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血凝、血凝抑制试验


红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI) 红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
一、实验用设备: 实验用设备:
1、离心机 1 台*(3000 转 离心红细胞) 2、冰箱 1 台*(存放抗原) 3、振荡器 1 台*(振荡 96 孔 V 型板) 4、抗原 新城疫(ND)、减蛋(EDS)、流感(AI)抗原,从正规厂家进。 5、96 孔 V

型板 稀释血清 清洗后可重复使用 6、八道移液器 1 把(5-50 微升 稀释血清) 7、吸头 和八道移液器配套使用,清洗后重复使用) 8、积液槽 配制 4 个单位抗原及盛放生理盐水加样用 9、一次性采血管 采血用 10、2 毫升注射器 采血用 11、红细胞 非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可,但需离心 5 次后使用。 12、柠檬酸三钠 配制 3.8%抗凝剂用 13、重铬酸钾 配制清洁液用 14、硫酸 配制清洁液用 15、吸管 1 毫升、10 毫升 16、吸耳球 和吸管配套使用 17、针头 9*13(采雏鸡)、9*25(采大鸡) 18、蒸馏水 当地买。清洗 96 孔 V 型板、吸头用 19、10 毫升离心管 离心红细胞用 (塑料制) 20、生理盐水 做血清稀释液用、配制 4 单位抗原

二、实验前的准备: 实验前的准备:
1.抗原:从指定厂家购买稳定浓缩抗原。 2.抗凝剂的配制:用天平称量 3.8 克柠檬酸三钠,溶入 100ml 生理盐水中,待溶解完全后即 可使用。 3.1%红细胞悬液:由鸡心脏或翅静脉采血,放入加有抗凝剂的离心管内(按抗凝剂:全血 =1:2 的比例),迅速混匀。在离心机中以 3000 转/分离心 5 分钟,用吸管吸去上清液和 红细胞上层的白细胞薄膜, 将沉淀的红细胞加生理盐水, 慢慢混合均匀, 再在离心机中 3000 转/分离心 5 分钟,弃去上清液,再加生理盐水混匀,如此反复离心 4~5 次,最后一次离心 后的红细胞,弃去上清液,即为红细胞泥。放入 4℃冰箱中可保存 2—3 天。使用时用 1ml 吸管吸取 0.1ml 红细胞泥,然后加入 9.9ml 的生理盐水,此即 1%红细胞悬液。现用现配。 4.被检血清:每只鸡心脏或翼下采血 0.5-1ml,静置或离心,待血清析出后备用。 5.吸管清洁液的配制:使用 1%的稀硫酸溶液。水 10 公斤,硫酸 100 毫升,将硫酸慢慢倒入 水中,不断搅拌,操作时必须戴手套,口罩。 6.96 孔 V 型板和微量滴头清洁液的配制:重铬酸钾 79 克,水 1000ml,硫酸 100ml,将重铬 酸钾磨碎,溶解于水中,然后慢慢加入硫酸 100ml,不断搅拌,切不可将重铬酸钾水溶液倒 入硫酸中,以防爆炸,操作时必须戴手套,口罩。 7.血清稀释液:为灭菌的生理盐水。

三、实验过程: 实验过程:
原理:某些病毒(如新城疫、减蛋、流感)能够与鸡红细胞发生凝集,此即为红细胞凝集现

象。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制,即红细胞凝集抑制试验(HI)。 应用:1、检测血清中的抗体水平,确定免疫时机。2、免疫后及时监测,确认免疫效果。3、 辅助诊断病毒性疾病。 包括血凝(HA)试验、抗原校正和血凝抑制(HI)试验三步: (一)血凝(HA)试验:采用 96 孔 V 型反应板,测定抗原效价 1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水 25 微升。 2、用微量移液器吸取待测抗原 25 微升于第一孔中并挤压 6 次混合,后吸出 25 微升至第 2 孔,依次倍比稀释到第 11 孔,弃去 25 微升。 3、微量移液器再吸取 1%红细胞悬液依次加入各孔,每孔 25 微升。 4、置于微量振荡器上振荡 1 分钟。 5、室温静置 30 分钟后观察结果。 6、结果观察:将反应板倾斜成 45 度角,沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为 沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底的红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层, 倾斜后红细胞不流动, 说明红细胞被病毒所凝集。 能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释 倍数,称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩图 1 所示 第 8 孔红细胞为完全凝集,说明该抗原效价为 1:256。

彩图 1:

图 1 抗原效价为 1:256

(二)4 单位抗原校正: 1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液:即 4 单位抗原。 例:上图 1:抗原效价为 1:256,HI 试验时,25 微升抗原稀释液内须含 4 个凝集单位,则 应将抗原作 256/4=64 倍稀释。即取 0.1 毫升抗原,加入 6.4 毫升生理盐水。 2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水 25 微升。第一孔不加。 3、用微量移液器吸取 4 单位抗原 25 微升分别加入第一孔、第二孔中,从第二孔开始挤压 6 次混合,后吸出 25 微升至第 3 孔,依次倍比稀释到第 5 孔,弃去 25 微升。 4、用微量移液器再吸取 1%红细胞悬液依次加入 1-6 孔,每孔 25 微升。 5、于微量振荡器上振荡 1 分钟。 6、室温静置 30 分钟后观察结果。 7、结果观察:第一、二、三孔为完全凝集,第四孔红细胞为 50%沉淀,第五孔为对照完全 沉淀,如果出现以上结果,表明所配 4 单位抗原准确,校正成立。如彩图 2 所示。

彩图 2:

图 2 前三孔为红细胞完全凝集,第四孔为红细胞 50%凝集,第五孔为红细胞完全沉淀,说 明该次抗原校正成立

(三)血凝抑制(HI)试验:每排孔检查 1 份血清。步骤如下: 1.用微量移液器先加 25 微升生理盐水于各孔中。 2.用微量移液器吸取待检血清 25 微升置于第 1 孔中,然后倍比稀释至第 11 孔,弃去 25 微 升。最后一孔不稀释,为红细胞对照。 3.用微量移液器吸取配制好的抗原,每孔 25 微升。 4.置于微量振荡器上振荡 1 分钟,混合均匀。 5.室温静置 20 分钟。 6.用微量移液器吸取 1%红细胞悬液于每孔各加 25 微升。 7.置于微量振荡器上振荡 1 分钟,混合均匀。 8.室温静置 40 分钟后观察结果。

四、结果判定: 结果判定:
1)判定结果:以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的 HI 滴度,以 2 的指数表 示。如彩图 2 所示:

彩图 2:

图 3 上图抗体结果从上至下依次为:8/7/8/9/8/7/7/6
2)判定标准: 1.新城疫抗体:育雏育成鸡在 7 以上,产蛋鸡在 9 以上。 2.H5 抗体:抗体值在 6 以上。 3.H9 抗体:抗体值在 7 以上。 注:低于以上标准,则需要进行免疫。 3)免疫后抗体规律

一般活疫苗免后 7-10 天产生抗体,2-3 周抗体到达峰值,可以维持 2 个月。灭活疫苗免后 10-15 天产生抗体,3-4 周抗体到达峰值,可以维持 3-4 个月。

五、实验后的用具处理: 实验后的用具处理:
1、96 孔 V 型反应板的清洗: 新反应板可直接放入清洁液中浸泡 24 小时,用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物,然 后泡在清洁液中,24 小时后捞出,甩掉清洁液,放入流水中冲洗干净后,在蒸馏水中冲洗 一遍,甩干,摆放在恒温箱中,烤干备用。属塑料制品,70℃以下烤干。 2、微量滴头的清洗: 新滴头直接放入清洗液中浸泡, 用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中, 最少 浸泡 24 小时,捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液,然后在蒸馏水中冲洗一遍,甩干, 放入恒温箱中烤干,备用。属塑料制品,70℃以下烤干。 3、吸管及积液槽的清洗: 将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中,24 小时后捞出,用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再 冲洗一遍,甩干,吸管放入高温干燥箱中 160℃干燥 1—2 小时后备用,玻璃制品可高温烤 干。积液槽放入恒温箱中烘干。


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