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7-生物分子的分离纯化-2010


第七章 生物分子的分离纯化

Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics

生物分子(Biomolecule)泛指生物体特有的各类 分子,是自然存在于生物体中的分子的总称,是组 成生命的基本单位。

小分子(如脂类、激素、维生素等) 包括 生物大分子(蛋白质、核酸、糖

复合物等)

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生物分子是生物所特有的有机化合物, 具有如下主要特征:
1)结构复杂有序、具有特殊的层次;

2)行使专一的功能;
3)代谢是其存在的条件; 4)生物分子体系具有自我复制的能力; 5)能人工合成与改造。

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一、生物大分子的制备

生物大分子指的是作为生物体内主要 活性成分的各种分子量达到上万或更 多的有机分子。常见的生物大分子包 括蛋白质、核酸、脂类、糖类。

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生物大分子的制备有以下主要特点:
(1)分离纯化方法千差万别,没有一种标准方法 可通用于各种生物大分子的分离制备; (2)制备几乎都是在溶液中进行的,难以准确估 计和判断 pH 值、温度度等各种参数对溶液中各 种组份的综合影响

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(3)大多数生物大分子的含量极微,分离纯化的 步骤多,流程长,有的目的产物甚至要经过几十 步的操作才能达到所需纯度; (4)分离纯化过程中要保证目标产物的活性。

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生物大分子制备的一般步骤:
确定制备的目的和要求

科研、开发或 发现新的物质 制备的关 键 掌握目的产 物 的理化性质

建立相应的可靠的分析测定方法

文献调研和预备性实验
④③②① 使灵准特 用敏确异 快度度性 捷高高强 方 便

材料的破碎和预处理

最困难 的过程

分离纯化方案的选择和探索 产物纯度的鉴定 产物的浓缩,干燥和保存。 要求达到一维电泳一 条带,二维电泳一个 点,或HPLC和毛细 管电泳都是一个峰

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制备生物大分子的分离纯化方法多种多样, 主要是利用它们之间理化性质的差异。
根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型: (1)根据分子极性大小和溶解度的不同,如溶剂提取技术、 盐析法、分配层析法、分级沉淀法等; (2)根据分子形状和大小不同,如凝胶过滤层析等; (3)根据物质吸附性质不同,如选择性吸附与吸附层析法等; (4)根据分子带电性(电离性质)的差异,如离子交换层析、 电泳、等电聚焦法等。 (5)根据配体特异性,如亲和层析。

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常用破碎方法
破碎方法 机械法 研磨法 匀浆法 捣碎法 酶解法 去垢剂 有机溶剂 反复冻融法 应用 细菌、酵母 机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 组织、细胞 细菌、酵母 细胞

化学法

物理法

超声波法 低渗裂解法 冷热交替法

细胞悬液 红细胞 细菌、病毒

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影响提取效果的因素 (1)pH值 (2)盐浓度(即离子强度) (3)温度 (4)水解酶 (5)搅拌与氧化

(6)有机溶剂
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生物大分子的分离纯化

( ) 盐 析 法

1

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(2)有机溶剂沉淀法

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含蛋白溶 液透析袋

(3) 透析 (dialysis)
透析液

利用透析袋 把大分子蛋 白质与小分 子化合物分 开的方法。

磁子

电磁搅拌器
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二、核酸的分离纯化
核酸(nucleic acid)是遗传信息的携带者, 是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)。
无论是进行核酸结构还是功能研究,首先需要 对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。

DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定了 两者的最适分离与纯化条件的不同
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分离纯化的原则
一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清 除其它分子的污染,保证核酸制品的纯度。

意义:遗传信息全部储存在一级结构之中, 核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以 及和其他生物大分子结合的方式。

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对于核酸的纯化应达到以下三点要求:
1)核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对
酶有抑制作用的有机溶剂; 2)其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子 的污染应降至最低程度; 3)排除其它核酸分子的污染,如提取DNA分子时

应去除RNA,提取RNA分子时应去除DNA。

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保持核酸的完整性
在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对 核酸的破坏。
1)温度不要过高(0~4℃);(高温破坏氢键)

2)控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破 坏磷酸二酯键)
3)保持一定离子强度;

4)减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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核 酸 制 备 的 技 术 路 线

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核酸的浓缩、沉淀与洗涤
? 随着提取试剂的逐步加入,去除杂质时的丢失, 样品中核酸的浓度会逐步下降,当不能满足后 续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。 ? 沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法, ? 优点: ①改变核酸的溶解缓冲液; ②重新调整核酸的浓度; ③去除溶液中某些盐离子与杂质。

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核酸的鉴定与保存
(一)核酸的鉴定 1. 浓度鉴定 核酸浓度的测定可通过紫外分光 光度法与荧光光度法进行。 ⑴ 紫外分光光度法:该法是基于核酸分子中的碱 基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线, 其最大吸收波长为260nm,这一物理特性。
前提:核酸样品要较纯,无显著蛋白质、酚、琼脂糖 及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml

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⑵ 荧光光度法:核酸在荧光染料溴化乙锭 (ethidium bromide,EB)嵌入碱基平面后, 本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光, 且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正 比。

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⒉ 纯度鉴定 紫外分光光度法或荧光光度法皆 可用于核酸制品的纯度鉴定。 ⑴ 紫外分光光度法:该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液 中,纯DNA的A260/A280为1.8,纯RNA的比值为 2.0。比值升高与降低均提示不纯。 ⑵ 荧光光度法:用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA 大得多,电泳迁移率低。

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完整性鉴定

⑴ 琼脂糖凝胶电泳法:以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结 果为依据。基因组DNA片段如发生降解,电泳图呈拖 尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中,三条 带的荧光强度积分应呈特定的比值,如有改变则提示 有RNA的降解。此外,若在点样孔附近有着色条带, 则说明存在DNA 的污染。 ⑵ 其它方法:必要时,还可通过一些特殊的实验来鉴定 RNA的完整性。 如小规模的cDNA第一条链的合成反应,已知大小的某 种mRNA的Northern杂交等

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(二)核酸的保存
(1) 对DNA ① DNA样品溶于pH8.0的TE,4 ℃或-20 ℃保 存;在-70℃可保存数年 ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 (2) 对RNA ① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双 蒸灭菌水中,-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中,加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒 核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
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真核基因组DNA的分离纯化
尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的 不同,其分离纯化的方法不尽相同,但有关分 离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试 剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯 化的一般程序见图7-4。

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真核 基因 组DNA 分离 纯化 的一 般技 术路 线

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1、酚抽提法(SDS法)
本法最初于1976年由Stafford及其同事提出, 通过改良,以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂 解缓冲液破碎细胞,经蛋白酶K处理后,用 pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA,重复抽提至一定 纯度后,根据不同需要进行透析或沉淀处理获 得所需的DNA样品。

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裂解液中: EDTA:离子螯合剂,抑制DNase活性,降低细胞 膜稳定性 SDS:溶解细胞膜、核膜,乳化脂质、蛋白,并 使其变性沉淀,同时变性DNase 无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化 蛋白酶K:消化DNase和胞中的蛋白质 酚:变性沉淀蛋白,抑制DNase活性 pH 8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相,防 止DNA变性
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? SDS法流程图 (以动物组织为例)
动物组织
抽提
离心洗涤

组织匀浆

上层溶液

干燥溶解

细胞裂解

酒精沉淀

DNA溶液

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2、 甲酰胺解聚法
1987年Kupiec等报道了甲酰胺(formamide)解 聚法,该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法 相似,但不进行酚的抽提,而是以高浓度的甲酰 胺裂解DNA与蛋白质的复合物(即染色质),然 后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和有 机溶剂。
该法操作步骤少,但耗时,所得DNA浓度低,适用于 制备大片段DNA
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3、玻棒缠绕法
用该法收集高分子量DNA的沉淀始于20世纪30年代, 现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改 进而来。 本法有两个关键步骤:一是基因组DNA沉淀在细胞 裂解液和乙醇的交界面;二是将DNA沉淀缠绕在带 钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转 移至pH8.0的TE缓冲液中。
该法以盐酸胍裂解细胞,制备的DNA片段约有80kb, 适用于同时从不同细胞或组织标本中提取DNA
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基因组DNA-其它方法
?
?

根据细胞裂解方式的不同有:
物理方式:玻璃珠法、超声波法、研磨法、 冻融法 化学方式:异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式:酶法
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? ?

基因组DNA-其它方法
? ? 根据核酸分离纯化方式的不同有: 吸附材料结合法:
硅质材料 高盐低pH值结合核酸,低盐高pH值洗脱

? ? ?

快捷高效。
阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸,高盐低pH值洗脱

适用于纯度要求高的实验。
磁珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目 的物,从而达到分离目的。
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基因组DNA-其它方法
? ? ? 浓盐法:
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同,将二者分离

有机溶剂抽提法:
有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用

密度梯度离心法:
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物

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基因组DNA片段的纯化
纯化的原则与要求

纯化的方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀 等。无论采用何种方法从何种支持介质中纯化 与回收所需要的DNA片段都要注意两个原则: 一是提高片段的回收率;
二要清除回收的DNA样品中的污染。

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1.回收率 为提高DNA片段的回收率,可 通过提高DNA样品的上样量和选择适宜 的方法与材料而实现。 2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂 抽提法与商品化的柱层析法(column chromatography)。 柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理

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从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有

二乙基氨基乙基(diethyl aminoethyl,DEAE) -纤维素(cellulose)膜插片电泳法
电泳洗脱法(透析袋及非透析袋电泳洗脱法) 冷冻挤压法 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。
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从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段
从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎 与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切 出,用吸头或接种针将其压碎,然后以洗脱缓冲 液浸泡,使DNA洗脱出来。 该方法能很好地回收小于1 kb的ss或ds-DNA,依 分子量不同,其回收率从小于30%至大于90%不等。 回收的DNA纯度极高,无酶抑制剂,也无对转染 细胞或微注射细胞有毒的污染物,虽费时但操作 简单,是小片段DNA回收的较好方法。
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质 粒 的 提 取 与 纯 化

DNA
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质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括: 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等

这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的 释放、质粒DNA的分离纯化三个步骤组成

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1、碱裂解法

在NaOH提供的高pH(12.0~12.6)条件下,用强 阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁,裂解细胞,与 NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生 变性,释放出质粒DNA。

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质粒DNA-碱裂解法
? 碱裂解法原理
? 染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状分 子,而质粒DNA为共价闭合环状分子; ? 当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象; ? 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中,从而可通过离心将两者分开。
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尽管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对,但CCC 质粒DNA因缠绕紧密而不易解链,只要不在碱 性条件下变性太久,当pH调至中性时,CCC质 粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。

该法操作简单、重复性好且成本低,制备的 质粒纯度能满足DNA测序与PCR等实验要求, 是使用最广泛的方法

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质粒DNA-碱裂解法
? 碱裂解法流程图
对数期菌体 上清液 沉淀

溶液I充分重悬

抽提

干燥溶解

溶液II裂解

酒精沉淀

质粒DNA溶液

溶液III中和

离心洗涤
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2、SDS裂解法
? SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中, 用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁,去壁细菌 再用SDS裂解,从而温和地释放质粒DNA到等渗 液中,然后用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀、洗涤质 粒DNA ? 由于条件温和,该法特别适用于大质粒DNA (>15kb)的提取。但有一部分质粒DNA会与细 胞碎片缠绕在一起而丢失,故产率不高。

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3、煮沸裂解法
煮沸裂解法是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌 酶的缓冲液中,Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁 后,沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配 对,并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性,但 CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后, CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去 除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清中的 质粒DNA。

该法条件剧烈,只能用于小质粒DNA的制备
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质粒DNA的纯化
? 1、CsCl-EB法 利用CsCl形成的连续密度梯度,在过量EB存 在的条件下,各种不同密度的物质经离心平 衡后得以分开。 ? 2、聚乙二醇沉淀法 (一种分级沉淀法) ? 3、柱层析法 (树脂)

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真核细胞RNA的分离纯化
? RNA极易被RNase水解,除胞内的RNase外,它还 广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境 中;RNase分子结构中二硫键的存在使其生物学 活性非常稳定,加热煮沸及一般的变性剂均不能 使其完全灭活,而且去除变性剂(denaturant) 后,RNase的活性又可恢复。 ? 因此,在RNA的制备过程中,排除RNase的污染及 强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键

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为获得完整的RNA分子,必须在总RNA提取分离的最 初阶段,尽可能地灭活胞内RNase的活性。 ? 选择性地使用RNase的变性剂(如酚、氯仿及强烈 的胍类变性剂)。 ? 蛋白酶K和能与蛋白质结合的阴离子去污剂如SDS、 十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠,并联合使用 RNase的特异抑制剂(如RNasin与DEPC等)能极大 地防止内源性RNase对RNA的降解。 ? 此外,在变性液中加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇 (DTT)等还原剂可以还原RNase中的二硫键,有利 于RNase的变性、水解与灭活。
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酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 分离总RNA ? 由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以 含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯 基乙醇的变性溶液裂解细胞,然后在pH4.0的酸 性条件下,用酚/氯仿抽提裂解溶液,最后通过 异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。 。 ? 本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA 质量高等优点,能在3小时内迅速处理多个标本

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mRNA的分离纯化
? 与序列明确的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不同, 真核生物的mRNA在细胞中含量少,种类多且分 子量大小不一。除血红蛋白及组蛋白的mRNA外, 绝大多数mRNA在其3?末端带有长短不同的poly (A)尾巴。 ? 依据mRNA的结构特征,利用碱基配对原则,通 过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝 胶的亲和层析,可以很容易地从总RNA制品中 分离纯化mRNA。
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1、oligo(dT)-纤维素柱层析法 2、oligo(dT)-纤维素柱离心法 3、oligo(dT)-纤维素液相结合离心法 4、磁性球珠分离法 该法联合利用了oligo(dT)与poly(A)的 互补配对、生物素(biotin)与链亲和素 (streptavidin)的结合特异性以及磁性分 离原理,可对poly(A)+RNA进行高效、灵 敏及快捷的分离。

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总RNA中的poly(A) +RNA分子 5?m7G AAAAAAAAAAAA3 ?

生物素标记的oligo(dT)

+

3?TTTTTTTTTTTT-Biotin5? 退火形成杂交体 链亲和素标记的磁珠

5?m7G

AAAAAAAAAAAA3 ?

3?TTTTTTTTTTTT-Biotin5?

+

Streptavidin- 磁

生物素与链亲和素的特异性结合 5?m7G
AAAAAAAAAAAA3 ?

3?TTTTTTTTTTTT-Biotin5? Streptavidin- 磁 磁性分离 5?m7G
AAAAAAAAAAAA3 ?

3?TTTTTTTTTTTT-Biotin5? Streptavidin- 磁 洗涤与洗脱

磁铁

5?m7G

水相(含纯化的mRNA) AAAAAAAAAAAA3 ?

固相 3?TTTTTTTTTTTT-Biotin5? Streptavidin- 磁

磁铁

图 3-2 磁珠分离法纯化poly(A) +RNA的原理
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5、其它方法
Poly(U)-凝胶层析法: 利用 Poly(U)与 Poly(A)的互补配对原理

Poly(U)-滤纸法: 将总RNA加到共价交联有 Poly(U)的滤纸上,经洗涤后加热洗脱

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核酸分离、纯化
? 蛋白质的去除:
? 酚/氯仿抽提 ? 使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等) ? 高盐洗涤 ? 蛋白酶处理

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核酸分离、纯化
? 多糖的去除:
? 高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl,高盐可溶解多糖。

? 用多糖水解酶将多糖降解。
? 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可 以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 。 ? 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500μ L DNA液中加入 200μ l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ,冰浴20min。
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核酸分离、纯化
? 多酚的去除:
? 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β -巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等

? 加入易与酚类结合的试剂:如PVP、PEG(聚乙二醇),它 们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合

? 盐离子的去除:
? 70%的乙醇洗涤
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DNA提取常见问题
?问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。 原 因
1.

DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质 DNA在溶解前,有酒 精残留,酒精抑制 后续酶解反应

1.

2.

对 策

重新纯化DNA,去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质(具体方法见前)
重新沉淀DNA,让酒精 充分挥发 增加70%乙醇洗涤的 次数(2-3次)

2.

3.

DNA中残留有金属离 子

3.

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DNA提取常见问题
?问题二:DNA降解。 原 因
1.
1.

2.

3.

4. 5.

材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈,DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融

2.

3.

对 策

4. 5.

6.

尽量取新鲜材料,低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时,可增加裂解液中螯合剂 的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制,耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中,避免 反复冻融

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DNA提取常见问题
?问题三:DNA提取量少。
尽量选用新鲜(幼嫩)的材 料 2. 动植物要匀浆研磨充分;G+ 菌、酵母裂解前先用生物酶 实验材料不佳或量少 或机械方式破壁 破壁或裂解不充分 3. 高温裂解时,时间适当延长 对 (对于动物细胞、细菌可增 策 沉淀不完全 加PK的用量) 洗涤时DNA丢失 4. 低温沉淀,延长沉淀时间 5. 加辅助物,促进沉淀 6. 洗涤时,最好用枪头将洗涤 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 液吸出,勿倾倒
1.

原 因

1. 2. 3. 4.

三、蛋白质的分离与纯化

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? 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学组 成、结构及生物学功能、新蛋白质的发 现和疾病分子诊断的基础;分子克隆中, 下游的处理和分析鉴定,基因工程产品 的制备,也需要蛋白质的分离和纯化。

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? 蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯度 (purity)或比活(specific activity), 以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生 物学活性(比活常以活力单位数/毫克蛋白 质表示),即从蛋白混合物中设法去除不要 的杂蛋白和变性的靶蛋白,使靶蛋白的产量 达到最高值。

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蛋 白 质 分 离 纯 化 的 一 般 技 术 路 线

生物样本 蛋白质的释放 (粉碎组织、 裂解细胞) 离心 蛋白质粗提液 分离 盐析 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 超速离心 蛋白粗品

预处理

纯化

离子交换

凝胶过滤

亲和层析

制备HPLC

电泳 蛋白质纯品

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分离纯化的总体原则
一是保证靶蛋白结构的完整,防止降解和活性 蛋白质的变性; 二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求。 纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高,例如纯 化某种酶,理想的结果是比活力和总回收率均 高,但实际工作中二者不能兼得,通常在科研 上希望比活力尽可能高,而牺牲一些回收率, 在工业生产和分子诊断中则正相反。

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蛋白质分离纯化的条件

蛋白质是一类结构复杂、有生物活性的生物大分 子,离开天然的存在体系,其结构与活性变得极 不稳定,因此从生物材料中提纯各种靶蛋白均需

要特定的条件。应注意各种因素对靶蛋白的影响。

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1. 缓冲液 2. 盐、金属离子和螯合剂. 3. 还原剂 4. 去垢剂 5. 增溶剂 6. 蛋白酶抑制剂(pronase inhibitor) 7. 蛋白质的环境因素 ①表面效应的影响 ②温度的影响 ③储存

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蛋白质的分离纯化方法
? 蛋白质的分离纯化是依据其溶解性、分子质量 大小及形状、电离性质和生物学功能的差异而 进行的。分离纯化的方法可分类如下: ? ①以溶解度的差异为依据的方法:盐析、分配 层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶等; ? ②以分子大小及形状差异为依据的方法:差速 离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤层析 等;
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?③以电离性质差异为依据的方法:电泳、 离子交换层析等; ?④以生物学功能专一性为依据的方法:亲 和层析。

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盐析法:将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋 白质溶液,使蛋白质表面电荷被中和以及水化 膜被破坏,导致蛋白质沉淀。 等电点沉淀法:净电荷为零,分子之间的静电 排斥力最小,因而容易聚集形成沉淀。该法适 用于在等电点pH稳定的蛋白质。 有机溶剂沉淀法:甲醇、乙醇、丙酮等(保持 低温),破坏蛋白质的水化层,使蛋白质的溶 解度降低而沉淀。

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水化膜

+ + + + + + +
带正电荷的蛋白质 脱水作用

酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用 碱

碱 酸

- - - - - -- -
带负电荷的蛋白质

脱水作用 酸

+ + + + + + + +
带正电荷的蛋白质

- - - - - -- -
带负电荷的蛋白质

不稳定的蛋白质颗粒

溶液中蛋白质的聚沉
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超过滤——除小分子杂质,分离、浓缩蛋白质
加 压
蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板

超滤液
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凝胶过滤层析(gel filtration)
凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛, 是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种 方法。 凝胶色谱的机理是分子筛效应,在洗脱过程中, 大分子不能进入凝胶内部,而沿凝胶颗粒间的空 隙最先流出柱外;而小分子可以进入凝胶颗粒内 部的多孔网状结构,路径长、流速慢,以至最后 流出柱外。因此,混合样品如同“过筛”一样, 因分子大小的不同得以彼此分开。
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离子交换层析的原理

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密度梯度(区带)离心:常用蔗糖密度梯度

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电泳(elctrophoresis)
蛋白质在高于或低于其 pI的溶液中为带电的颗 粒,在电场中能向正极 或负极移动。这种通过 蛋白质在电场中泳动而 达到分离各种蛋白质的 技术, 称为电泳 (elctrophoresis) 。
电 泳

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几种重要的蛋白质电泳
每一个蛋白质分子都因为结 合了许多的SDS而带有大量 的负电荷,而蛋白质分子原 有的电荷则可以忽略。由于 所有的蛋白质颗粒都带有大 量的负电荷,而且它们的电 荷密度也大体相同,因此, E?q值接近一个常数。所以该 法主要利用了蛋白质分子量 大小不同而分离蛋白质。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE):常用于蛋白质分 子量的测定。
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等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF) 通过蛋白质等电点 的差异而分离蛋白 质的电泳方法。pH 梯度以两性电解质 ampholyte(脂肪 族多胺和多羧同系 物)在外电场作用 下自然形成。

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双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis

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常用的蛋白质分离纯化方法
方法 原理 优点 缺点

凝胶层析
离子交换层析 电泳法 盐析法

分子筛的排阻效应
各组份与离子交换剂 亲和力不同 等电点、分子量、电 荷的差异 破坏水化膜和中和表 面电荷 等电点、热变性、酸 碱变性等沉淀作用 脱水作用和降低介电 常数

分辨力高、不会引起 变性
分辨力高、处理量较 大 分辨力很高、可连续 制备 操作简便、成本低、 重复性好、对蛋白有 保护作用 选择性较强、方法简 便、种类较多 操作简便、分辨较强

凝胶介质昂贵、处理量有 限
需酸碱处理树脂、操作耗 时 仪器试剂昂贵 分辨率差、纯化倍数低、 沉淀中混杂盐分 应用范围较窄 对蛋白质或酶有变性作用

选择性沉淀 有机溶剂沉淀

亲和层析
高速与超速离心 制备HPLC

蛋白质与配体之间特 殊的亲和力
沉降系数或密度差异

分辨力很高
操作方便、容量大

局限性大
设备昂贵 仪器昂贵

凝胶过滤、离子交换、 分辩力很高、步骤少, 反向色谱等

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蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物 形式存在,每种类型的细胞都含有成千上 万种不同的蛋白质,蛋白质的分离纯化往 往要采取多种方法联合使用,并通过预实 验进行条件优化,逐步地制备高纯度或高 比活的靶蛋白,实现蛋白质分离纯化的目 标

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蛋白质样品的纯度鉴定
? 蛋白质的纯度(purity)一般指是否含有其 它杂蛋白,而不包括盐、缓冲液离子、SDS等 小分子在内,一定条件下的相对均一性。目 前常用的鉴定纯度的方法有:有聚丙烯酰胺 凝胶电泳(PAGE)、SDS-PAGE、毛细管电泳 (CE)、等电聚焦电泳(IFE)及高效液相色 谱(HPLC)。此外,还有超速离心法、蛋白 质的化学组成和结构分析法。

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蛋白质的定量和分子量测定
? 蛋白质的定量,通常是指测定溶液中的蛋白 质浓度。测定蛋白质总量的方法很多,最早 的经典方法是凯氏定氮法,此法虽有普遍性, 但操作繁琐,目前极少使用。 ? 应用较为广泛的方法是双缩脲法、福林-酚 法和紫外吸收法。

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? 测定蛋白质混合物中某一特定靶蛋白的含量 通常要用具有高度特异性的生物学方法。活 性的测定和总蛋白量的测定配合起来可以用 来表示分离纯化过程中某一特定靶蛋白的纯 化程度。纯化程度常用这一特定成分的含量 (一般用活力单位)与总蛋白量(质量单位) 之比来表示。

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? 确定了蛋白质的均一性后,蛋白质的定性 以及一级结构的研究,都需要测定蛋白质 的分子质量以及亚基和寡聚体的分子质量。 测定蛋白质分子质量的方法很多,这此方 法都是根据蛋白质的理化性质来测定分子 量的,由此测得的分子量称为物理分子质 量。与物理分子量相对应的是化学分子量, 化学分子量是从化学分析所得的结果,计 算而得到的最小分子质量。

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四、生物小分子的提取纯化

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常用提取方法 1、溶剂提取法

2、水蒸气蒸馏法
3、升华法 4、超临界流体萃取法 5、超声提取法 6、固相萃取法

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分离精制的原理主要是根据:
1)物质溶解度差别;

2)物质在两相溶剂中的分配比不同;
3)物质的吸附性差别;

4)物质分子大小差异等进行分离

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常用纯化方法
1、逆流分配法(CCD) 2、液滴逆流色谱法(DCCC) 3、高速逆流色谱法(HSCCC) 4、气液分配色谱(GC或GLC) 5、液-液分配色谱 6、凝胶过滤法 7、超滤法 8、硅胶吸附色谱 9、氧化铝吸附色谱 10、大孔吸附树脂吸附色谱 等
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