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糖基化工程1


糖基化工程
糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。糖 基化工程是通过对蛋白质表面的糖链进行改造,对 蛋白质的结构和功能有重要影响,从而改良蛋白质 性质的一种技术。

当基因工程和蛋白质工程药物的生产正如火如荼时,人
们惊奇地发现,很多糖蛋白药物在不同细胞中表达所得的产物, 其免疫原性、半衰期、生物活性等各不相同,原因就是糖基化 的不同。如

何使表达产物进行合适的糖基化这一问题的提出, 促使了糖基化工程(glycosylation engineering)这一新领 域的产生。糖基化工程的研究,主要集中于糖蛋白糖链功能的 分析和糖基化表达体系的构建。如科学家将昆虫细胞改造后,

可表达正确的糖链;日本Kirin公司则准备改造酵母。可以预
见,糖基化工程研究在理论上可阐明糖链的功能,在实践上则 可为解决基因工程药物的免疫原性、生物活性及药物设计等问 题提供指导。

1、蛋白质的糖基化
糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。根据糖链和肤

链的连接方式的不同,蛋白质的糖基化可分为N糖基化和O糖
基化。 N-糖基化是通过糖链的还原端的N乙酰氨基葡萄糖(GLcNAc)和肤链中某些Asn侧链酰胺基上的氮原子相连。能接有 糖链的Asn必须处于Asn-X Ser/Thr 3残基构成的基序中,其

中X可为除Pro的任意的氨基酸残基。

O糖基化的结构比N-糖基化简单,一般糖链较短,但是

种类比N糖基化多得多。糖链中可以糖基化的主要是Ser和
Thr,此外还有酪氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸,连接的位点 是这些残基侧链上的羟基氧原子。

1.1 N-糖链通常都有一个五糖核心

根据它们的外层链结构的不同,可分为:高甘露糖型(High

mannose),杂合型(Hybrid type)与复合型(CoMplex type)。
三者之间的区别在于:高甘露糖型只含有多个α连接的甘露 糖残基,而复杂型具有以盐藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)和 唾液糖(SA)为组分的糖链天线,杂合型则兼由有两种特 点。

高甘露糖型

杂合型

复杂型

1.2 O-糖基化
研究比较少, 首先,没有特征修饰序列可做修饰位点预测;o-糖基 化的糖链结构比较复杂,至少存在4核心结构。尚未发

现可以将0一糖链整体从肽链上游离的内切酶肤上游离
需要采用其他的化学手段使o-糖链从多肽上游离。

1.3 糖的不均一性
Macroheterogeneity, also termed as "variable site occupancy", refers to
variability in the location and number of oligosaccharide attachments. On theother hand, microheterogeneity, also termed

"sitemicroheterogeneity",refers to the variability in the
oligosaccharide structures at specificglycosylation sites. Macro- and microheterogeneity in glycosylation result in a set of glycoforms for one specific glycoprotein, all of them have an identical amino acid backbone but are dissimilar in the structure and/or the disposition of their carbohydrate units. This heterogeneity leads to different physical, biochemical and biopharmaceutical properties and, therefore, also functional diversity.

CHO细胞表达细胞粘附分子

1.3 糖基的合成

糖蛋白到达Golgi体后,那些最终成为复合性结构的寡糖,
通过N-已酰葡萄糖胺转移酶I添加N-已酰葡萄糖胺残基,由 Golgi体内的α-甘露糖酶II切除两个甘露糖残基,随后由 GlcNAc转移酶加入天线上的GlcNAc残基。同时,Fuc转运酶可能 转运一个Fuc到糖链的GlcNAc上。复合型寡糖的合成最后步骤发

生在Golgi体的反面囊腔中。此时Gal或SA转运酶催化添加Gal和
SA。最后新合成的糖蛋白离开Golgi体,运送到最终目的地。 最终的寡糖结构在很大程度上取决于糖蛋白在处理过程中与糖 基化酶和糖基化转运酶的作用顺序,以及它们特异性作用,许 多不同的酶催化不同的反应,最后形成最终的寡糖结构。

为了探讨寡糖合成加工过程中的控制因素,人们作了大量的实验。

从不同种类、不同组织中产生的同一种蛋白,对其寡糖分析有很
大的差异。在上述讨论中,特定的N-连接寡糖的合成取决于各种 糖基化酶的表达水平,在不同的细胞和组织中,这些酶的相对活 性的差异形成不同的寡糖结构。虽然大多数细胞都有能力将相同 蛋白连接的寡糖加工成很多不同的结构,如高甘露糖型、复合型

等。实际上,单个糖基化位点趋于有一个特征性的寡糖结构,而
且可与同一蛋白的其它位点的糖链相区别,其中一个原因是蛋白 质在细胞中定位。因此,留在NER上的糖蛋白,没有接触Golgi体 酶系,只有高甘露糖型。排出Golgi的糖蛋白由于其大小、构型 等方面的因素从而形成不同的糖链结构。

同样,与宿主相关的因素也影响寡糖的加工过程。Hsieh等
分析了Sindbis病毒在三种不同的宿主细胞中生长时,产生 的糖蛋白两个位点的寡糖结构。他们发现,一个位点只有复 合型糖链,与宿主无关,而另外一个位点在鸡胚成纤维细胞 中是高甘露糖型,在BHK细胞中为复合型,而在CHO细胞中二

者都有。Hsieh认为,在不同的宿主细胞中出现差异的原因
可能是由于细胞内加工酶的不同,或糖蛋白在细胞内转运的 时间不同,或是加工过程中能否有效接触造成的。

另外,细胞中的蛋白质,即使经历相同的糖基化机制和分泌
途径,也并非所有的潜在位点均可被糖基化,据估计有10% -30%的潜在糖基化位点不能糖基化。实验进一步表明,不 同类型N—糖链的分布也存在着糖基化位点的专一性。如鼠 脑Thy-l蛋白,其Asn23仅能为高甘露糖型糖链,Asn74可为

杂合型或复杂型糖链,而Asn98则能为任一种N-糖链。因此
生物体内的确存在某些因素控制着蛋白质的糖基化,包括: (1)蛋白质的氨基酸序列决定着潜在糖基化位点的分布和数 目。例如,EGF模体(motif)中恒定序列CGS/T常能被O-岩藻 糖基化。

(2)在糖蛋白的生物合成过程中,糖蛋白的折叠方式,即蛋白 质的三维空间结构,影响糖基转移酶与蛋白表面特定序列的 接触,从而引起糖链的延伸和添加糖基的不同。 (3)合成糖蛋白细胞中糖基转移酶及相关酶类的表达类型。 (4)细胞中不同糖链加工区域的排列,以及糖链通过这些区域 的速率。 因此,糖链加工的控制过程是非常复杂的,而不是简单 的某一方面所能决定的。

2. 糖链的生物学功能
糖蛋白中的蛋白质是其生理功能的主要承担者,而糖链则对蛋

白质的功能起修饰作用。这种修饰作用极其多样化,斯坦利(P.
Stanley)指出,这种作用有两大类:分子内作用,如蛋白质的 正确折叠、细胞内定位、生物活性、溶解度、抗原性、生物半 寿期、蛋白酶敏感性等;分子间作用,如趋靶于溶酶体、趋靶 于组织、细胞-细胞黏附和结合病原体等。归根结底,是糖影

响着蛋白质的整体构象,从而影响由构象决定的所有功能。

3、糖基化对治疗蛋白性质的影响
治疗蛋白革命性地改变了很多疾病的治疗结果,但体内 活性低和快速的消除限制了其使用。糖工程是最近采用的 一项新技术,通过改变与蛋白相连的糖类来改变蛋白质的 药代动力学性质。这一技术己运用于促红细胞生成素,研

制出一种促红细胞生成素高糖基化类似物DA
( darbepoetinalfa ),它含有2个附加的N一连接糖类。在 血清中的半衰期增加了3倍,与重组人红细胞生成素比较, 体内活性增加,提高了蛋白质的稳定性、可溶性,并且减 少了免疫原性。

3.1 物理性质
稳定性是治疗蛋白最重要的性质,而糖基化在维持蛋
白分子完蔡性上起着重要的作用。糖可以降低蛋白质对蛋 白水解作用的敏感性。例如纤连蛋白在去糖后对蛋白水解 作用更加敏感;糖基化的β-干扰素与未糖基化的形式相比, 对热变性的敏感性降低;糖也可使暴露于热环境中的白细

胞介素一5(IL-5)的分子构象稳定。

糖对维持rhEPO的分子稳定性也起作用。去唾液酸的
rhEPO和完全去糖基化的rhEPO在体外经热处理生物学活性丢 失很多,分别只有原来活性的35%和11%,而糖基化的rhEPO 活性没有损失。未糖基化的rhEPO在盐酸胍、加热和pH变化 时更容易聚集和沉淀而变性。然而,糖基化的rhEPO却表现

为可逆性的折叠并且仍然可溶。糖基化还被发现可以保护
rhEPO中的免受氧自由基的损伤。

唾液酸含有的糖类是高度亲水的结构,所以通过遮蔽

疏水性残基而提高了蛋白质的溶解性。它们也可能影响蛋
白质的粘附性。例如粘蛋白是高度O一连接糖基化的,因为 它们有很高的唾液酸含量而呈现凝胶样的性质。当5个加成 的N一连接糖基化位点通过糖工程加到天然的瘦素序列中时, 产生的糖基化瘦素的溶解性是天然瘦素的15倍。

3.2生物学活性
EPO的糖基化类似物的实验直接证实了糖链的数目和体内 活性间的相关性。虽然糖链的连接位置也影响活性,糖链的数

目却起着更加重要的作用。就胞内的信号而言,rhEPO和DA的
反应动力学和反应量相当,说明加成的糖并没有钝化生物学效 应。与rhEPO相比,DA有着相似的构象和稳定性。然而由于有 过量的唾液酸,它的血浆半衰期显著延长,因 而体内活性大大增强。在小鼠中每周3次的剂量情况下需要3倍

甚至更多的rhEPO才能产生与DA相似的促红细胞生成的效果。

当药物每周仅注射一次的时候这种差别扩大到了13倍。而
单次注射时,需要30-40倍的rhEPO才能产生与低剂量DA相当 的活性。因此,DA对rhEPO的相对活性随着注射周期的延长而 增加。这表明延长的血浆半衰期产生了更长的体内效应。

3.3血浆半衰期和洁除 糖基化和高糖基化蛋白在体内活性的增强是由 于血浆半衰期或者循环驻留时间的延长。DA存在的2

个加成糖链使其在大鼠和狗中的血浆半衰期与rhEPO
相比延长了3倍。在初始使用EPO的腹膜透析病人中,

DA的平均终末半衰期大约比rhEPO长3倍,AUC大约比
其大2倍,从而使洁除率降低60 % o皮下注射与静脉

注射相比,半衰期延长2倍。

糖基化的IL-3则聚集在细胞外基质中,慢慢释放到循环

中。由于血浆半衰期提高了2倍,单剂量注射的情况下,糖
基化IL-3刺激骨髓中组氨酸羧化酶的活性比非糖基化的IL-3 提高了30%一40 % 。糖基化IL-3的分布容积很高,因为糖基 化增强了它与细胞外基质的结合从而使它更易积聚在组织中。 然后糖基化IL-3再慢慢释放到循环中,这使得它的体内半衰

期延长了。

3.4免疫原性
治疗蛋白引发的抗体可以产生不利的后果,其中包括中和 作用所导致的药效丢失,比如IFN-a2β和IFNβ 。很少量病

例对rhEPO产生的抗体也能识别而中和内源性EPO导致抗体介 导的单纯红细胞再生障碍(PRCA)。虽然这样的病例在1998年 之前极少,全世界只有3例报道,到2003年,全世界接受 rhEPO治疗的病人中有超过160名病人被诊断为PRCA抗体阳性,

大多数这样的病例都发生在美国以外。因为在1998年以前,
成百万的人己经接受了rhEPO的治疗,这种发病的增多被假定 是制造过程或配方的改变所导致。

其他研究也得出类似的结果说明,糖链可以遮蔽改变的

多肽序列使其逃避免疫监视。还有研究证实糖基化可以降
低病毒的免疫原性。这些都可以说明,高糖基化的治疗蛋 白同非糖基化的蛋白相比免疫原性可以降低。

4、糖基化在不同异源蛋白表达系统中的差异

4.1细菌
此表达系统中最为常用的是大肠杆菌和枯草杆菌由于易操 作,获得量高,且基因背景、表达特性均很了解等因素,使 得细菌表达系统成为最受欢迎的异源蛋白表达系统之一。虽 然,最近发现如奈氏脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis) 等菌株中内源蛋白表面也有O-糖基化现象(结构不同于真核生 物),但是常用的细菌表达株均无糖基化能力。另外,已出现

将几种关键性的糖基转移酶克隆进大肠杆菌中共表达,重新
构建重组糖蛋白表面糖链结构的报道。此方面的研究工作有 希望产生新型的重组糖蛋白异源表达体系。

4.2丝状真菌

大多数此类表达系统主要用于生产丝状真菌本身的内源性
蛋白,如某些工业用途或可食用的酶类。虽然丝状真菌中许多 蛋白质也能够糖基化,如丝状真菌分泌蛋白表面O-糖链大多连 接一个Man,但是这一方面研究报道并不多。另外,由于其较 低的转化效率,基因背景了解不充分,以及细胞外大量分泌蛋 白酶的存在,使得异源蛋白的表达较为困难。

4.3酵母 用酵母表达和分泌外源蛋白,一个主要难点是其N型和O

型糖基化作用机制不同于高等真核细胞。例如,酵母表达的
人甲状旁腺素尽管有全部的生物活性,但其糖链修饰是酵母 中特有的O-甘露糖基化方式。又如,人尿激酶-纤溶酶原激 活物中EGF样结构域,在天然产物和哺乳动物细胞中表达为 特殊的O-岩藻糖基化,而在啤酒酵母中表达无此现象。此外,

酵母表达系统还可在蛋白糖链上添加α-l,3甘露糖基,井
因此抗原表位而在人体内引起强烈的免疫反应。

酵母表达系统对外源蛋白可能存在过度糖基化修饰方式,
以及缺乏复杂型糖链修饰,从而极大地影响了所表达糖蛋白 的生物学功能。为了改造酵母的糖基化形式,现阶段主要采 取二种措施:(1)位点专一性突变,减少潜在的糖基化位点; (2)利用酵母的突变株,如外周糖链生物合成缺陷型和α-l, 3甘露糖基转移菌缺陷型,产生类似哺乳动物的高甘露糖型糖 链。例如,过度甘露糖基化是绝大多数酵母菌株共有的特征。

而一个甘露糖合成途径的双突变株,可表达非免疫原性、非
过度糖基化的重组蛋白。然而,由于此类突变体生长缓慢, 目前还不适于大规模工业化生产,故改造和发展这些菌株是 今后的研究方向。

4.4转基因植物 利用外源基因导入植物表达系统,以植物作为“绿色工 厂”生产药用蛋白的前景是十分诱人的。目前大多选用烟草 和拟南芥菜作为植物表达系统的研究模型,而N—糖链又是植

物表达系统中研究较为详细的。
在植物中,序列子Asn-X-Ser/Thr中Asn,与哺乳动物一 样,是作为N-糖链接受体。但是,植物与哺乳动物在N-糖链的 组成和结构上是不同的。植物的N-糖链仅包括高甘露糖型和 复杂型,而无杂合型糖链。并且大多数植物的复杂型糖链仅含

有Man、Fuc和Xyl,其连接方式也不同于哺乳动物,而与无脊
椎动物十分相似。

如植物复杂型糖链包括α1→3Fuc,哺乳动物中主要为

αl→6Fuc;另外植物五糖核心结构上连→接了β1→2Xyl,
而哺乳动物中无Xyl糖基修饰方式。植物所表达的糖蛋白在 哺乳动物中有很高的免疫原性,可能与此二糖苷键结构有 关。此外,哺乳动物细胞中存在着α-2,6唾液酸转移酶, 而植物细胞无此酶,故其糖链结构上也无唾液酸成分。

为了能够达到实际应用目的,避免产生高免疫原性的复 杂型糖链结构,目前主要采取以下二种措施:(1)真核细胞中,

蛋白质C端若带有滞留信号H/KDEL,将截留在内质网腔内。
同样的,对植物中表达的重组蛋白进行改造(使之带有滞留信 号序列),能让其留在内质网中,避免进入高尔基体被植物系 统糖基化;(2)利用基因工程技术,使植物高尔基体中糖基转 移酶突变[knockout)或增添新酶,然后让糖蛋白最终贮存在

如液泡或非原质体中。

4.5哺乳动物细胞
哺乳动物细胞株表达的重组产物,可带有复杂的糖链结构, 和人源糖蛋白的糖链结构较为相似,故成为目前主要的异源糖

蛋白表达系统。然而.哺乳动物细胞株在糖基化的机制上,与
人类组织仍然有显著的差异。如,大多数哺乳动物细胞表达 α1,3半乳糖基转移酶;而人类、类人猿中该酶基因已失活。 故某些鼠源细胞株合成的末端α1,3-Gal糖链,在人体内可引 起免疫反应。又如,成人的糖蛋白上不含乙酰唾液酸(NeuGc),

而在人.鼠杂交瘤细胞中含量则很高。

在特定的条件下,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株和鼠类细

胞株重组能够产生一种寡聚糖抗体,这种寡聚糖抗体带有N羟乙酞基神经氨酸(NeuGc)残基或者。1-3一半乳糖二糖单 元,又称Gallili抗原(?)这些非人源性多糖能够在患者 体内产生免疫原性反应。

此外,那些发生异常糖基化批次的产品可能产生非标准
化的治疗效果。全球第二大生物科技公司Genentech公司的 科研人员发现:抗肿瘤药物赫赛汀(Herceptin}的海藻糖基化 糖型比其非海藻糖基化糖型的FcyRl调节的抗体依赖型细胞 的细胞毒性减小40%到50%。采用ICH一生物技术产品标准规

格以确保每批产品都发生连续的人类糖基化反应,这样可以
大大降低生物技术产品的安全性隐患和疗效隐患。

凝集素

凝集素是动物细胞和植物细胞都能够合成和分泌的、
能与糖结 合的蛋白质,在细胞识别和粘着反应中起重要 作用,主要是促进细胞间的粘着。凝集素具有一个以上 同糖结合的位点,因此能够参与细胞的识别和粘着,将 不同的细胞联系起来。凝集素具有多方面的特性,在此

我们仅简要提及其与免疫细胞化学技术方法应用有关的
某些特性。我们知道,生物膜中含有一定量的糖类,主 要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素最大的特点在于 它们能识别糖蛋白和糖肽中,特别是细胞膜中复杂的碳 水化合物结构,即细胞膜表面的碳脂化合物决定簇。

一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力,

如刀豆素与α—D—吡喃糖基甘露糖(α—D—
Mannopyranosy)结合;麦芽素与N—乙酰糖胺(N— acetyl glucosamine)结合;菜豆凝集素与N—乙酰乳糖 胺结合(见本章 表6—1)。 因此,凝集素可以作为一 种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面,凝集素具 有多价结合能力,能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁 蛋白等示踪物结合,从而在光镜与/或电镜水平显示其结

合部位。


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