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反向PCR操作要点


操作中的注意事项及解释 1. 为提高分子间连接的效率,连接反应中 cDNA 的浓度要低,因为高浓度的 cDNA 可能会提高非同源连接水平,从而产生非特异扩增. 2. 成环的双链 cDNA 进行裂解和变性比较重要,因为环状双链 DNA 分子易于形 成超螺旋而不利于 PCR 反应,它只可以扩增出较短的 DNA 片段. 3. 现认为下列方法可在成环的 DNA 分子中引入切割: 3.1

最常用的简便办法是煮沸,但因为某些环状双链 DNA 分子不时形成不太普遍 的二级结构,使得该方法在使环状双链 DNA 分子变性和引入切刻时并不很奏效. 3.2 第二种办法是选用核酸内切酶进行消化,理想的限制位点应位于已知序列内, 但在多数情况下,由于 cDNA 未知已域内酶的限制图谱并不清楚,所以很难选择用 何种限制酶. 3.3 如果没有合适的限制性酶可用,也可以尝试使用 EDTA-寡核苷酸-介导的特异 裂解办法.T 处连有 EDTA-Fe 的寡核苷酸通过与双链 DNA 形成三股螺旋而特异 地结合于双链 DNA 某一区段,这样就可以在结合位点裂解双链 DNA. 4. 碱变性法已成功地用于制备 PCR 和测序用质粒 DNA,该方法也可以有效地使 环化的双链 cDNA 实现变性. 5. 加入 T4 RNA 连接酶或氯化六氨合高钴可以提高 T4 DNA 连接酶催化的双链 DNA 平齐末端连接的效率. 6. IPCR 法可以有效地用于快速扩增任何已知片段 cDNA 或基因组 DNA 两侧的 未知序列,它不需要构建或筛选 DNA 文库来获得未知序列信息.有些重组的噬菌 体或质粒在细菌内部不稳定,所以扩增后的文库可能会丢失这些部分,然而 PCR 法不存在这个问题. 详细资料 一,DNA 的酶切 已知序列和两侧未知序列的酶切图及环化的 DNA 大小是影响 IPCR 限制性内切 酶选择的关键.多数情况下,可以通过对已知序列的分析或用 DNA 印迹杂交法确 定限制性酶切位点和片段长度来决定选择哪种内切酶.为了获得已知序列上下游 的未知序列可用一种或多种在已知序列内没有切点的限制性内切酶消化样品 DNA,这时,如果产生的切段末端不互补,可以用 Klenow 或 T4 聚合酶填平末端后

再行连接.因为 PCR 扩增长度所限,所以要求酶切到的目的片段长度不得超过核 心区的 2-3kb. 选择好合适的内切酶后,用常规酶切法消化染色体,消化产生可直接用于下述连接 反应.但某些情况下,如已知序列拷贝数很高,而且预计扩增未知序列大小不明时, 应先将已知序列分离出来. 二,酶切片段的环化 用 1?g 的酶切 DNA 进行连接环化就可用于分析,环化前先用酚-氯仿抽提,乙醇沉 淀纯化酶切片段,晾干沉淀的 DNA 片段,用连接缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, pH7.4; 10mmol/L MgCl2; 10mmol/L DTT 和 1mmol/L ATP)溶解.浓度应小于 2?g/ml.然后 加入 T4 DNA 连接酶 0.02U/mL (Weiss 单位),15℃放置 16 小时. 另外,酶切片段也可以不用酚-氯仿法来灭活内切酶而用连接缓冲液稀释 5 倍以上 的方法进行,再加入连接酶进行环化反应,但这时,酶切体积要小. 三,PCR 向环化 DNA 混合液加入盐后用乙醇沉淀,并溶于 10?l 去离子水.环化 DNA 分子 在标准 PCR 应体系中可用与已知序列两侧互补的反向引物来扩增未知序列.环化 分子扩增时也可以不用酶切线性化,因为数个循环后就可以产生线性模板分子.用 于 IPCR 的引物也可在 5'端修饰后进行不同目的的扩增. 四,IPCR 的应用 最初 IPCR 法是用来快速扩增任何一个已知基因片段两侧未知序列,比较适于扩 增中度重复 DNA 序列.也可以用 YAC 载体的一个臂中的已知序列来扩增插入片 段的特异末端,得到的定向特异 DNA 片段可用作杂交探针来筛选 YAC 文库中的 重叠和紧邻克隆片段. 五,IPCR 技术的局限性 由于 IPCR 的侧翼序列未知,因此需选择合适的内切酶,但许多常用的内切酶在插 入序列上有切点而且在载体上不合适位置也有切点,因此给酶的选择带来许多困 难. 参考文献 Bruce A. White. et al. PCR CLONING PROTOCOLS, 289~294. 林万明,《 技术操作和应用指南》 年第一版,68~70. 林万明 《PCR 技术操作和应用指南》,1993 年第一版

原理 反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区段相连接的未知染色体序列,因此 又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心 DNA 区两 末端序列互补,但两引物 3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶 切样品 DNA,然后用 DNA 连接酶连接成一个环状 DNA 分子,通过反向 PCR 扩 增引物的上游片段和下游片段;现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线 状 DNA 片段的杂交探针,这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上 DNA 片段序列的识别十分重要。

反向 PCR 原理图 编辑本段不足之处 编辑本段 不足之处 该方法的不足是:①需要从许多酶中选择限制酶,或者说必须选择一 种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的 DNA 片段。这种选择不能在非酶 切位点切断靶 DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列,而 在 YAC 或 Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列,这样,通过反 向 PCR 得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。 编辑本段其他用途 编辑本段 其他用途 利用反向 PCR 可对未知序列扩增后进行分析,探索邻接已知 DNA 片段 的序列,并可将仅知部分序列的全长 cDNA 进行分子克隆,建立全长的 DNA 探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列 DNA 旁侧病毒整合位点分析 等研究。 用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解 DNA。 反向 PCR 所扩增的 片段的大小由 PCR 扩增片段的大小决定,目前,PCR 扩增的实际上限为 3-4kb。在许多情况下,首先 需要进行 Southern 杂交来确定内切酶用以产 生大小适于环化及反向 PCR 的片段的末端 片段。能裂解核心区的内切酶使 反向 PCR 只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游 或上游区,而不裂解

核心区的酶则使两上边侧序列都扩增,并带有由内切酶和环化类 型决定的 接点(例如,互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列,初试 时 最好靠近识别上个碱基位位的酶,并已知在核心区有其方便的裂解位 点。如果用反向 PCR 从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探 针,建议事先在载体中引入 合适的酶切位点。 用 T4 连接酶在稀 DNA 浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中,为 产生对反向 PCR 大小适当的 DNA 片段需要两种内切酶,但这样所产生的片 段末端则不适于连接,环 化前需用 Klenow 或噬菌体 T4DNA 聚合酶修理(钝 化)。连接前,需用酚或热变性使内切 酶失活。 聚合酶链反应条件与经典所用的相同, 例如, 94℃-30 秒变性, 58℃-30 秒引物退火, Taq 聚合酶 70℃延伸 3 分钟,进行 30 个循环。可改变 PCR 条件以生产特异产物。将反向 PCR 用于测序时,与核心区末端后部结合的 扩增引物更为有用,它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间 的接点更近,减少了扩增引物的干扰。


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