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反胶团萃取技术的影响因素与应用 (2)


实验与技术

资源开发与市场 Resource Development & Market 2011 27( 11)

反胶团萃取技术的影响因素与应用
马伟超, 李一婧 , 殷彦涛
( 天水师范学院 生命科学与化学学院 , 甘肃 天水 741001)

摘要 : 反胶团是一种新型提取分离技术 ,

具有防止生物大分子 失活、 变性等优良 特性。综述了 反胶团 的原理、 含水 率、 pH 、 表面 活性剂、 助表面活性剂、 离子浓度、 萃取时间等因素对反 胶团萃取的影响及反胶团的应用。 关键词 : 反胶团 ; 萃取 ; 影响因素 中图分类号 : Q503 文献标志码 : A 文章编号 : 1005- 8141( 2011) 11- 0968- 04 MA Wei- chao, LI Yi- jing, YIN Yan- tao ( College of Bioscience and Chemistry,T ianshui Normal University, Tianshui 741001, China) Abstract: Reversed micelles had the property of protecting biomacromolecules from deactivation and denature. This paper reviewed the characters and applications of reversed micelles, and the factors, which were water content, pH, surfactant, cosurfactant, icon concentration, and extraction time, effected on reversed micelles extraction. Key words: reversed micelles; extraction; influencing factors Influencing Factors of Reversed Micelles Extraction and Its Application

反胶团( Reversed Micelles) 是表面活性剂在非极性 有机溶剂中超过一定浓度后自发形成了一种亲水性基 团向内的、 内含微小水滴的纳米级集合性胶体 , 是一种 具有热力学稳定的有序结构。表面活性剂在水中超过 一定浓度后也会形成一种亲水基团向外的、 疏水基团 向内的胶体, 可用来分离萃取不同性质的蛋白质等生 物物质 , 同时达到浓缩的效果。反胶团萃取具有选择 性高、 萃取过程简单 , 且正向萃取、 反向萃取可同时进 行, 并能有效防止大分子失活、 变性等优良特性 , 因此 在制药、 食品工业、 农业、 化工等领域的应用得到了大 量研究和开发 1 1. 1
[ 1]

为表面活性剂像膜一样保护了萃取到微水相中的蛋白 质, 使蛋白质不与有机溶剂直接接触, 所以蛋白质不会 变性; 如果再改变离子浓度、 pH 等条件就可把目的蛋 白质反萃取到水中[ 2] 。而反胶团的形成与大小也与此 类诸多因素有关 , 一般测量电导率来判断是否形成了 反胶团。形成反胶团之后 , 体系的渗透压、 浊度、 表面 张力、 当量电导都会出现明显改变。
表1
表面活性剂种类 阴离子表面活性剂 阳离子表面活性剂 两性型表面活性剂

四类表面活性剂
特性

在水中电离后 起表面 活性作 用的 部分带 负电荷, 如丁二酸- 2- 乙基己基酯磺酸钠( AO T) 在水中电离后 起表面 活性作 用的 部分带 正电荷, 如十六烷基三甲基溴化铵( CTAB) 同时具有阴阳两种离子性质的表面活性剂 在水溶液中不产生离子的表面活性剂



反胶团萃取的作用机理 表面活性剂 表面活性剂 ( surfactant) , 是指具有固 定的亲水亲

非离子表面活性剂

目前 , 普遍认为反胶团萃取的机理有以下 4 种 [ 3] : 静电性相互作用。在反胶团萃取中, 水相偏离蛋白 质的等电点使蛋白质带上正电荷或负电荷 , 这样就可 与表面活性剂发生静电的相互作用, 而水相的离子浓 度会影响这种静电相互作用。 立体性相互作用。主 要是影响反胶团尺度大小的因素, 如表面活性剂浓度、 含水率等。显然 , 当蛋白质的体积大于反胶团的体积 时, 反胶团是无法萃取的。 疏水性相互作用。当不 特异性 利于蛋白质萃取的条件时 , 一定量的蛋白质也会被萃 取, 此时蛋白质的疏水基起着很大的作用。 相互作用。主要是亲和配体之间存在特异性作用。 2 2. 1 反胶团萃取的影响因素 表面活性剂和助表面活性剂

油基团, 在溶液的表面能定向排列 , 并能使表面张力显 著下降的物质, 如 AOT、 CTAB、 C12- s- C12 2Br 等 , 它 是构成反胶团体系的重要因素。表面活性剂的分子结 构具有两亲性: 一端为极性的亲水基团 ; 另一端为非极 性的疏水基团, 现有表面活性剂主要分为 4 类 ( 表 1) 。 1. 2 反胶团萃取的作用机理 反胶团萃取类似于液 液萃取 , 目的蛋白质从水
收稿日期 : 2011- 09- 05; 修订日期 : 2011- 10- 29 基金项目 : 甘肃省科学技术厅项目 ( 编号 : 090NKCE081) ; 天水师范 学院中青年教师科研资助项目 ( 编号 : TSA0918) 。 第一作者简 介 : 马伟超 ( 1980- ) , 男 , 内蒙古自治 区赤峰人 , 硕士 , 讲师 , 研究方向为生物技术商业应用。

相中溶解到非极性有机溶剂中的反胶团微水相内。因

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反胶团萃取中表面活性剂的种类不同 , 反胶团的 萃取率存在差异。在选择表面活性剂时通常要根据目 的蛋白的等电点 , 一般可用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳 法, 现在还可用计算方法算出等电点, 这样就可利用静 电引力作用来高效萃取蛋白质。而离子型表面活性剂 易于形成较大的反胶团 , 含水率可达 50 左右 , 但对分 子量大于 30000 左右的蛋白质萃取效率不佳[ 4] 。表面 活性剂的浓度对萃取效果有很大的影响。在刘杨等的 研究中
[ 5]

相表面带相应的电荷。根据蛋白质的等电点 , 会使蛋 白质带上正电荷或负电荷 , 如果与反胶团的电荷相反, 则会产生静电引力, 使蛋白质被顺利地萃取到反胶团 中。如在昌庆龙等的研究中[ 8] , 采用了 Aliquat 336/ 异 辛烷/ 正辛醇所构成的反胶团, 因为 Aliquat 336 是阳离 子表面活性剂带正电荷 , 所以当水相的 pH 大于淀粉 酶的等电点时, 萃取率变大, 在 pH 为 10 时达到最大值 的 90% 。反之, 如果蛋白质所带的电荷与表面活性剂 的电荷相同, 则会产生静电斥力, 使蛋白质不能被萃取 到反胶团中。值得注意的是 , 调节水相的 pH 时 , 不能 使蛋白质变性。 在反萃取中, 调节 pH 主要是利用静电排斥作用 使蛋白质从反胶团中回到萃取水相中。如在龚福忠等 的研究中[ 9] , 采用了 AOT / 正已烷体系的反胶团。随着 pH 值升高, 萃取率增大 , pH 值在 9 时达到最大, 然后 开始降低。这 是因为 AOT 为阴离 子表面活 性剂, pH 增大超过等电点使蛋白质带负电荷, 这样就可通过静 电排斥作用反萃取出蛋白质。 pH 值在 9 以后萃取率 降低 , 是因为强碱性使蛋白质变性。 2. 4 离子浓度 离子强度主要在两方面影响反胶团萃取 : 一方面, 离子强度的增加和静电的屏蔽作用使静电性相互作用 变弱 , 蛋白质很难融入反胶团中; 另一方面 , 离子强度 的增加减弱了表面活性剂极性头之间 的静电排斥作 用, 使极性头易于相互接近形成较小的反胶团 , 此时含 水率 W0 减小, 蛋白质不易溶于反胶 团中。在贾颖萍 等[ 10] 对 含 水 率 W0 的 研 究 中, 随 着 KCl 浓 度 增 加 ( 0. 2 1. 0mol/ L) , 含水率 W0 开始逐渐减小。此外 , 林 翠英、 赵剑曦[ 11] 的研究也证明了这一点, 即当 NaBr 存 在时 , 反胶团体系中的增溶水能力降低。 在水相中添加少量盐类 , 主要是因为在低离子强 度下萃入反胶团相中的蛋白质可通过另一离子强度较 高的水相接触而发生反萃取。如在冯有胜等[ 12] 用亲 和反胶团萃取细胞色素 - c 的实验中 , 他们研究了离 子浓 度 在反 萃 取 中 的 影响 , 发 现 随 着离 子 浓 度 从 0. 25mol/ L升高到 1. 5mol/ L, 反 萃取率由 62% 上升到 93. 7% 。当离子强度大于 2mol/ L 之后 , 细胞色素 C 的 反萃取率不再提高。每种蛋白质的性质不同 , 他在反 胶团相中的溶解度达到最低时所对应的最小离子强度 也不相同。利用这种差别 , 可实现不同蛋白质间的分 离和浓缩。特别是当几种蛋白质间的等电点差别不大 时, 这种方法尤为有效。 2. 5 温度 温度对反胶团生物催化反应的影响与对其他系统 969

, 检测 CTAB 的不 同浓 度 ( 0. 02mol/ L、 0. 03

mol/ L、 0. 04mol/ L、 0. 05mol/ L、 0. 06mol/ L) 对萃取效果 的影响发现 , 随着 CTAB 浓度增加, 萃取率由 85. 4% 增 加到96. 5% ; 但当 CTAB 浓度大于 0. 05mol/ L 时, 有机 相黏度增大的程度影响了油水两相的分层速度 , 因此 表面活性剂的浓度要选择适当。 助表面活性剂能提高生物催化反应的活性和稳定 性。作者利用 CTAB/ 异辛烷反胶团进行纤维素酶的萃 取研究发现 , CTAB 基本不溶于异辛烷, 即使加热溶解 后也会很快析出 CTAB 固体 , 使有机相浑浊, 不能形成 澄清透明的反胶团, 但加入正丁醇后就可解决此类问 题。不是所有的表面活性剂都需要助表面活性剂, 如 黄光荣等[ 6] 所用的反胶团体系为 AOT/ 异辛烷, 这是因 为 AOT 分子亲水端小 , 疏水端为两条碳氢链, 故溶解 在有机相的状况较好。 2. 2 含水率 W 0 含水率 W0 对反胶团萃取是个 非常重要的参数, 直接影响反胶团的大小和反胶团内微水相的物理化学 性质。W0 越大 , 反胶团的半径越大。W0 可用水和表 面活性剂的浓度之比来确定 , 即 W0 = C 水/ C表 。当 W0 较小时, 水池 中的水与表面活性剂发生水合化, 粘度 大、 流动性差 , 而且形成反胶团的半径较小 , 不适合萃 取蛋白质; 当 W0 太大时, 微水相就会与水相的粘度相 当, 而且反胶团的半径也会很大, 反胶团就不稳定, 容 易破碎。同时 , 含水率也会影 响被萃取物质 的活性。 在姚传义的研究中 [ 7] , 检测了脂肪酶 在不同 W0 时的 活性。结果发现 , 脂肪酶活性随水含率 的增大呈 钟 形 曲线。在 W0 为 10 时脂肪酶的活性达到最大, 随着 W0 的增大或减小, 脂肪酶的活性依次降低。这可能是 由于 W 0 取最适值时 , 反胶团内腔尺寸与酶分子大小 一致 , 因此酶活最高。此外, 也可能是此时酶在反胶团 界面处呈现酶活最高的构像。 2. 3 pH 在前萃取中 , pH 是影响前萃取率的重要因素。因 为 pH 不影响表面活性剂间的斥力 , 所以 pH 不会影响 含水率, 那 么水相的 pH 主 要影响 静电的 相互 作用。 由于表面活性剂的极性端是向内的, 这样就会使微水

一样。当温度升高到一定时, 反应活性达到最大 [ 13] ,

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促进反胶团的稳定形成, 有利于酶分子进入反胶团 , 提 高萃取率。在孙 晓宏 等
[ 14]

取, 发现反胶团能有效地萃取质粒 DNA。当表面活性 剂浓度为 0. 6mol/ L、 萃取时间为 30min 、 前萃取 NaCl 浓 度为 0. 6mol/ L、 反萃取 NaCl 浓度为 1. 8mol/ L 时 , 萃取 率达到 60% 以上。 3. 4 分离金属离子 反胶团萃取金属离子一般在高酸度条件下 , 这是 金属离子反胶团萃取的特征。研究较广泛的是从磷酸 中萃取出金属离子杂质。在余静等人的研究中[ 24] , 采 用 DNNSA 和煤油构成反胶团来萃取磷酸中的镁离子, 发现氢离子浓度的增加会抑制萃取反应的进行 , 磷酸 浓度越高, 萃取越难进行。被萃取的镁离子也不是简 单地增溶入 DNNSA 反胶团, 而是与反胶团发生了化学 反应 , 萃合物组成为 MgD2 6HD。此外, 曹艳等 [ 25] 利用 表面活性剂 DNNSA 成功地从磷酸中萃取出 Fe3+ 。 3. 5 制备纳米材料 纳米材料性能优越 , 近来研究发现反胶团也可制 备纳米材料 , 这为反胶团的应用扩展了新的空间。如 王敦举等[ 26] 以 NTO( 一种纳米级高能炸药, 具有高威 力、 低敏感性等特点 ) 为提取目标做了试验, 以 Span80/ Tween80、 正己醇、 液体石蜡构成反胶团萃取 NTO, 在温 度为 25 30 、 真空度为 - 0. 6 - 0. 85MPa 的条件下 均匀 萃取 出 10 30nm 的 NTO 颗 粒。此 外, 李 恒 达 等 也成功制备出了 CdS 半导体纳米粒子。以 CTAB 为表 面活 性 剂、 正己 醇 为助 表 面活 性 剂 制备 了 水/ CTAB/ 正己醇/ 正 庚烷四 元反胶 团, 将该反 胶团 作为 微反应器 , 以四元反胶团配成两种不同的溶液, 一种 含 8. 45 10- 4 mol/ LCd( NO3 ) 2 水溶液, 另一种含 8. 45 10- 4 mol/ LNa 2S 水溶液 , 两种溶液混在一起后在反胶 团中形成了 CdS 纳米粒子。 3. 6 酶催化反应 反胶团体系作为酶反应介质, 具有组成灵活、 热力 学稳定、 界面积大, 可通过相调节来实现产物回收等优 点。崔茂金等[ 28] 在 AOT/ 异辛烷反胶团体系中鉴定了 纤维素酶降解的最佳条件, 最佳 W0 为 3. 18、 最佳酸度 为 5. 09、 最佳温度为 318. 90K。夏寒松等[ 29] 研究了长 链咪唑类离子液体 [ C14mim] Cl 形成的反胶团中青霉 素酰化酶的水解反应 , 发现青霉素酰化酶的溶解性、 催 化活性与酶稳定性均优于 CTAB 反胶团 , 酶的最大溶 解性是 CTAB 的 2. 3 倍, 酶活力高达 1. 3 倍, 且随水含 量、 表面活性剂浓度和 pH 值等变化改善明显。 4 结语
[ 27]

的 研究 中, 检测 了 25 、

30 、 40 、 50 、 60 条件下小麦胚芽蛋白的前萃取 率。结果显示, 从 25 40 萃取率逐渐上升 , 在 40 时达到最大 值; 温度超 过 40 后, 萃取率 逐渐 降低。 温度过高在前萃取中使萃取率降低, 因为温度过高使 分子运动速率加快, 体系混乱度增加 , 胶团变小 , 增溶 蛋白质量减少。但是, 在反萃取中高温却发挥着重要 作用。如在吴雅睿等的研究中 , 41 时前萃取率最 高; 但是在反萃取中 , 温度从 45 升到 60 , 萃取率从 60% 升高到 80% , 可见温度对萃取的影响很大。 2. 6 萃取时间 一般情况下 , 前萃取消耗的时间比反萃取少。如
[ 15]

在陈银鹤等人的研究中[ 16] 发现, 前萃取时间达到稳定 时需要 80min, 而在反萃取中需要 120min。此外 , 采用 表面活性剂的种类不同, 萃取的时间也不同。在于艳 春等的 研 究 中 采 用 了三 种 表 面活 性 剂, 分 别 是 SDSS 、 AOT 和 TOMAC, 这三种表面活性剂在前萃取时 分别消耗了 1min、 1min、 3min。 3 3. 1 反胶团萃取技术的应用 提取蛋白质
[ 17]

由于反胶团的屏蔽作用使蛋白质不与有机溶剂直 接接 触 , 而 水 池 的 微 环 境 又 保 护了 蛋 白 质 的 活 性[ 18] , 从而达 到溶解、 分离、 浓缩 蛋白 质的目 的。目 前, 研究较广泛的是对 - 淀粉酶、 细胞色素 - c 、 溶菌 酶[ 19] 等蛋白质的分离提纯。 3. 2 反胶团 超临界 CO2 萃取 超临界流体是状态超过气液共存时的最高压力和 临界点后的流体 , 而 CO2

最高温度下物质特有的点

是超临界流体萃取中应用较广泛的流体 , 但对亲水性 分子、 相对分子质量高的物质如氨基酸、 蛋白质和许多 聚合物、 金属离子的溶解能力非常低, 这限制了超临界 CO2 萃取技术的广泛应用
[ 20]

; 将反胶团应用于超临界

CO2 萃取就可解决此类问题 , 也可避免反胶团萃取过 程中存在的后处理问题。如在闾乔波的研究中[ 21] , 结 合反胶团和超临界 CO2 萃取技术提取苦杏仁苷。结果 发现 , 苦杏仁苷不能溶于单纯的超临界 CO2 流体, 却可 溶于具有 反胶 团的超 临界 CO2 流体。此外 , 丁 一刚 等 研究重金属离子的分离也应用了超临界 CO2 萃 取和反胶团结合 , 使萃取率达到了 90% 以上。 3. 3 核酸分子的分离纯化 反胶团萃取应用于核酸分子的分离纯化是近几年 发展起来的新领域。黄翠云等 [ 23] 用 TOMAC/ 2- 乙基 己醇/ 异辛烷构成的 反胶团对质粒 pUT649 进 行了萃 970
[ 22]

应用反胶团萃取技术不存在毒性试剂 , 对身体无 害、 提取成本低 , 且 反胶团溶液可反复利 用和连续操 作, 处理量大 ; 还可与其他提取分离技术结合 , 在工业

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化大生产方面具有较大的应用潜力 [ 30] 。近年来 , 反胶 团萃取技术的理论和应用研究都取得了较大进展。随 着研究的愈加深入, 反胶团技 术在生物化学、 有机化 学、 分析化学、 药物化学和日用化学等领域的应用将更 广泛。
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( 上接第 964 页 ) 3 讨论与小结 由表 2 和表 3 的分析可知, 对长梗黄精主根和须

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根多糖提取率的影响大小顺序均为乙醇浓度 > 颗粒大 小> 浸提时间> 浸提温度。同时, 对主根和须根在相 同条件下的多糖提取率进行差异显著 性分析结果显 示, 两者差异不显著 , 说明主根和须根的多糖提取可选 用相同的因素。对比表 2、 表 3 可知 , 须根多糖的含量 与主根的含量相差不大, 故须根的利用价值也很高 , 有 待开发利用 , 避免浪费。造成两者提取最适条件的差 异可能是两者中木质部含量不同引起的。因此 , 对长根 黄精主根多糖提取的最佳条件为乙醇浓度 80% 、 浸提温 度 80 、 浸提时间 50min 、 颗粒大小 40 目, 此时多糖的提 取率为 18. 754% ; 而对长根黄精须根多糖的提取最佳条 件为乙醇浓度 70% 、 浸提温度 60 、 浸提时间 30min、 颗 粒大小 80 目, 此时多糖提取率为 16. 652% 。

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萃取分离法习题
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分离工程 考试 总结
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制药分离工程思考题和练习题答案
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分离简答题
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萃取知识点
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3萃取技术
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