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一株产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定


一株产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定
生物科学2003级 李军 指导老师 吴 摘 琦 副教授

要:从皮革厂、畜肉市场、屠宰场等处采样,分离得到 49 株明胶水解活性的细菌。

经活性平板初筛、 牛皮消化实验和活性测定, 筛选得到一株胶原蛋白酶活性为 35.97U/mL 的菌株。经形态学观察、生理生化特性和 16SrDNA 序列分

析,鉴定该菌株为短小芽孢杆 菌。 关键词:胶原蛋白酶,短小芽孢杆菌,分离,鉴定

Isolation and Identification of a Bacillus pumilus with Collagenase Activity
LI Jun Biological Science, Grade 2003

Directed by WU Qi (Associate Prof. ) Abstract:Forty-nine bacterial strains with glutin hydrolyzation activity were isolated from leather house, market and slaughterhouse. By screening media, fresh calfskin decomposition and activity detection, one strain was screened with collagenase activity about 35.97U/mL. Furthermore, seen from morphology, physiology biochemistry characteristic and 16S rDNA sequencing, it was identified as a Bacillus pumilus. Key words:Collagenase,Bacillus pumilus,Isolation,Identification

胶原蛋白或称胶原是由动物细胞合成的一种生物性高分子。广泛存在于动物骨、脚、 软骨和皮肤及其它结缔组织中,约占哺乳动物总蛋白的 1/3。多数类型的胶原蛋白分子都 由 3 条肽链组成,3 链相互缠绕,形成了胶原蛋白分子特有的杆状结构[1]。胶原蛋白是一 类重要的资源,在许多方面都有重要的作用。 在饲料工业中:胶原蛋白作为一种高效的动物性蛋白营养添加剂[2] 。 在生物医学材料方面的应用:制作心脏瓣膜;血管修复的替换血管装置;作为烧伤伤
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口的敷料(使血液凝固,具有止血功能) ;制造人造皮肤[3]。 在食品方面:胶原蛋白材料制备薄膜材料;制造肠衣等可食用包装材料;作为肉制品 添加剂、保健食品等[3] 。 另外,胶原蛋白具有优良的吸湿、保湿性能以及抗皮肤衰老功效,一些知名品牌公司 已推出了纯胶原蛋白和一系列添加了纯胶原蛋白的护肤品[4] 。 胶原蛋白得到了广泛的应用, 大量的需求突出了提取胶原蛋白迫切性, 用胶原蛋白酶 进行生产就是其中重要的一种方法。 胶原蛋白酶是指作用于胶原或其变性明胶而不作用其它蛋白质的酶类 , 它来源广泛, 多种微生物以及动物的许多组织细胞都可以产生胶原酶。 胶原酶在环境保护上可用于皮革 边角废弃物变废为宝,高值转化;在医学研究中可用于治疗腰椎间盘突出症、瘢痕疙瘩、 杜普伊特伦症等,具有极大的应用价值。来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)、溶 藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等的胶原蛋白酶已有广泛的研究。目前,已从许多动物组织和
[5] 微生物中获得胶原蛋白酶 。本研究从屠宰场筛选到一株胶原蛋白酶产生菌,并鉴定为短

小芽孢杆菌,现报道如下。

1 材料方法
1.1 实验材料 1.1.1 样品来源 分别从雅安市杨皮匠皮革厂、肉市场、农村宰猪厂等处采集土样、水样。 1.1.2 试剂 Ⅲ型胶原蛋白(SIGMA 公司) ;柱式细菌 DNAout 提取试剂盒(绵阳高新区天泽基因工 程有限公司) ;牛皮:川农兽医院周皓师兄提供的初生小牛的牛皮;水合茚三酮;抗坏血 酸;乙酸;乙酸钠;Tris 试剂;无水乙醇;三氯乙酸;HgCl2;盐酸;乙二醇甲醚;牛肉 膏;蛋白胨;明胶;K2HPO4·3H2 O; NaH2PO4·2H2 O ;NaCl;KH2PO4;MgSO4·7H2O;葡萄糖 等。试剂均为分析纯试剂。 1.1.3 器材 实验过程中所使用的仪器有:PCR 仪;电泳仪;TGL-16G 离心机,MS2 旋涡混和器, Haier 冰箱,DNP-9272 型电热恒温培养箱,HZQ-F 全温振荡培养箱,洁净工作台,BS210S 电子天平,CX210FS1 生物显微镜,YX 280A 手提式不锈钢蒸汽消毒器,DK-98-1 型电热恒
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温水浴锅,微量加样器,DHG-9246A 型电热恒温鼓风干燥箱,WXZ-UV-2102 紫外可见分光 光度计,酸度计,以及离心管,EP 管,培养皿,接种环(针)等。 1.1.4 培养基[5] 种子培养基(1000mL ): 牛肉膏 蛋白胨 5g, 10g, NaCl pH 5g, 7.2~7.4

富集培养基(1000mL) : 明胶 蛋白胨 1g, 5g, NaCl pH 5g, 7.2~7.5

初筛培养基(1000mL ): 明胶 蛋白胨 20g, 5g, NaCl KH2PO4 pH 0.1 g, 0.5g, 7.2~7.5

MgSO4·7H2O 0.2g, 复筛培养基(1000mL ): 葡萄糖 胰蛋白胨 CaC12 pH 20g, 10g, 0.05g, 7.0~7.2

酵母粉 NaH2PO4·2H2 O K2HPO4·3H2 O

1.5g 0.5g 2.5g

固体培养基:在上述液体培养基中加入 1.6%琼脂,即成相应固体培养基。 1.2 方法[5] 1.2.1 胶原蛋白酶产生菌的筛选 1.2.1.1 配制酸性汞试剂:HgCl2 15g,浓盐酸 20g,加蒸馏水定容至 100mL。 1.2.1.2 富集培养 取样品 2g 或 2ml,用生理盐水 18 mL 浸泡摇匀后放置 10min,在沸水浴中处理 5 min, 冷却后按 0.5%的量 (即 100 u L) 取悬浮液接种装有富集培养基的三角瓶中, 180r/m, 37℃ 摇瓶培养 2d。 1.2.1.3 胶原蛋白酶产生菌的初筛 将富集培养液梯度稀释:取 8 支试管各装 9mL 蒸馏水,依次编号,灭菌,无菌操作下 取 1mL 富集培养液加入 1 号管中充分混匀, 再从 1 号管中取 1mL 混合液加入 2 号管中混匀,

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再从 2 号管中取 1mL 混合液加入 3 号管中混匀……,直到 8 号管也充分混合后,取 10-6, 10-7,10-8 三个梯度浓度的稀释液各 50uL 进行涂布初筛平板,涂布均匀后放入 37℃温箱中 培养约 24h。观察菌落生长情况,选取具有隐约透明圈的菌落,转接平板,编号记录。将 初筛菌在 37℃温箱中培养 24 h,在平板菌落周围滴加酸性汞试剂,如菌落周围出现透明 圈者为阳性,即是要初步分离得到的菌,大约在滴加试剂后 10 秒就会出现透明圈。挑选 明胶水解圈与菌落直径比值较大的菌株保存。 1.2.1.4 胶原酶活性定性测定 胶原蛋白酶能分解明胶, 从而使菌落周围产生一个被分解了的圆圈, 酸性汞试剂能与 明胶反应产生白色物质, 而不会与明胶分解后的产物产生白色物质, 故在能分解明胶的菌 落周围滴加酸性汞试剂后会产生一个透明水解圈, 水解圈与菌落的直径比越大, 可基本说 明该菌产生的酶活力或酶数量越大,以此初步判断出目的菌。 1.2.1.5 牛皮消化实验 挑选明胶水解圈与菌落直径比值较大的菌株,分别接种于种子培养基中,37℃培养 2d。 剪取各约 0.5g 重的新鲜小牛皮, 灭菌后装入试管, 每管加入种子培养基上清液各 2 mL (4000r/m 离心 10min) ,并标上对应的号,另取一管加入 2 mL 无菌种子培养基作为对照, 盖上棉塞,室温放置 2d,期间可每 12h 摇动一次,以便牛皮与酶液充分接触。两天后取 出牛皮进行对照观察。 1.2.2 酶液的制备(复筛) 在平板上勾取一环消化牛皮效果最好的 COL-J 菌株,接种于 20mL/150mL 的种子培养 基中,在 37℃,180 转条件下摇瓶培养 12h,再按 0.5%的接种量接种到 20mL/150mL 的复 筛培养基中,摇瓶培养 48h。4000rpm, 10min 离心后,取上清液测定胶原蛋白酶活力。 1.3 胶原蛋白酶活性检测 1.3.1 溶液制备 (1)还原茚三酮的制备:称取 5g 水合茚三酮,用 125mL 蒸馏水溶解,得黄色溶液.将 5g 抗 坏血酸用 250mL 蒸馏水溶解。 在电磁搅拌下将抗坏血酸溶液滴加到水合茚三酮溶液中, 滴 加过程中不断有沉淀出现, 滴加完后室温下继续搅拌 15min, 放入冰箱中冷却 5min, 过滤, 沉淀用蒸馏水洗涤 3 次,收集沉淀,真空干燥。 (尽量在避光条件下迅速完成) 。 (2) 茚三酮显色液:称取 85mg 茚三酮和 15mg 还原茚三酮, 溶解于 10mL 乙二醇甲醚, 避光 低温保存。

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(3) 2mol/L pH5.4 乙酸缓冲液:86mL 2mol/L 乙酸钠加入 14mL2mol/L 乙酸,混匀。 (4)底物溶液:取 20mg 酸溶性 III 型胶原溶于 20mL 0.01 mol/L 乙酸溶液中,避光低温保 存。 (5) 0.lmol/L pH7.5Tris-HC1 缓冲液(含 50mmo1/L CaC12) (6) 60%乙醇溶液:60mL 无水乙醇中加入蒸馏水定容至 100mL。 (7)30%三氯乙酸[6]:取 15mL 氯乙酸,加入蒸馏水定容至 50mL 1.3.2 胶原蛋白酶活力测定 1.3.2.1 标准曲线的制定:先配成 0.3?mol / mL 的甘氨酸备用,取 6 支试管按表 1 编上 号加样。
表 1 甘氨酸标准曲线

试管号
甘氨酸(mL) 蒸馏水(mL) 浓度(?mol / mL)

0 0 1.5 0

1 0.25 1.25 0.05

2 0.5 1.0 0.1

3 0.75 0.75 0.15

4 1 0.5 0.2

5 1.25 0.25 0.25

将 0.5mL 含上述浓度的甘氨酸溶液与 0.5mL, 2mol/L 乙酸缓冲液充分混匀, 加入 0.5mL 茚三酮显色溶液,充分混合后,盖住试管口,在 100℃水浴中加热 15min,用自来水冷却。 放置 5—10min 后,加入 1.5mL 60%乙醇稀释。充分混匀后,570nm 处比色。 1.3.2.2 酶活的测定:以酸溶性 III 型胶原为底物,先将配好的胶原稀释 20 倍;将上述 准备好的酶液稀释 400 倍。 反应体系为: 稀释胶原 150uL, 0.1 mol/ L pH 7.5 TrisHCI(含 50mmol/L CaC12) 100uL, 酶液 50uL, 37℃反应 30min,等体积(300uL)30%三氯乙酸终止反应,以先加终止液的相 同反应物为对照,加入 0.6 mL, 2mol/L 乙酸缓冲液充分混匀,再加入 0.6mL 茚三酮显色 溶液,充分混合后,盖住试管口,在 100℃水浴中加热 15min,用自来水冷却。放置 5— 10min 后,加入 1.8mL 60%乙醇稀释。充分混匀后,570nm 处比色。茚三酮显色法测定反 应所释放的水溶性氨基酸、 短肽, 以甘氨酸显色制定标准曲线。 酶活力单位定义为:在 37℃, pH7.5 条件下,1mL 酶液每分钟水解胶原产生相当于 1?mol 甘氨酸的酶量为 1 个酶活力单 位(U)。 1.4 细菌鉴定 将菌株 COL-J 进行形态学、生理生化试验和分子遗传学鉴定。
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1.4.1 菌体形态观察:将 COL-J 菌接种到初筛平板上 37℃培养 24h,观察菌落形态;接种 于种子培养基中 37℃,180r/m 摇瓶培养 12h,做革兰氏染色观察[7]。 1.4.2 生理生化试验:以一株标准短小芽孢杆菌为对照,对 COL-J 菌的部分生理生化特征 进行实验观察。 根据分离菌的菌落和菌体形态,芽孢的有无和着生情况,以及生理生化反应,按东秀 珠《常见细菌系统鉴定手册》进行初步分类[8] 。 1.4.3 16S rDNA 的 PCR 扩增 生物细胞 DNA 分子的一级结构中既具有保守的片段,又具有变化的碱基序列,保守的 片段反映了生物物种间的亲缘关系, 而高变片段则能表明物种间的差异. 这些核苷酸序列 则是不同分类级别生物(如科、 种)鉴定的分子基础, 16SrDNA 为聚合酶链式反应(PCR) 属、 以 扩增的靶分子进行细菌快速分类鉴定, 与其它细菌鉴定方法比较, 具有高效、 准确、 简便、 特异性强的优点[9]。 1.4.3.1 细菌总 DNA 的提取 将菌种接种于 20mL/150mL 种子培养基,37℃ 180r/m 培养 12 h,按如下柱式 DNA out 抽提试剂盒使用手册提取菌株 COL-J 的总 DNA: (1)取 1mL 菌液离心 1 min 后,重悬于 0.6mL 溶菌液中,吹打均匀,37℃保温 30 min。 (2)13000g 离心 10 min 后弃上清夜。 (3)加入 300uL 溶液 A 到细菌沉淀中,吹打均匀。 (4)加入 150uL 溶液 B 到离心管中,颠倒数次混匀后溶液中将有白色丝状悬浮物产生。 (5)65℃水浴放置 3-5min。 (6)加入 200uL 氯仿,震荡混匀 30 秒,溶液呈乳白色。 (7)13000g 室温离心 2min,上清透明,中间层有白膜,小心转移上清到新的离心管中,避 免触及中间的白膜。 (8)加入 1.5 倍体积(约 0.6mL)的通用上柱夜到上清中,颠倒混匀全部转移到离心吸附 柱中,室温放置 4min。 (9)13000g 室温离心 1min,DNA 吸附在离心吸附柱的膜上,倒弃收集管中的穿透液。 (10)将 0.5mL 通用洗柱液加入离心柱中,13000g 室温离心 1min,弃穿透液。 (11)重复第 10 步操作一次。 (12)空甩半分钟,将离心吸附柱转移到新的离心管中。

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(13)加 50-100uL 自备 TE(pH8.0) ,室温放置 3-5min。 (14)13000g 室温离心 1min 即得 DNA 溶液。 1.4.3.2 16S rDNA 的 PCR 扩增和序列测定 上游引物序列:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 下游引物序列:5’-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’ PCR 反应体系(25uL)为:10×buffer2.5uL, 25umol 的 MgCl2 0.5uL,2.5mmol dNTP0.5uL, 上游引物 1uL,下游引物 1uL, DNA0.5uL, 5U/uL 的 Taq 酶 0.5uL, 超纯水 17.5uL。 PCR 扩增程序为:95℃预变性 5min;95℃45sec,56℃30sec,72℃1.5min,循环 30 次; 72℃延伸 10min。PCR 产物送上海英骏 (invitrogen)生物技术有限公司进行序列测定。 1.4.3.3 序列比对 将 16S rDNA 测序结果在 GenBank 的核酸数据中进行同源性比对。

2 结果
2.1 胶原蛋白酶产生菌的筛选及牛皮消化试验 从雅安市皮革厂、肉市场、农村宰猪厂等处采集土样、水样共 5 份,经生理盐水浸 泡,明胶富集培养后,梯度稀释涂布于初筛平板上。共分离到 49 株产明胶酶菌株。挑选 水解圈直径与菌落直径比值较大的菌来进行种子液培养,将发酵液对重约 0.5g 的新鲜小 牛皮作室温消化。从中筛选到 5 株对牛皮消化效果好的菌株, 其中加入 COL-J 菌上清液 的牛皮被很充分的消化了,是效果最好的一管,仅剩很薄的与毛连接的皮肤,而加无菌种 子培养的对照组,牛皮则无明显变化,说明 COL-J 上清液中确有能消化牛皮的酶,而小牛 皮中含有大量的胶原蛋白,可以判定 COL-J 产生了胶原蛋白酶,而且效果很好。

图 1 牛皮消化实验对照结果 www.100biotech.com service@100biotech.com

(图中最左为 COL-J 菌消化了的牛皮,右为对照实验)

2.2 甘氨酸浓度标准曲线 本研究是以茚三酮显色法测定酶反应释放氨基酸或短肽的量为标准测定胶原蛋白酶 活性的,因此先进行了茚三酮显色法测定已知甘氨酸浓度,以此作出标准曲线。将甘氨酸 标准液依次稀释为 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25?mol /mL,并在显色后在 570nm 处测光 密度吸收值,结果见下表 2 和图 2。
表 2 甘氨酸标准液的光吸收值

试管号:

0

1
0.05 0.132

2
0.1 0.259

3
0.15 0.386

4
0.2 0.502

5
0.25 0.625

浓度(?mol /ml) 0 : 测得 A 值: 0

A值 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.1

R 2 = 0.9996

0.2

甘氨酸浓度 0.3

图 2 甘氨酸浓度标准曲线

2.3 酶活测定结果 用茚三酮显色法在 570nm 处测定的酶液的光密度吸收值为实验组:A1=1.054,对照组 A2=0.712,△A:0.342,根据酶活力单位的定义,计算后得到酶的活力是:35.97 U/mL。 计算公式是: U=(△A-0.0058)/2.4926/30·N·20(U 为胶原蛋白酶活力(U/mL) ;△A 为 样品净吸光值;N 为酶液的稀释倍数。公式中的 20 是将 50 uL 酶液换算成 1mL,而不是的 20 倍稀释倍数。 ) 2.4 菌种的鉴定 2.4.1 菌落形态
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挑取该菌接于初筛平板上 37℃培养 24h, 菌落显圆形, 边缘不整齐, 表面干燥有褶皱, 无粘性,不透明,灰白色,滴加酸性汞试剂能产生透明水解圈,菌落直径约 0.70cm,透 明水解圈直径约 2.60cm,见图 3。

图 3 菌落及水解图 (左为平板菌落图,右为平板菌落水解圈图)

2.4.2 显微镜观察

图 4 COL-J 菌显微镜下观察图(箭头所指为芽孢)

革兰氏染色表明,该菌为革兰氏阳性菌,菌的大小为 2um~3um×1um,短杆状,两端 钝圆,无鞭毛和荚膜,长短不很一致,成单或是成短链排列,芽孢椭圆位于菌体两端,结 果见图 4。 2.4.3 生化鉴定 菌株 COL-J 的 VP 试验阳性;能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇;能水解明 胶;不能利用丙酸盐; 吲哚、苯丙氨酸脱氨酶试验阴性;不需要 KCl 和 NaCl;能耐受 7%NaCl;最适温度 30℃~40℃;生长温度范围为 10℃~50℃(见表 3) 。
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表 3 短小芽孢杆菌鉴定结果

鉴定指标 接触酶 厌氧生长 V-P 测定 V-P 培养物终 pH:<6 7 产酸:D-葡萄 糖 L-阿拉 伯糖 D -木糖 D-甘 露醇 葡萄糖产气 水解:酪朊 明胶 淀粉 利用:柠檬酸盐 丙酸盐 酪氨酸水解 苯丙氨酸脱氨 酶 卵黄卵磷脂酶

短小芽孢杆 菌标准菌株 鉴定结果 + — + + — + + + + — + + — + — — — —

COL-J 鉴定结 鉴定指标 果 + 硝酸盐还原 + 形成:吲哚 + 需要 Nacl 和 Kcl 需要尿囊素和尿 + 素盐 生长 pH:6.8 营 — 养肉汤 5.7 营 + 养肉汤 + + — — ND + + ND — ND — ND 生长 NaCl:2% 5% 7% 生长温度:5℃ 10℃ 30℃ 40℃ 50℃ 55℃ 65℃ 有溶菌酶时生长 H2+CO2 或 CO 自 养生长

短小芽孢杆 菌标准菌株 鉴定结果 — — — — + + + + + — + + + d — — d —

COL-J 鉴定结 果 + — — ND + + + + + — — + + + — — ND ND

注:d:11-89%菌株为阳性;ND:未测定;NG:不生长。

根据上述形态学及生理生化特性比较, 参考 《常见细菌系统鉴定手册》 将菌株 COL-J , 初步鉴定为短小芽孢杆菌。 2.4.4 16s rDNA的扩增 3.4.4.1 PCR 扩增 以菌株 COL-J 的总 DNA 为模板,进行 PCR 扩增,得到约 1.5Kb 的特异性扩增产物,得 到 PCR 电泳图如图 5。

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图 5 16SrDNA 的 PCR 产物电泳图

2.4.4.2 测序结果 PCR 产物测序结果表明,测序片断长 1513bp,具有典型的 16SrDNA 的特征。将该序列 登录到 GenBank,登录号为 EF197942。采用 Blasting,将该序列与 GenBank 的核酸数据 中进行同源性比对。结果表明,该序列与短小芽孢杆菌 16SrDNA 同源性为 96%-100%。 agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagaagggagcttg ctcccggatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaacc ggagctaataccggatagttccttgaaccgcatggttcaaggatgaaagacggtttcggctgtcacttacagatgga cccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcg gccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtc tgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgcaaga gtaactgcttgcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtag gtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccgg ctcaaccggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtga aatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcg tggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgcc ccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgac gggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctc tgacaaccctagagatagggctttcccttcggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgt gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtg actgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtg ctacaatggacagaacaaagggctgcgagaccgcaaggtttagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgc agtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccggg ccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagcc gccgaaggtggggcagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgta
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根据上述形态学、 生理生化特性和 16SrDNA 的比对结果, 将菌株 COL-J 鉴定为短小芽 孢杆菌。

3 讨论
3.1 关于产胶原蛋白酶菌株的筛选 在实验过程中, 发现了很多的问题, 比如在初筛平板上可以看到明胶酶产生菌周围有 隐约的雾状圈, 而且在冰箱中放置一段时间后更加明显, 通过后面实验也知道了这样选出 的菌大都是能分解明胶的, 而且此时的圈的边缘与滴加了酸性汞后产生的透明圈的边缘是 一致的, 这大大的提高了对目的菌株的筛选效率和准确度; 在遇到前后两次实验得到的数 据相距很远时(如菌落水解圈与菌落大小的比值) ,采用多次测量后抛弃相距太远的值, 再求平均的方式; 在测定酶的活力的开始阶段是一个漫漫摸索的过程, 往往是显色后颜色 太深, 仪器不能测定或是数据大大的超过了标准曲线的有效范围, 需要对酶液和胶原逐个 浓度的稀释,在多次的测量后确定为实验中的数据;等等。 对 COL-J 菌重复做了牛皮消化实验和酶活性测定实验,得到与前面实验相近的结果, 表明此菌的胶原蛋白酶活力稳定。 而且本实验所测的酶活是在常规条件下测定的, 在后续 的菌的培养条件的优化后,相信酶活力还会有很大的提高,具有更高的应用价值。 应当注意的是, 透明圈直径与菌落直径之比的大小不能完全代表酶活大小, 仅以此作 为弹性蛋白酶酶活力大小的定量指标是不太可靠的[10], 只能作为大体的依据, 本实验的研 究结果与之一致,如 COL-J 的比例为 3.71,不是最大的,但却是牛皮消化效果最好的。 透明圈法对于大多数的菌株还是有用的,对本实验有很好的指导意义。 3.2 对进一步研究的意义 胶原蛋白作为一种重要的天然蛋白质资源, 无论在生物医学、 食品保健还是在化妆品、 纺织行业中的应用都十分广泛,综合利用的研究进展速度很快,其良好的生物相容性、生 物可降解性,使它在食品工业中具有广泛的应用前景和发展
[11]

。依靠微生物产生胶原蛋

白酶,再制备胶原蛋白是一个发展迅速的胶原蛋白获得方式。 胶原酶来源广泛, 多种微生物与动物的许多组织细胞都可产生胶原酶。 国外对胶原酶的研 究起于上个世纪60年代,最先在蝌蚪外殖体组织中发现含锌的金属酶(Gross and Lapiere, 1962),后来在溶组织梭菌(Clostridium histolyticum) ,无色菌(Achromobacter ) ,褐藻 弧菌(Vibrio alginolyticus) ,产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) ,枯草杆菌(Bacillus
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subtilis) ,白色链霉菌(Streptomyces albidoflavus) ,高温放线菌(Thermoactinomyces)等 菌中得到,并在蛇毒中也得到了胶原蛋白酶[12-14],但是许多非食品来源的胶原蛋白酶不能 排除病毒隐患,目前大多从食品中研究胶原蛋白酶,如鱼子酱中,日本鲭鱼(Scomber japonicus)中等,据报道每年约收获一亿吨鱼,但只有30%被制成了鱼肉产品,50%以上被 浪费了[15];我国是制革大国,具有丰富的皮胶原资源,胶原酶可以专一的水解皮胶原,而 不需要对皮胶原进行热变性和酸碱处理, 就可制备出具有高生物活性的胶原蛋白, 对提高 动物皮及制革副产物(边角料残次皮)的应用有重要意义[16]。 制革业是我国轻工业中的第一 大出口创汇产业, 然而又是我国仅次于造纸业的第二大有机物质污染源[17], 我国每年约产 生140多万吨的皮革固体废弃物,而在这些固体废弃物中,除少量的非胶原蛋白外,大约 80%以上都是胶原蛋白构成的[18]。 利用胶原蛋白酶可以有效的对制革业产生的污染和鱼胶 原的浪费进行合理的处理,有很大的社会和市场需求。 胶原酶现已广泛应用在医学领域 ,用于治疗椎间盘突出、创伤修复、治疗血栓、治 疗脓疮等, 特别是近年秦静
[19]

在CT引导下注射胶原蛋白酶治疗腰椎间盘突出症, 不但大大

减少了副反应, 还提高了注射的准确性, 这说明了在胶原蛋白酶的应用领域里还有很大的 发展空间。 蛋白酶虽然广泛存在于微生物中, 但工业上主要采用芽孢杆菌属的几个种, 如地衣芽 孢杆菌、短小芽孢杆菌等[10] 本实验分离到的就是一株短小芽孢杆菌。对本实验中所分离 到的COL-J菌株及其它几株能产生胶原蛋白酶,且初步鉴定效果良好的菌株本实验室正在 进行培养条件的优化, 以便可以获得更高的酶活力可有更好的应用前景, 并可以在此基础 上, 进一步对菌株进行胶原蛋白酶的分离纯化以及基因的克隆和表达工作, 以期最终实现 该酶的工业化生产应用。

参考文献
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致谢
本论文是在吴琦副教授的悉心指导下完成的, 凝聚了指导老师大量的心血。 长期以来 吴老师在百忙之中也从未中断对我的指导, 给我的学习以无微不至的关心和帮助, 吴老师 对我的指导不仅是在学习上的, 他更以自己的严谨治学、 勤勉工作和豁达胸怀教给了我许
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多做人的道理。在论文顺利完成之际,我谨向尊敬的吴琦老师致以最诚挚的谢意! 同时,在论文的实验过程中,特别感谢李陈等师兄师姐的热心的帮助和鼓励。

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