造成损失。 响应偏离目标越远, 造成的损失越大。 假定质量特性值(响应)的测量值分别为y1,y2,…,ym则其质量损失可近似表示为:

在此基础之上,可以定义望目特性下的信噪比:

三、结果 3.1 参数的选择及水平的确定 田口稳健性参数设计的目标是利用现有的资源和技术, 在不增加成本的基础 上获得一个工程上稳健的系统。从设计观点来看,可将因素分为2类,一类是可 控因素,是指那些在发酵过程中可以控制的因素,如葡萄糖浓度、摇床转速、摇 床内温度等,这些因素又称为设计变量;另一类是不可控因素,是指那些对发酵 过程能产生影响,而在实验设计中难于控制的因素,如灭菌时每瓶内培养基营养 成分的损失、摇瓶在摇床内的摆放位置、发酵过程中摇瓶内的pH值等,这些因素 又称为噪声因素。 根据赖氨酸发酵自身特点,并结合工业化生产的实际要求,选择发酵初始葡 萄糖浓度(A)、硫酸铵浓度(B)、初始pH值(C)、转速(D)和接种量(E)等5个因子进 行工艺优化,寻找一组稳健工艺条件,每个因子的取值分为高水平(+)与低水平 (一),每个水平取2个值,见表1。采用田口实验设计内外表法,每组工艺做1次 平行实验,以发酵结束时的L-赖氨酸产量为考核指标,设计方案和实验结果见表 2。 通过计算机辅助软件对表2实验数据进行发酵影响因子显著性分析,结果如 图1,因子对发酵影响的顺序由大到小依次为转速、硫酸铵浓度、初始葡萄糖浓 度、接种量、初始pH值,说明在发酵条件参数中转速,亦即发酵过程的溶氧量和 氮源、碳源对赖氨酸的积累影响最大,而其他因子的影响较小。由于在实际发酵 过程中各因素变量受不确定因素的影响而在一定的范围内波动, 要想实现对所有 参数的准确控制比较困难, 故各参数对发酵结果影响顺序的确定对降低发酵控制 的难度具有重要意义。

3.2 实验数据的处理与分析

采用Box性能准则效应分析实验数据,结果见表3。对L一赖氨酸发酵过程实 现稳健性,信噪比要求越大越好。第4个条件的望目特性信噪比最高,目标值的 平均值也最高;而方差较小,则说明灵敏度较低。 求出每个因素水平的信噪比值平均差异(表4),可见设计因子A、B、D对信噪 比的作用较大,C、E对信噪比的作用较小。现依次分析每个因子:① 因子A:低 水平葡萄糖浓度时有较好的信噪比值, 在发酵过程中葡萄糖浓度过高会抑制菌体 生长和产酸,故选择A一;② 因子B:从信噪比的值来看选择低水平硫酸铵浓度 + 2较好,硫酸铵不但可以用作氮源,NH4 和SO4 -还可激活赖氨酸合成的关键酶之一 天冬氨酸激酶;同样,高浓度的硫酸铵会抵制菌体生长,选择B一;③ 因子C: 发酵过程受初始pH值的影响较小,考虑到培养基调节pH值时NaOH 的加入量会提 高Na+和Cl-浓度从而影响菌体的生长和代谢,故选择C一;④ 因子D:转速低导 致发酵过程溶氧不足, 从而增加杂酸的产生, 故选择D+; 因子E: ⑤ 从信噪比看, 发酵接种量的大小对发酵结果的影响甚微,考虑到大的接种量能减少染菌的机 率,故选择E+。 通过以上分析,在L一赖氨酸发酵过程中摇床的转速、硫酸铵浓度和初始葡 萄糖浓度是3个主控因素,必须准确控制,而发酵初始pH值和发酵接种量的控制 范围相对较宽。分析可得如下最优发酵工艺条件参数:转速225r/min,硫酸铵浓 度42g/L,初始葡萄糖浓度80s/L,初始pH值6.7,接种量8%。 表3 稳健性设计效应分析结果

3.3 验证试验 根据以上的效应分析,在最优条件基础上分别改变发酵初始pH值(6.6,7.2) 和接种量(4%,9%)进行2组发酵实验,发酵周期60 h,产酸水平分别为7O.12、 71.O1 g/L及69.31、70.51 g/L,均与最优目标值相近,说明实验所得的最优化 发酵条件是低灵敏度的,最优目标值比较稳健。 四、 讨论 与传统的参数设计不同,稳健性设计将因素分为可控因素和误差因素,利用 误差因素来模拟可能遇到的各种干扰。本次实验采用田口经典的内外表法,用内 表考察工艺参数的平均特性,用外表考察其稳健性。稳健性实验可以充分考虑到 发酵过程不确定因素的各种干扰, 从而使选定的优化参数组合具有较强的抗干扰 能力,加速小试成果放大的过程。 通过稳健性设计实验,在选择影响发酵结果的参数中,发现转速、硫酸铵浓 度和初始葡萄糖浓度等3个因素对发酵的影响最大。 通过Box性能准则分析得到了 较为稳健的最优发酵条件。 在此发酵培养条件基础上用10 L自控发酵罐发酵65 h, L-赖氨酸盐酸盐的产量为165.68 g/L,比优化前提高了12.4%。经实验验证,所 得发酵结果稳定,说明利用稳健性设计得到的最优发酵条件是低灵敏度的,对外 界非强烈的干扰保持良好的产酸水平。 参考文献: 【1】王均成,王文风.L一赖氨酸发酵生产研究进展[J].发酵科技通讯,第39卷 第4期 2010年10月 【2】孙玉华,冯志彬,徐庆阳,陈宁.氮源对L一赖氨酸发酵的影响[J]. 中国生 物工程杂志,2007,27(1):59--63 【3】 徐朝阳, 朱敏宜, 马杰. 赖氨酸的生产及发展建议[J]. 安徽化工, 2003(5): 14-17 【4】张克旭.氨基酸发酵工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,1995 【5】孙玉华,冯志彬,徐庆阳,陈宁. 基于稳健性设计优化L一赖氨酸发酵过程 [J].生物技术通讯,2007,6 【6】陈银芳. L-赖氨酸产生菌选育及其发酵条件的调控[D].生物技术,2009,19 (4)


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