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遗传转化过程中水稻愈伤组织的内源植物激素变化动态研究


中国农业科学 2007,40(10):2361-2367 Scientia Agricultura Sinica

遗传转化过程中水稻愈伤组织的内源植物激素变化动态研究
刘 清 ,朱允华 ,吴 顺 ,沈革志 ,萧浪涛
1 2 1 3 1

(1 湖南农业大学湖南省植物激素与生长发育重点实验室,长沙 410128;2 南华

大学生命科学与技术学院,衡阳 421001;
3

上海市农业科学院作物所,上海 201106)

摘要: 【目的】通过对遗传转化过程中水稻愈伤组织本身的 3 种内源激素含量变化动态研究,探讨水稻愈伤 组织生长发育过程中内源激素变化规律和激素间的相互关系,旨在为水稻遗传转化体系中合理使用植物生长物质 提供参考依据。 【方法】以广粳 1 号、特青、V20B 为遗传转化供试材料,采用高效液相色谱法(HPLC)测定了遗 传转化过程中 4 个主要时期愈伤组织中的内源脱落酸(ABA) 、生长素(IAA)和玉米素核苷(Z)的含量。 【结果】 IAA 主要存在于种胚诱导出的愈伤组织上及芽中,且过高的 IAA 含量不利于愈伤组织的诱导和生长;Z 主要存在于 种胚中,对愈伤组织诱导的启动有决定性作用,如果外植体中的 Z 含量太低,即使有较高的 IAA 含量也不能诱导 出愈伤组织;过高的 ABA 对愈伤组织的诱导不利,但在继代培养时适量升高 ABA 含量有利于胚性愈伤组织的形成。 【结论】内源激素对愈伤组织的生理状态有着极其重要的影响,其种类、含量及协调平衡是水稻愈伤组织形成和 分化的关键。同时,诱导培养基中 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度与水稻愈伤组织培养物中的培养力(愈伤组 织质量,芽长和诱导率)有一定的相关性,且在培养基中加入 2,4-D 等生长调节剂类物质会对愈伤中的内源激素 含量有一定的影响。 关键词:内源激素;2,4-D;水稻;愈伤组织;高效液相色谱

Studies on the Content Changes of Endogenous Phytohormones in Rice Calli for Genetic Transformation
LIU Qing1, ZHU Yun-hua2, WU Shun1, SHEN Ge-zhi3 , XIAO Lang-tao1
(1Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;
2

College of Bioscience and Biotechnology Nanhua University, Hengyang 421001; 3Crop Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106)

Abstract: 【Objective】 In order to provide some reference frames for rational utilization of phytohormones or plant growth regulators in tissue culture, the dynamic changes of endogenous phytohormones in rice calli from four main processes of genetic transformation were studied. 【Method】 Using Guangjing No.1,Teqing and V20B as materials,endogenous ABA,IAA and Z in rice calli in four main stages of genetic transformation were analyzed by HPLC. 【Result】IAA was found to be more abundant in the callus buds than in the mature embryos. High content of IAA reduced callus induction and growth. Z was found to be mainly existed in seed embroys, being crucial for callus induction. Calli could not be induced when Z content was too low, even the IAA levels were relatively high. High content of ABA was negative to callus induction,but might increase embryogenic callus in the process of callus regeneration. 【Conclusion】 The kinds, contents and harmonious balance of endogenous phytohormones are key factors to callus induction and differentiation for rice. The concentration of 2,4-D could influence the culture’s strength of callus and the levels of endogenous phytohormones. Key words: Endogenous; Phytohormones; 2, 4-D; Rice; Calli; HPLC

收稿日期:2006-07-03;接受日期:2006-11-14 基金项目:国家自然科学基金项目(30600049,30670190) 、湖南省科技应用基础研究计划重点项目(2007FJ3003) 、湖南省科技计划项目(06FJ3079) 作者简介:刘 清(1974-) ,男,湖南茶陵人,研究方向为植物生理学。Tel:0731-4635259-8000;E-mail:lqing2003@163.com。通讯作者肖浪涛(1963-) , 教授,研究方向为植物生理与分子生物学。E-mail:ltxiao@hunau.net

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0

引言
【研究意义】转基因技术在水稻遗传改良上已经

抗性筛选以及分化这 4 个阶段分别采样,液氮处理、 冷冻干燥后于-40℃超低温冰箱保存备用。 1.3 内源激素的测定 高效液相色谱法(HLPC)。激素的提取参照王 若仲等 [16]方法,稍作修改。准确称取冻干样品的重 量,加入预冷的 80%甲醇水溶液 10 ml,在弱光下冰 浴研磨,置 4℃冰箱中浸提过夜。4℃,5 000 g 离心 10 min,收集上清液,残渣加入预冷的 80%甲醇水溶 液浸提 2 次,离心后合并上清液,真空冷冻浓缩至干 后再用 0.1 mol·L-1 醋酸铵(pH 9.0)8 ml 复溶,4℃, 15 000g 离心 20 min 后取上清液。上清液依次经过 PVPP、DEAE 柱,以 Sep-Pak C18 柱收集样品的内 源激素,用 50%甲醇洗脱,真空冷冻浓缩至干。检 测时样品用 20%的乙腈,80%的 0.4%三乙胺溶液 (pH3.5) μl 进行复溶后过 0.45 μm 滤膜进样。 80 以 乙腈和 0.4%的三乙胺溶液(pH 3.5)作流动相;起 始浓度为 100%的三乙胺(pH 3.5)溶液梯度洗脱,6 min 后三乙胺溶液为 82%,乙腈由 0%变为 18%,18 min 后三乙胺溶液为 64%,乙腈达到 36%;流速 1 ml·min-1;检测 IAA 的波长为 212 nm,ABA、Z 为 270 nm;柱温 35℃,进样量 10 μl,根据外标法定量 测定 IAA、ABA、Z 的内源激素含量,结果中各内源 激素含量数值为 2 次平行样的均值。

其中采用较多的是农杆菌介导 有很多的研究报道[1~5]。 法, 该转化体系以获得高质量的水稻愈伤组织为前提, 植物激 而在影响水稻愈伤组织质量的诸多因素中[6~8], 素有着极其重要的影响,且外源植物生长物质除直 接作用外还可通过影响植物内源激素水平来发挥作 用
[9,10]

。【前人研究进展】组织培养中常用的外源激素

有 2,4-D、6-BA、KT、NAA 和 IAA 等。在进行组 织培养时,籼稻比粳稻要求更高的激素水平[11]。培养 基中添加外源激素的种类和含量对愈伤组织的质量有 着重要的影响[12]。但人们对植物组织培养过程中外源 生长物质的添加往往只是凭经验进行,一般很难达到 预期目标。随着内源激素检测手段的不断改进,国内 外科学工作者近年来已对植物组织培养过程中内源激 素的变化,内源激素对培养过程中脱分化、分化及再 生的作用以及内源激素与外源生长物质之间的关系进 行了研究,结果表明内源 IAA、GA、ABA、多胺等 对愈伤组织形成和分化有着重要作用
[13,14]

。【本研究

切入点】内源激素与植物生长调节剂在调节愈伤组织 体细胞的作用上具有密切的关系。因此,在进行组织 培养时, 不仅要考虑外源植物生长物质的种类和配比, 还要注意外植体及各阶段愈伤本身的内源激素的含量 变化。【拟解决的关键问题】本试验对水稻遗传转化 过程中内源激素含量的变化动态进行研究,探讨愈伤 组织生长发育与各内源激素变化规律间的相互关系, 旨在为水稻遗传转化体系中根据所培养材料自身内源 激素含量情况而有针对性地合理使用植物生长物质提 供参考依据。

2

结果与分析
不同生长状况愈伤组织中的内源激素水平

2.1 愈伤组织诱导时期的内源激素含量情况 2.1.1 前人研究表明,2,4-D 是水稻等禾本科植物组织培养 在合适的 2, 4-D 中一种有效的生长素类调节剂[8,17,18], 浓度下,添加其它外源生长物质虽能够改善愈伤组织 的胚性状态、提高愈伤组织的质量,但不能显著提高 愈伤组织的诱导率[9,19]。水稻的幼胚和成熟胚在进行 愈伤组织诱导时,一般是先长出小芽,然后才启动愈 伤组织的诱导,萌芽率的高低是外植体培养力强弱的 反映,但芽的过分生长不利于愈伤组织的诱导。本试 验中利用不同质量浓度的 2,4-D(0、1.0、1.5、2.0、 2.5 mg·L-1)处理水稻成熟胚和幼胚,使其诱导出具有 不同生长状况(芽长,诱导率,每 100 个愈伤组织重 量)的愈伤组织,分别采样测定其内源激素的含量, 详见表 1 和表 2。 成熟胚经不同浓度 2,4-D 处理(表 1),粳型稻 广粳 1 号在 2,4-D 质量浓度为 2.0 mg·L-1 时愈伤组织 的诱导率高且胚性较好,而籼型稻特青的愈伤组织诱

1

材料与方法
带目的基因和抗性基因的载体由上海植物生理生

1.1 质粒、菌株以及主要试剂 态研究所王宗阳研究员惠赠,经冻融法,融合于根癌 农杆菌菌株 EHA105。 IAA、Z 和 ABA 激素标样(Fluka 公司产品), 聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP),二乙基氨基乙基交联葡 聚糖凝胶(DEAE),色谱纯乙腈和三乙胺。 1.2 供试材料 水稻品种广粳 1 号、特青、V20B 均由湖南农业 大学水稻科学研究所严钦泉研究员提供。 参照 Hiei 等
[15]

的方法进行水稻遗传转化,在愈伤组织诱导、继代、

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导率高、胚性好时的 2,4-D 质量浓度为 2.5 mg·L-1, 内源激素含量分析表明,在外源 2,4-D 为 0 时广粳 1 号的水稻愈伤组织内源激素 IAA、 ABA 含量都明显高 于特青,反映出不同基因型水稻间的内源激素含量存 在较大差别,这可能是造成不同品种水稻材料在进行 愈伤组织诱导时所需最适 2,4-D 浓度不同的原因。 数据分析表明,2,4-D 对愈伤组织的芽长影响显著 (P=0.0011);内源激素含量与愈伤组织培养力相关 性分析表明,广粳 1 号愈伤组织内源 IAA、ABA 的含 量对愈伤组织诱导率有负效应(分别为 R=-0.8857, P=0.0456 和 R=-0.7024,P=0.1860),而对愈伤组织 的芽长表现出正相关性(分别为 R=0.7891,P=0.1126 和 R=0.8858,p=0.0455)。特青愈伤组织诱导率与内 源 ABA 的含量呈负相关性(R=-0.5267,P=0.3619),
表1
2,4-D (mgl·L ) 特青 Teqing 0 1.0 1.5 2.0 2.5 39.8 48.1 39.6 38.9 52.1
-1

内源 IAA、ABA、Z 对特青愈伤组织芽的生长都有促 进作用(分别为 R=0.8117,P=0.0953 和 R=0.7220, P=0.1684 以及 R=0.9699,P=0.0062)。 特青、广粳 1 号的幼胚经不同浓度 2,4-D 处理 后(表 2),同品种内的芽长和每 100 个愈伤组织培 养物的重量相差不大,但品种间差异显著(分别为 P=0.0001 和 P=0.0071)。相关性分析表明:特青每 100 个愈伤组织重量与 Z 含量负相关(R=-0.9403, P=0.0152),特青愈伤组织上的芽长与 ABA 的含量 呈正相关性(R=0.8235,P=0.0866),而与 IAA、Z 含量呈负相关(R=-0.6540,P=0.2312 和 R=-0.5671, P=0.3188);内源激素 ABA 对广粳 1 号愈伤组织培 养物重量有正效应(R=0.6096,P=0.2750),而对芽 长产生抑制作用(R=-0.7591,P=0.1367)。

2,4-D 浓度对成熟胚愈伤组织诱导的影响 The influence of different 2,4-D concentration on callus induction of mature embryos
诱导率(%) Rate of induction 广粳 1 号 Guangjing No 1 53.6 58.7 64.1 65.9 59.1 特青 Teqing 2.66 1.00 1.00 0.78 0.98 芽长 (cm) Buds length (cm) 广粳 1 号 Guangjing No 1 2.40 1.30 1.18 0.84 1.32 特青 Teqing 0.51 0.32 0.36 0.25 0.43 广粳 1 号 Guangjing No 1 0.64 0.54 0.29 0.39 0.43 特青 0.034 0.015 0.031 0.011 0.013 广粳 1 号 0.042 0.020 0.029 0.008 0.017 特青 Teqing 0.089 0.018 0.011 0.006 0.032 广粳 1 号 Guangjing No 1 0.078 0.209 0.077 0.287 0.019 Teqing Guangjing No 1 IAA (nmol·g-1) ABA (nmol·g-1) Z (nmol·g-1)

Table 1

表2
2,4-D

2,4-D 浓度对幼胚愈伤组织诱导的影响 The influence of different 2,4-D concentration on callus induction of young embryos
重(g/100 个)
-1

Table 2
(mgl·L )

芽长(cm) Buds length (cm) 特青 Teqing 0.43 0.32 0.24 0.28 0.25 广粳 1 号 Guangjing No 1 1.20 0.99 1.10 0.90 1.10

IAA(nmol·g-1) 特青 Teqing 0.47 0.96 0.91 0.54 1.19 广粳 1 号 1.00 2.22 0.32 0.29 0.51 特青

ABA(nmol·g-1) 广粳 1 号 Guangjing No 1 0.024 0.105 0.027 0.092 0.087

Z(nmol·g-1) 特青 Teqing 0.007 0.009 0.012 0.030 0.024 广粳 1 号 Guangjing No 1 0.026 0.047 0.140 0.109 0.130

Weight 特青 Teqing 广粳 1 号 Guangjing No 1 0.69 0.85 0.83 0.92 0.78

Guangjing No 1 Teqing 0.133 0.053 0.038 0.098 0.050

0 1.0 1.5 2.0 2.5

0.60 0.62 0.60 0.55 0.57

2.1.2 水平

愈伤组织诱导培养物上不同部位的内源激素 籼稻特青的成熟胚在诱导培养基上培养 6 d 后

如图 1。从图可以看出,各内源激素含量在培养物的 不同部位上存在明显的差异性:IAA 主要存在于芽中 而去除愈伤组织后的种胚中比较少,但在诱导出了愈 伤组织和未能诱导出愈伤组织的种胚中含量相差不明 显;Z 主要存在于剥离的种胚中而芽中的含量相对较 少,且在诱导出了愈伤组织的种胚中的 Z 含量远高于

按如下 4 种方式对培养物的不同部位分别取样:未能 诱导出愈伤组织的种胚、 诱导出了愈伤组织的种胚 (包 括种胚、愈伤组织及芽)、去除愈伤组织和芽后的种 胚、去除种胚和愈伤组织后的芽。测得内源激素含量

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未能诱导出愈伤组织种胚; ABA 在未能诱导出愈伤组 织的种胚中的含量高,而诱导出了愈伤组织的种胚中 的含量少且主要存在于芽中。从所测定的 3 种内源激 素的含量及分布特性可知过高的 ABA 含量对愈伤组 织的诱导不利,IAA 含量对维持较高培养力有着重要 作用, 但如果诱导愈伤组织的外植体中的 Z 含量太低, 即使有较高的 IAA 含量也不能诱导出愈伤组织, 说明 Z 含量是决定愈伤组织诱导启动与否的关键。

反应密切相关,在前期愈伤组织处于旺长期,需要较 高的 Z 以维持细胞的快速分裂,而后愈伤组织的生长 速度减缓,Z 含量相应的降低,但在愈伤组织老化过 程中会伴有长根长芽的情况,此时又需要较高含量 Z 以促进分化,30 d 以后愈伤组织褐化严重,愈伤组织 生理活性减弱, 使得各内源激素的含量都有下降趋势。

1:未能诱导出愈伤组织的种胚;2:去除愈伤组织后的种胚;3:去除 种胚后的芽;4:诱导出了愈伤组织的种胚 1: Seed embryo without induced callus; 2: Seed embryo that stripped of callus; 3: Buds; 4:Seed embryo with induced callus

图 2 继代培养不同时间愈伤组织中内源激素的含量 Fig. 2 The content of endogenous phytohormones in calli at different stages of secondary culture

2.3

抗性筛选过程中愈伤组织培养物的内源激素含 量 抗性愈伤组织的再生能力是转化频率高低的决定

图 1 诱导愈伤组织培养物的不同部位内源激素含量 Fig. 1 The content of endogenous phytohormones in different parts of inducing explant

因素, 取广粳 1 号和特青经过 14 d 抗性筛选后的愈伤 组织测定内源激素含量如图 3。ABA 含量在两种水稻 中相差不大,IAA 的含量特青比广粳 1 号多 0.0571 nmol·g-1,Z 的含量广粳 1 号是特青的 3 倍多。因此, 粳型稻广粳 1 号愈伤组织中的内源细胞分裂素类物质 Z 的含量相对较高,有利于愈伤组织的增殖与分化, 从而使得其愈伤组织的增殖和再生能力比籼型稻特青 强,该试验结果为周玲艳等 [21] 的观点提供有力佐证, 他们认为籼型稻的抗性愈伤组织再生能力比粳型稻差 是造成籼型稻比粳型稻遗传转化率低的主要原因。

2.2 愈伤组织继代过程中内源激素含量的变化 有研究表明,愈伤组织培养时间的长短对植株再 分化率有影响[20]。为了探明愈伤组织在继代培养过程 中内源激素的变化特性,在水稻品种 V20B 的成熟胚 诱导出愈伤组织后,将愈伤组织从盾片剥离进行继代 培养, 每隔 6 d 采样测得内源激素含量如图 2。 水稻愈 伤组织继代培养时,0~12 d 为快速生长期,12~24 d 生长速度变慢,部分愈伤组织还出现了长根的现象, 24 d 以后开始老化直至褐化。在此过程中,IAA 含量 在整个继代培养中始终维持较高的水平,最高值与最 低值相差不大;内源激素 ABA 含量的变化随着 IAA 的升高而迅速升高,IAA 降低时 ABA 也迅速降低, ABA 与 IAA 的 含 量 之 间 存 在 一 定 的 相 关 性 (R=0.5469,P=0.2615),罗琼等[9]认为内源 IAA 过 高影响愈伤组织培养力的表达,而 ABA 可以减小这 种不利影响。Z 含量在前期呈上升趋势,第 18 天时达 到最高值,而后急剧下降,第 24 天时达到较低值,但 在第 30 d 时又有所回升,而后又急剧下降,Z 含量的 变化幅度与趋势和此时愈伤组织正在进行的生理生化

图 3 筛选培养中的愈伤组织内源激素的含量 Fig. 3 The content of endogenous phytohormones in calli after selective culture

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2.4 愈伤组织分化培养过程中内源激素水平 水稻品种 V20B 成熟胚的愈伤组织进行分化培 养,每隔 3 d 采样,测得内源激素含量如图 4。愈伤组 织分化时首先形成大量的幼芽,随后芽生长成为小植 株。 IAA 在整个分化过程中都保持较高的水平, 0~9 d 含量逐渐增高,第 9 d 达到最高值,以后随着培养时 间的延长,IAA 的含量呈递减的趋势,这与已报道
[22]

可能起着主导作用;Z 含量呈先升后降的趋势,在第 12 天时达到最大值, 此时正是愈伤组织分化最强的时 期,表明内源细胞分裂素的高低是影响愈伤组织分化 成芽的重要因子;在愈伤组织分化的前期,ABA 含量 逐渐降低,而在第 9~12 天时急剧升高,随后又急剧 下降,其间 ABA/IAA 相对比值变化趋势在 0~9 d 逐 渐降低, 9~12 d 时上升至高峰, 此时正是幼芽大量分 化时期,说明较高的 ABA/IAA 相对比值有利于愈伤 组织分化形成芽。

的大豆愈伤组织分化时观察到的结果完全一样,说明 内源 IAA 水平与愈伤组织的分化和发育紧密相关, 并

图4 Fig. 4

愈伤组织分化培养过程中内源激素含量

The changes of endogenous phytohormones in calli during differential induction

3

讨论
水稻愈伤组织的诱导率和质量除了与品种基因型

罗琼等[9]发现内源生长素的含量相对于内源分裂 素过高的水稻品种的愈伤组织培养力较差,在培养基 中增加外源 KT 浓度后其培养力后有所提高,说明可 以通过植物生长物质的调整,协调内源激素间的不平 衡性而提高培养力,特别是对于那些难培养的或培养 力低的材料通过比较其与高培养力的材料之间在内源 激素上的差异,通过植物生长物质类的调整有可能获 得新的突破。本试验中不同基因型的籼型稻特青和粳 型稻广粳 1 号之间, 以及同属于籼型稻不同品种 V20B 与特青的相同外植体间内源激素含量相差都很大,意 味着在遗传转化时根据试验材料自身的内源激素含量 水平有针对性的加入不同类型及配比的外源生长物质 有可能获得较高的遗传转化率,是否可行还有待进一 步的研究。 目前,水稻特别是籼型稻的遗传转化受愈伤组织 胚性差、再生不良等问题的困扰,Abe 等[27]发现水稻 成熟胚的愈伤组织生长和再生分别由不同的基因控 制。只有借助于生物工程等技术对控制水稻愈伤组织 的诱导、分化、发育等相关基因的结构、功能进行深 入研究,阐明其作用机理,才能找出问题所在。

有关外,还与不同培养基成分尤其是添加外源生长物 质的种类和配比有关
[1,23,24]

。研究表明,在外植体分化
[25,26]

与脱分化过程中,内源激素的变化趋势与使用的外源 生长物质的种类和含量有一定的相关性 。因此, 探讨水稻愈伤组织生长发育过程中各内源激素变化规 律及互作关系,可为水稻遗传转化中有针对性地使用 外源生长物质提供依据。 水稻遗传转化过程中,各内源激素有着不同的作 用:IAA 主要存在于愈伤组织的芽中而剥离后的种胚 中比较少, 且过高的 IAA 不利于愈伤组织的诱导和生 长, 可以通过 ABA 来消除它的不利影响; 主要存在 Z 于诱导愈伤组织的种胚中, 有促进分裂和生长的作用, 对愈伤组织诱导时的启动有决定性作用,如果外植体 中的 Z 含量太低, 即使有较高的 IAA 也不能诱导出愈 伤组织,籼稻愈伤组织在抗性筛选后愈伤组织中 Z 含 量偏低可能是造成籼稻转化率不高的原因之一,过高 的 ABA 对愈伤组织的诱导不利,但在继代培养时适 量升高 ABA 有利于胚性愈伤组织的形成,愈伤组织 分化时较高的 ABA/IAA 相对比值有利于芽的形成。

4

结论

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内源激素对水稻遗传转化愈伤组织的生理状态有 着极其重要的影响,愈伤组织的诱导、继代、抗性筛 选、分化等阶段中 IAA、ABA、Z 3 种激素的含量和 所起的作用各不相同,各内源激素的含量和协调平衡 对水稻愈伤组织形成与分化有着决定性的作用。在培 养基中添加 2,4-D 等生长调节剂类物质对水稻愈伤 组织中的质量、内源激素含量和遗传转化效率有一定 的影响。
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(责任编辑 赵利辉)


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