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灵芝多糖的分离纯化及结构鉴定


※分析检测

食品科学

2011, Vol. 32, No. 12

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灵芝多糖的分离纯化及结构鉴定
黄静涵 1 ,艾斯卡尔·艾拉提 2 ,毛 健 2 , *
(1.中国医学科学院阜外心血管病医院心血管病研究所,北京 2.江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江

苏 无锡 100037; 214122)

摘 要:运用 DEAE-Sephadex A25 离子色谱和 Sepharose CL-6B 凝胶色谱分离纯化得到一种灵芝多糖组分 GLPS1a。 高效液相凝胶渗透色谱法(high-performance gel-permeation chromatography,HPGPC)法测得其呈单一峰,重均分子 质量为 1.8 × 10 5D。GLPS1a 经单糖组成分析、红外、核磁共振等手段分析,结果表明单糖组成为阿拉伯糖、半 乳糖、葡萄糖和木聚糖,物质的量比率为 4:2:10:1。GLPS1a 具有一条以β→(1,3)位键合的吡喃葡萄糖主链,同时 存在β→(1,3)阿拉伯糖、β -D-(1,4)半乳糖、α -D-(1,2) 木糖和α -D-(1,6) 葡萄糖的分支残基。 关键词:灵芝多糖;分离;纯化;结构

  

Purification and Structural Identification of a Bioactive Polysaccharide Fraction from Ganoderma lucidum
HUANG Jing-han1,AISIKAER Ailati2,MAO Jian2,* (1. Fuwai Hospital and Cardiovascular Institute, Chinese Academy of Medicine Science, Beijing 100037, China;2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) Abstract :A novel Ganoderma lucidum polysaccharide GLPS1a was purified sequentially by column chromatographies on DEAE-Sephadex A25 and Sepharose CL-6B gel. GLPS1a was eluted as a single symmetrical narrow peak on high-performance gel-permeation chromatography (HPGPC) and the average molgcular weight was 1.8×105 D. Das chromatographic analysis of absolute acid hydrolysate of GLPS1a suggested that its monosaccharide composition was composed of arabinose, galactose, glucose and xylose with a molar ratio of 4:2:10:1. Fourier-transform infrared (FT-IR), 1H and 13C NMR spectroscopy analyses revealed that GLPS1a had a backbone consisting of β-D-(1,3)-linked-D-glucosepyranosy1 residues with glycosy1 residues composed of β→(1,3) linked arabinoser,β-D-(1,4)-galcose,α -D-(1,2)-xylose and (1→6) linked α -D-glucose residues. Key words: Ganoderma lucidum polysaccharide;separation;purification;structural 中图分类号:Q815 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2011)12-0301-04

多糖及其复合物具有多方面生物活性和功能,是一 类重要的生物反应调节剂 [1] 。真菌类生物可以大规模生 产多糖,而多糖结构复杂,具有合成困难、成本高、 收率低等原因[2-3] ,因此从食药用菌中提取多糖是其重要 来源之一。多糖结构是多糖生物活性和功能的基础,解 析出多糖结构有利于多糖的利用和开发。近现代分析技 术飞速发展,多学科和手段联合应用对于多糖结构解析 已经普遍实现 [5 -1 0] 。目前从灵芝及其发酵体系中分离到 数百种多糖,但由于原料、生产方式、发酵方法以及 提取方式不同,不同学者得到的灵芝多糖的结构也不尽 相同。本实验在前期灵芝多糖深层发酵和分离提取的研 究基础上[11-12] ,进一步纯化得到灵芝多糖组分 GLPS1a、 同时对该组分的基本结构进行研究,灵芝为深层发酵多

糖开发利用提供参考。 1 1.1 材料与方法

材料、试剂与仪器 灵芝多糖 实验室制备 [11];Sepharose CL-6B、 DEAE-Sephadex A-25 美国 Pharmacia 公司;Dextran T 系列 美国 Sigma 公司;苯酚、三氯乙酸、硫酸国药 集团化学试剂有限公司。 1.2 仪器与设备

BSZ-100 自动部分收集器、TH-1000 型梯度混合器 上海青浦沪西仪器厂;HL-2S 型恒流、HD-5 电脑紫外 检测仪 上海沪西分析仪器厂;722 光栅分光光度计 无 锡科达智能仪器厂;高效液相色谱仪 美国 Waters 公

收稿日期:2011-05-31 作者简介:黄静涵(1979 —),研究实习员,硕士,主要从事冠心病和心律失常研究。 E-mai:huangjinghan@sohu.com * 通信作者:毛健(1970 —),男,教授,博士,主要从事食品生物技术研究。E-mail:biomao@263.net

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1.3.4 红外光谱测定

※分析检测

司;微量分析天平 320 型酸度计

上海精密科学仪器有限公司;Delta美国

梅特勒 - 托利多仪器(上海)有限公司;

GLPS1a 用 KBr 压片,通过 Necolit 5D × B 型红外 光谱仪扫描,扫描范围 4000~400cm -1 ,次数 32 次,分 辨率 4 c m -1 。 1.3.5 核磁共振测定 GLPS1a 用 D 2 O 配成 30mg/mL 溶液,室温下通过 AVANCE Ⅲ型核磁共振仪测定。 2 2.1 结果与分析 灵芝多糖的分离纯化 灵芝粗多糖通过去除杂质、复溶,DEAE-Sephadex A-25 离子交换柱层析,蒸馏水、0.3、0.5mol/L NaCl 溶 液阶段洗脱,得到四个多糖组分 GLPS1、GLPS2、GLPS3 和 GLPS4(图 1)
1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 A490nm NaCl溶液浓度 1.2 1.0 0.8 0.6 GLPS2 GLPS3 0.4 GLPS4 0.2 60 80

NICOLET NEXUS 470 傅里叶变换红外光谱仪 磁共振谱仪 1.3 1.3.1 方法 灵芝多糖的分离纯化

Thermo Nicolet 公司;AVANCE III 400MHz 全数字化核 瑞士 Bruker 公司;Trace MS 气质联用仪 美国热电公司。

称取灵芝粗多糖样品 1.0g,溶于 10mL 磷酸缓冲液 中,上 DEAE-Sephadex A-25 柱,蒸馏水、0.3、0.5mol/L NaCl 溶液阶段洗脱,流速 1.5mL/min,每管收集 9mL, 苯酚 - 硫酸法隔管检测多糖含量。各组分浓缩透析除 盐、冷冻干燥,得灵芝多糖 GLPS1、GLPS2、GLPS3 和 GLPS4 四个组分(图 1),其中组分 GLPS1 多糖含量占 总糖的 75.6%,将 GLPS1 样品复溶,上 Sepharose CL6B 柱,0.1mol/L pH7.6 的 PBS 缓冲液洗脱,洗速 0.5 mL / mi n ,得两个主要峰,收集各主要峰组分,冷冻干 1.3.2 多糖分子质量的测定和纯度鉴定 采用高效液相凝胶渗透色谱法(high-performance gelpermeation chromatography,HPGPC)测定 GLPS1a 纯度 和分子质量。TSK 及 Ultrahydrogel linear(7.8 × 300mm) 双柱串联,W a t e r s - 2 4 1 0 型示差折光检测器,流动相 0.1mol/L 硝酸钠,流速 0.9mL/min,进样量 20μL,柱 温 45℃,记录色谱图。按照 HPLC 相同条件进样 7 种相 对分子质量为 6100、16500、26290、40000、84000、 158000 和 291000 的标准 Dextran,记录每样品保留时间 (T R ) ,以 T R 为横坐标,lg M 为纵坐标,绘制标准曲线。 相同条件下得样品 GLPS1a 的色谱图,根据峰型分布判 断样品纯度,并采用 Millennium 2010 软件分析 GLPS1a 保留时间和相对分子质量。 1.3.3 多糖含量及单糖组成分析 以葡萄糖为标准品,苯酚 - 硫酸法[13]测定 GLPS1a 中 多糖含量。单糖组成分析:( 1 ) 水解:将灵芝多糖样品 10h,BaCO 3 中和至 pH7.0,离心取上清液。 (2)衍生物 的制备:将上清液浓 缩至干,分别加入 1 0 m g 肌醇、 10mg 盐酸羟胺、0.5mL 吡啶,90℃水浴 30min,加入 乙酸酐 0.5mL,乙酰化 30min,反应结束取样。 (3)分析 检测:GLPS1a 进行气相分析,进样量 0.5μL;色谱条 件:OV1701 30m 柱,载气为 N 2,流速 1.5mL/min,氢 火焰检测器,气化室 2 6 0 ℃,检测 2 5 0 ℃,程序升温: 180℃(3min)→ 240℃(30min)。根据标准单糖与和 GLPS1a 保留时间,确定组成单糖种类,并根据标准单糖、 GLPS1a 中单糖及内标峰面积计算物质的量比。 GLPS1a 10mg 加入 1.0mol/L H2SO4 2mL,100℃封管水解 燥,得 GLPS1a 和 GLPS1b。

NaCl 溶液浓度 /(mol/L)

GLPS1

A490nm

20

40 收集管数

图1

灵芝多糖 DEAE-Sephadex A-25 层析柱洗脱曲线 GLPS1a on DEAE-Sephadex A-25

Fig.1 Anion-exchange elution curve showimg the separation of

由图 1 可以看出,各组分中多糖含量不同,其中 组分 GLPS1 含量最高,占总糖含量的 75.6%,GLPS2、 GLPS3 和 GLPS4 的多糖含量分别占总糖含量的 8.3%、 11.7% 和 4.4%。由于组分 GLPS1 的多糖含量最高,因 此将 GLPS1 继续纯化。GLPS1 经 Sepharose CL-6B 柱层 析结果见图 2 。
1.0 0.8 A490nm 0.6 0.4 0.2 0.0 0 图2 20 40 收集管数 GLPS1 经 Sepharose CL-6B 进一步纯化结果 CL-6B Fig.2 Further purification of GLPS1 by gel filtration on Sepharose 60 80 GLPS1b GLPS1a

从图 2 可以看出,GLPS1 经再次柱层析后得到两组 分 GLPS1a 与 GLPS1b,其中 GLPS1a 含量较大(82.24%),

※分析检测
因此将继续深入研究 GLPS1a 的化学结构。 2.2

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2.4 2.4.1

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GLPS1a 的红外光谱分析 糖类的官能团分析

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灵芝多糖组分 GLPS1a 的纯度鉴定及分子质量测定 HPGPC 结果显示 GLPS1a 峰型单一对称(图 3),说明

从样品 G L P S 1 a 的红外光谱图( 图 6 ) 中可看到, 3240cm-1 处的吸收峰是糖分子内或分子间氢键 O — H 伸 缩振动的结果,说明 G L P S 1 a 存在分子内和分子键氢 键;2937cm-1 与 1431cm-1 处的吸收峰分别是 C — H 的变 角振动和伸缩振动结果,以上吸收峰共同构成多糖特征 吸收峰。1077cm-1 是由 C — O — H 和是糖环的 C — O — C 的 C — O 伸缩振动形成。1733cm -1 附近为羧基特征吸 收峰,1652cm -1 处为— CHO 的 C=O 伸缩振动峰。

GLPS1a 为相对单一组分,应用 Millennium 软件分析得 出 GLPS1a 相对重均分子质量(M w)为 1.8 × 10 5D。
25 20 mV 15 10 5 0 5 10 15 时间 /min 图3 GLPS1a 的 HPGPC 色谱图 20 25 30

Fig.3 HPGPC chromatography of GLPS1a

2.3

GLPS1a 单糖组成分析 6 种单糖和 GLPS1a 水解产物气相色谱如图 4 和图 5

75 65 55 45 35 25 15 5 0 -5 4000

透过率 /%

3000

2000

1500

1000

500

波数 /cm-1 图6 GLPS1a 红外吸收光谱 Fig.6 FT-IR spectra of GLPS1a

所示,结果在 GLPS1a 水解产物 GC 图谱上可见到 4 个峰, 4 个峰的保留时间与单糖标准品阿拉伯糖、木糖、葡萄 糖、半乳糖的结果基本一致,说明 GLPS1a 主要由阿拉 伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖四种单糖组成,经计算, 4 个峰(4 种单糖)的物质的量比约为 4:2:10:1。
2.50 2.25 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 - 0.25 10.0
18.043% 15.700% 13.310% 12.030% 17.307% 10.514% 12.001%

2.4.2

糖的吡喃环的振动谱 糖的α - 和β - 端基差向异构体主要由端基的 C — H

变角振动引起。 α - 型的差向异构体 C — H 取平伏键, 在 850cm-1 处有一吸收峰;β - 型的差向异构体 C — H 取 直立键,在 8 9 0 c m - 1 处有一吸收峰。从图 6 可以看出, 灵芝多糖 GLPS1a 属于β - 端基差向异构体。 2.5
12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 μV/105

GLPS1a 1H 和 13C 核磁共振分析 为了获得更多的 GLPS1a 结构信息,深入了解其化

学结构,对其进行核磁共振分析。GLPS1a 的 13 C-NMR 图谱和 1 H-NMR 图谱见图 7 。 由图 7 可知,GLPS1a 的 13 C-NMR 的化学位移数据 显示,在 δ < 7 0 有 4 个碳信号,证明该多糖有 4 个重 复单位存在;在 δ96~110 区域之间的振动分别是由阿 拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖的异头碳原子引起的, 物质的量比率约为 4:2:10:1,与单糖组成分析结果一致。 在δ100 和δ104 分别分别有异头碳信号,证实α和β构 型存在。 δ GLPS1a 的 13C-NMR 谱在异头碳共振范围内( 98~ 110)内出现 7 个共振信号,说明该 GLPS1a 有 7 个残基(异 δ 头碳)组成。 98.7 与 78.4 分别是异头碳和连接碳位移, 说明 GLPS1a 中存在α -1,2- 糖苷键,由于 O 取代发生在 C2 位上,因而连接碳的共振信号向低磁场位移(δ70~75 →δ76~85);同时说明分子中有以α-1,2- 糖苷键连接的 侧链存在[14-15] 。 102.4 和δ 83.7 两处的共振信号说明灵 δ

时间 /min 1.鼠李糖,2.阿拉伯糖,3.木糖,4.甘露糖,5.葡萄糖,6.半乳糖,7.肌醇。 图4 单糖标样糖腈乙酰化气相色谱图 monosaccharide standards
59.114%

Fig.4 Gas chromatographic patterns of acetylated aldononitriles of six

6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 10.0 12.5

μV/104

22.503% 11.780% 1 2 3

5.614%

4

15.0 17.5

20.0

22.5

25.0

时间 /min 1 . 阿拉伯糖,2 . 木糖,3 . 葡萄糖,4 . 半乳糖。 图5 GLPS1a 单糖腈乙酰化气相色谱图 GLPS1a Fig.5 Gas chromatographic patterns of acetylated aldononitriles of

δ 芝多糖分子中存在α-1,4- 糖苷键相连接的侧链; 104.3

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和 86.7 的共振信号进一步肯定了 GLPS1a 存在β -1,3- 糖苷 键,根据前述红外结果综合判断, -1,3- 糖苷键构成了 β GLPS1a 的主链结构。 105.4 和 71.8 两处的共振信号说 δ 明多糖分子中存在 β - 1 , 6 - 糖苷键相连的侧链;通过分 析,GLPS1a 中存在β-D- 阿拉伯糖的结构可以用δ107.1 的共振信号证实; 1 1 0 . 4 和 8 0 . 5 两处的共振信号说明 δ GLPS1a 中存在β-D- 半乳糖的侧链结构; 94.5 和 71.1 是 δ

HPGPC 法测得其呈单一峰,分子质量为 1.8 × 105D。通 过单糖组成分析、红外、核磁共振等手段分析 GLPS1a 的糖链结构,结果表明 G L P S 1 a 的单糖组成为阿拉伯 糖、半乳糖、葡萄糖和木聚糖,物质的量比率为 4 : 2 : 10:1。GLPS1a 具有一条以β→(1,3)位键合的吡喃葡萄糖 主链,同时存在β→(1,3)阿拉伯糖、 -D-(1,4)半乳糖、 β α-D-(1,2) 木糖和α-D-(1,6) 葡萄糖的分支残基。该灵芝 多糖组分结构未见文献报道,为一种新的灵芝多糖。
参考文献:
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α-D- 木糖的 C1 和链接碳的化学位移。参考文献[16-17] 可以将 1 H 谱的δ4.9~5.8 异构区域与具有己糖重复单位
的 GLPS1a 特征峰归属。

A

[2]

100 90 80 70 60 50 40 30 20

δ
B

256.45

1.00

44.08

3.91

13.48

[7]

MATHLOUTHI M, KOENIG J L. Vibrational spectra of carbohydrates [J]. Advances in Carbohydrate Chemistry & Biochemistry, 1986, 44: 77-89.

δ
图 7 GLPS1a 的 13C-NMR 图谱(A)和 1H-NMR 图谱(B) Fig.7
13

[8]

KOGAN G, ALFLOLDI J, MASLER L. 13C-NMR spectroscopic investigation of two yeast cell wall β-D-glucans[J]. Biopolymers, 1988, 27 (7): 1055-1063.

C-NMR (A) and H-NMR (B) spectrum of GLPS1a [9]

1

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GLPS1a 通过一系列结构分析表明,GLPS1a 分子质 量为 1.8 × 10 5 D,其单糖组成主要有 Ara、Xyl、Glc 和 Gal,其物质的量比率为 4:2:10:1,具有一条以β→(1,3) 位键合的吡喃葡萄糖主链。综合分析推断 GLPS1a 的结 构重复单元见图 8 。
α-D-Xylp
↓(1 → 2) ↑(1 → 4) [10] [11] [12]

朱淮武. 有机分子结构波谱解析[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005. 毛健, 马海乐. 应用膜过滤提取灵芝多糖的研究[J]. 食品科学, 2010, 31(4): 123-126. 毛健, 马海乐. 灵芝菌体液态深层发酵条件的优化[J]. 食品科学, 2010, 31(23): 377-382. DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugar and relayed substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356.

α -D-Glcp
↓(1 → 6) ↑(1 → 4) ↑(1 → 3) [13]

→ 3)β -D-Glcp-(1 → 3)-β-D-Glcp-(1 → 3)-β-D-Glcp-(1 →

β -D-Glcp
图8

β-D-Glcp

β-D-Araf-

[14] [15]

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GLPS1a 糖链的结构

Fig.8 Possible structure of GLPS1a

3





[16] [17]

赵桂梅, 张丽霞, 于庭敏, 等. 灵芝孢子粉水溶性多糖分离、纯化 及结构分析[J]. 天然产物研究与开发, 2005, 17(2): 182-185. 林志彬. 灵芝的现代研究[M]. 3版. 北京: 北京大学医学出版社, 2007: 125-144; 195-306.

采用 DEAE-Sephadex A25 离子色谱和 Sepharose CL6B 凝胶色谱分离纯化得到一种灵芝多糖组分 GLPS1a。

^

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0


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