当前位置:首页 >> 农林牧渔 >>

跑胶银染


琼脂糖电泳步骤之超级基础篇 一,电泳前准备 准备内容 作用 1.刷干净电泳制胶的梳子,板子,槽子,蒸馏水洗净晾干 防止不必要的重复污染,减少外来的污染.梳子干净有利于梳孔的形成. 2.检查电泳槽,根据情况更换 buffer 排除电泳槽的电极接触不良,确保 buffer 的缓冲能力,减少污染. 3.根据 DNA 的分离范围选择合适的胶浓度并记录 达到较好的分离效果,防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间. 4.计算 agarose 的用量和制胶 buffer 的用量记录,胶最终越薄越好. 实验记录备查 二,制胶 步骤 注意事项 1.称量 agarose 和 buffer Buffer 不要用成 H2O,称量相对准确 2.融胶,加热到胶产生大量的气泡时,拿出摇匀,继续加热到完全溶解,拿出摇匀,再加热 到沸腾. 非常热,小心烫手,另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子.因此注意选择起码为胶体积 2 倍以上的瓶子. 保证胶混匀和完全溶解, 减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果. 3.倒胶,可用水浴的办法使胶冷却到 60 度左右,即手可以握住瓶子的温度,沿着制胶板的 一侧,缓缓地一次性倒入.梳子最好是预先放好并固定的,注意梳孔的体积能点的下所有的 样.用枪头赶掉气泡.

制胶的桌面相对水平.倒胶时尽量减少气泡的产生.EB 如果在制胶时加入,在 60 度左右 时加入,使终浓度为 0.5ug/ml.不宜过低,染色成像不明显;不宜 1)银染序列 DNA 测序系 统有什么组分? 银染序列 DNA 测序系统(目录号 Q4130)的所有试剂可作 100 次测序反应, 可对 10 块测序胶 作银染.系统还包括 pGEM-3Zf(+)质粒模板和 pUC/M13 顺向引物作为正对照.系统所含的 组分可在银染序列 DNA 测序系统技术手册 TM023 中查阅.

2)银染序列 DNA 测序系统和染色试剂是分开提供的吗? 银染序列 DNA 测序系统和染色试剂可分开定购.目录号 Q4131 所提供的所有试剂可作 100 次测序反应,并包括正对照模板和引物,目录号 Q4132 所提供的所有试剂可对 10 块测序胶 作银染.

3)银染序列 DNA 测序系统的染色试剂能同其它系统的测序试剂一同使用吗? 银染序列 DNA 测序系统的染色试剂和银染序列 DNA 测序试剂一同使用,不能和其它系统 的测序试剂一同使用.

4)用银染序列 DNA 测序系统需要额外的装备吗? 额外的装备包括: 热循环仪,SigmaCote 溶液(Sigma 目录号 SL-2),无核酸酶的纯水(目录号 P1193), 冰 乙酸,震荡器和旋转平台,比测序胶大的聚乙烯盒.

5)银染序列 DNA 测序系统用的是什么类型的测序方法? 银染序列 DNA 测序系统是一个热循环测序系统. 它用 TaqDNA 聚合酶在高温下加入核苷酸. 测序反应用 pmol-fmol 量的 DNA(10(-12 次方)-10(-15 次方)),单链模板特异引物, 优化的脱氧和双脱氧核苷酸混合物, 测序级的 TaqDNA 聚合酶. 反应随后在 95oC 变性, 42-70 oC 的温度下引物退火/延伸,循环 45-60 次.产物在普通测序胶上分离后,用银染试剂染色.

6)银染序列 DNA 测序系统中用的热循环仪有哪些优点? 与普通测序系统比有几个优点:

A) 得率:热循环测序可得到模板 DNA 的线型扩增.用少量的初始材料所得的产物用银染 技术得到可辩的序列梯度.依据模板类型,每一次测序反应用 0.03-2pmolDNA. B) 疑难模板:热循环测序可测具有次级结构的疑难模板,如 PCR 产物,lambdaDNA 和其 它具大量次级结构的模板. 热循环测序所用的较高温度可使次级结构变构, 以免干扰延伸和 伸延.热循环测序所用的较高退火温度提高了引物杂交的紧密度,并降低了背景信号. C) 无碱变性步骤:热循环测序的另一个优点是,95oC 的变性步骤可免去碱变性步骤.

7)银染序列 DNA 测序系统比放射同位素方法有哪些优点? 优点有: A) 安全:银染序列 DNA 测序系统完全是非放射的,比常规的放射同位素方法有效,无需 放射废物处理. B) 快速:一天即可得到结果.放射同位素方法通常需要 1-2 天的曝光时间. C) 省费:省去放射同位素的购买和处理费.

8)银染序列 DNA 测序系统和 fmolDNA 测序系统比有哪些差别? 银染序列 DNA 测序系统和 fmolDNA 测序系统均是热循环测序系统. 银染序列 DNA 测序系 统较 fmolDNA 测序系统每条带的 DNA 得率高.与放射自显影相比,银染产生信号所需的 DNA 的量更多.fmolDNA 测序系统所得的延伸产物不能用银染染色观察.

9)银染序列 DNA 测序系统和其它非放射同位素测序系统比有哪些不同? 其它手功非放射同位素测序系统需要将修饰的测序引物掺入到延伸产物中作检测. 常用的修 饰包括生物素和地高辛标记. 这些系统要求在对测序梯度作检测前, 要将测序胶转移到膜上, 测序梯度用化学发光和颜色反应检测. 相反, 银染序列 DNA 测序系统用非修饰的测序引物. 这省去购买或合成修饰的引物,测序梯度的检测不需作转移,转移大而薄的测序胶很困难, 膜也很贵.在银染序列 DNA 测序系统中,银染时胶附在玻璃板上.少的操作意味着减少检 测时间.在电泳后 90 分钟可读序列.用荧光标识进行的自动测序也是一种非放射同位素测 序法.但仪器和试剂的花费贵.银染序列 DNA 测序系统相比较而言较适用.

10)银染序列 DNA 测序系统所用的酶的性质如何?

银染序列 DNA 测序系统使用 Promega 专利化的测序级 Taq 聚合酶, 修饰过的 Taq 聚合酶在 SDS-PAGE 上的分子量为 80,000 道而顿,而全酶的分子量为 94,000 道而顿,并有低的 5`-3`外切核酸酶活力.测序级 Taq 聚合酶产生均匀强度的带型,背景低,准确度高.每一 批号的酶的品质在热循环仪上用 fmol DNA 测序系统确认. 每一次酶制剂均检测非特异的核 酸酶和 TaqI 限制性内切酶污染.

11)一次测序反应能测多少个碱基? 标准反应所得的序列梯度的长度为 500 个核苷酸. 但要读出这个长度的核苷酸, 需作多次加 样.每一次加样能读的序列数决定于所用的测序胶装置,和染色的强度.每一次加样可读 100-150 个核苷酸, 每一次实验可读 300-450 个核苷酸. 为了读更多的核苷酸, APC 胶片. 用

12)银染序列 DNA 测序系统的出错率是多少? 热循环测序不产生高的出错率.DNA 测序梯度代表所有单个引物-延伸反应,单个反应的出 错率在许多百万次的反应中被大大掩盖.

13)能用什么类型的 DNA 模板? 银染序列 DNA 测序系统所用的模板包括 PCR 产物,ssM13 或噬菌粒 DNA,lambdaDNA, 质粒 DNA, 用普通方法制备的模板适用于这一系统.Promega 提供一系列的 DNA 纯化产 品可免去有机溶液抽提,乙醇沉淀.所有 Wizard 和 Wizard plus DNA 纯化系统所得 DNA 纯 度好,可用于制备测序级的模板.染色体 DNA 不能作为模板,随着模板长度的增加,非特 异引物结合和自配引物结合增加.

14)用多少模板 DNA? 模板的量取决于模板的长度(类型)而异 200bp(PCR 产物), 16ng(120fmol) 3,000-5,000bp (超螺旋的质粒 DNA), 2-4ug(1-2pmol) 48,000bp (lambdaDNA), 1ug(31fmol) dsDNA: ng 模板= fmol 模板 X6.6X10(-4 次方)XN, N 是模板的碱基数

ssDNA: ng 模板= fmol 模版 X3.3X10(-4 次方)XN, N 是模板的碱基数

15)为什么用超螺旋质粒 DNA 的量多于其他模板的量? 超螺旋的质粒 DNA 用加热很难变性,增加质粒的量有助于使引物退火到变性的模板上.

16)应用什么类型的引物? 银染序列 DNA 测序系统用非修饰的引物.为获得好的结果,用的引物的长度应不短于 24 个核苷酸,GC-含量约为 50%.通常,更长的引物和 GC-含量高的引物使信号更清楚,这类 引物的退火温度更高,需增加引物杂交的紧密度,来降低模板次级结构,抑制链的再退火. 短的引物则需对退火温度作相应的调整.

17)应用什么退火温度? 退火温度是用热循环仪测序的最关键的因素. 高的退火温度增加引物杂交的紧密度, 降低次 级结构,抑制链的再退火.因此应用尽可能高的退火温度.对于不短于 24 个核苷酸的引物, 或短的 GC-含量接近或大于 50%的引物,用 70oC 作为退火温度.短于 24 个核苷酸的引物 或引物的 GC-含量小于 50%,用 42 oC 作为退火温度.依据每个引物的长度和 GC-含量,退 火温度应作进一步优化.应用尽可能高的退火温度.在银染序列 DNA 测序系统技术手册中 讨论了退火温度和热循环的设计.

18)对照反应的循环参数是多少? pUC/M13 顺向引物作对照实验,引物长度为 24 个核苷酸,用热循环设计程序 2,在 70oC 退火/延伸 30 秒.

19)用多少量的引物? 4 次测序反应中的每一个反应用 4.5pmol 引物.将 pmol 换算成 ng 的式为:pmol X N X 330pg/pmol X 1ng/103 pg =ng,N 为引物长度的核苷酸.

20)银染的机制是什么?

银离子和 DNA 相互作用的化学原理发表在:Bloomfield VA, Crothers,DM, and Tinoco,IJr (1974)Physical Chemistry of Nucleic Acids, Harper and Row, Publlishers, New York, P422. 通常银染序列 DNA 测序系统所用的银染方法简单,只需几步.电泳后,在醋酸中固定测序 胶除去电泳液和凝胶中的尿素,并防制小的延伸产物的扩散.换几次蒸馏水除去固定剂.胶 在硝酸银和甲醛中染色.在染色后,将凝胶用水清洗,在含甲醛和硫代硫酸钠的碱性碳酸钠 溶液中显色.甲醛将银离子还原为金属银.硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银,否则 会增加背景.在显色一定的时间后,用水清洗一下,在空气中干燥.

21)推荐用什么类型的测序胶? 用 4-6%的聚丙烯酰胺凝胶 (19:1 丙烯酰胺:双叉丙烯酰胺) 厚度为 0.4mm.胶薄于 0.4mm 所得信号弱,胶厚于 0.4mm 或更高浓度的胶需用更长的处理时间.厚而高浓度的凝胶在干 燥中容易裂.不用楔型胶,它们染色不均匀.

22)玻璃板应如何处理? 与放射自显影相反,银染胶在处理过程中一面附着在玻板上.为此,一玻板必需用如 SigmaCote 的试剂作硅化处理使胶易脱离,另一玻板用硅烷液作硅烷化处理使胶易附着.银 染时测序胶附着在长的玻板上,不一定每次用 SigmaCote 试剂对玻板作硅化处理, 另一玻板 却每次需用硅烷液作硅烷化处理.GelBond 膜干扰胶的染色,不能用.

23)成功银染的关键因素是什么? 成功银染的关键因素包括: A) 用超纯水(比如,NANOpure 或 Milli-Q 纯化)或者是双蒸水作银染 B) 用提供的碳酸钠或者 ACS 试剂级的碳酸钠 C) 在染色后,水清洗所用时间的长短很重要,用不超过 5-10 秒的时间清洗胶,然后放入 显色溶液中,一般在水里浸一下就好. D) 甲醛和硫代硫酸钠(400ul/1ml)在使用前,及时加入到显色液中. E) 在使用前及时配染色液.

24)如何获得测序数据的永久拷贝?

要获得测序数据的永久拷贝,应用银染序列自动处理兼容相片(APC)(目录号 Q4411, Q4412).APC 相片是正片,在白的不透明的背景下留下原胶的像.使用方法简单,只需 APC 相片和白色的荧光光箱.一般的曝光时间为 1-2 分钟.不用垂直光使 APC 曝光.可用 手功或自动洗相机冲洗 APC 相片.可在银染序列 DNA 测序系统技术手册 TM023 中查寻到 更多的相关资料.

25)染色效果弱,如何加深带型的颜色深度? 用 APC 相片的优点是可在正像上加深银染带型的颜色.银染序列 DNA 测序系统技术手册 TM023 对测序和银染反应中出现的疑难问题给出了详细的解答.

26)还有什么有关的参考资料? 公司免费提供的资料包括银染序列 DNA 测序系统技术手册 TM023,操作录像. 过高,导致背景太深.摇匀要沿着瓶壁摇动,尽量减少气泡产生的可能性.高浓度胶例如 2%以上的 EB 很难摇匀,而且凝的速度也相对快,强烈建议跑完胶之后再用 EB 染色.

4.室温凝胶 30 分钟 过程中不要碰到梳子,尽量保持胶的位置不移动.时间不宜过久,导致胶干燥变形;不宜 过短,影响胶内部孔径形成.

5.拔梳子,放入电泳槽. 缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出,尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的.暂时不用的胶最 好放入电泳槽电泳液中浸泡.电泳液要浸没胶至少 1mm.

三,上样电泳

步骤

注意事项

1.样品中加入 loading buffer 使其终浓度为 1 X,混匀 Loading buffer 浓度不宜过低,点样时样品不能很好的沉在胶孔里;不宜过高,电泳时容易 形成带形的变形.注意混匀.

2.点样 沿着胶孔的边缘匀速加入.尽量避免碰坏胶孔.枪头不要吸过多的气泡,拔起时不要过猛 带出样品.每点一个样完,吸取 buffer 洗枪头,避免样品混杂.如果是有特殊要求,例如回 收,强烈建议每点一个样换一次枪头.加样的速度当然是越快越好,注意保证质量.点样的 量不要太大,一方面是体积不要太大,溢出污染邻位样品;一方面量不要太大,容易导致脱 尾和模糊不清.

3.接通电源,选择合适的电压和时间电泳. 胶孔与电极成水平状态,防止样品跑歪.跑胶期间不时回来看看,防止样品跑出胶等意外 发生.

四,染色成像

步骤 注意事项

1.染色 如果胶中没有加入 EB,用 0.5ug/ml 的 EB 溶液浸染 30 分钟.

2.调整镜头的拍摄范围和焦距,成像

3.打印照片做分析记录

PCR 扩增产物的电泳分析
凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种.

一,琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便,快速,最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖 是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度, 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低 熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为 62~65℃, 溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时, 主要 用于 DNA 片段的回收,质粒与外源性 DNA 的快速连 接等. (一)凝胶浓度 一 凝胶浓度 凝胶浓度的选择依 DNA 分子的大小而定. 琼脂糖凝胶的浓度与 DNA 分离范围

琼脂糖浓度(%) 0.3 0.6 0.7 0.9

线型 DNA 分子的分离范围(Kb) 5~60 1~20 0.8~10 0.5~7

1.2 1.5 12.0

0.9~6 0.2~3 0.1~2

(二)电泳缓冲液 二 电泳缓冲液 核酸电泳缓冲液有三种,即 Tris-硼酸(TBE),Tris-乙酸(TAE)和 Tris-磷酸(TPE).TBE 与 TPE 缓冲容量高,DNA 分离效果好,但 TPE 在 DNA 片段回收时含磷酸盐浓度高,容易使 DNA 沉淀.TAE 缓冲容量低, 但价格较便宜, 因而推荐选用 TBE.缓冲液中的 EDTA 可螯合 二 价阳离子,从而抑制 DNA 酶的活性,防止 PCR 扩增产物降解. 10XTBE 缓冲液的配制 Tris 碱,108 克 EDTA,9.3 克 硼酸,55 克 H2O 至,1000ul (其 PH 应为 8.0~8.2) 临用时用水稀至 0.5XTBE(20 倍稀释. (三)核酸电泳的指示剂与染色剂 三 核酸电泳的指示剂与染色剂 1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色,在

0.6%,1%,1.4%和 2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移

率分别与 1Kb, 0.6Kb,0.2Kb 和 0.15Kb 的双链线性 DNA 片段大致 相同.二甲苯青的水溶液呈兰色,它在 1%和 1.4%琼脂糖中电泳时, 其迁移速率分别与 2Kb 和 1.6Kb 的双链线性 DNA 大致相似.
指示剂一般与蔗糖,甘油或聚蔗糖 400 组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样 品密度,使其比重增加,以确保 DNA 均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指 示 带,可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色,使加样操作更方便. 染色剂:核酸电泳后,需经染色后才能显现出带型,最常用的是溴化乙锭染色法,其 次 是银染色.

溴化乙锭(ethidium bromide, EB)是一种荧光染料, 分子可嵌入核酸双链的碱基对 之 EB 间,在紫外线激发下,发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml 的 EB, 有时亦可在电泳后, 将凝胶浸入该浓度的溶液中染色 10~15min.琼脂 糖凝胶 EB 染色, 肉眼可见核酸电泳带,其 DNA 量一般>5ng,当溴化乙锭太多,凝胶染 色过深,核酸电泳 带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡 30min 后再观察.

银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合 物,然后用还原剂如甲醛 使 Ag+还原成银颗粒,可把核酸电泳 带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂 糖凝胶染色.其灵敏度比 EB 高 200 倍.但银染色后,DNA 不宜回 收.
(四)电泳 四 电泳 1.电泳装置: 电泳装置主要有电泳仪,电泳槽及灌胶模具等. 2.电泳方法: (1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上,并架好梳子. (2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶, 一般 200~400bp 的 DNA 片段, 可配制 1.2~1.7%浓度的琼脂糖用于电泳. 3.配制 0.5XTBE 电泳缓冲液 100ml 于三角烧瓶中,称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水 锅 或微波炉内加热熔化.冷却至 60℃(需要时可加入溴乙锭),倒入电泳槽中,待凝固. 4.向电泳槽中倒入 0.5XTBE,其量以没过胶面 2mm 为宜,小心移去梳子.如样品孔内有 气泡,应设法除去. 5.在 DNA 样品中加入 0.2 体积的载样缓冲液,混匀后,加入样品孔内.

6.接通电源, 一般红色为正极黑色为负极, 切记 DNA 样品由 负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负).电压为 1-5V/cm(长度 以两个电极之间的距离计算).

7.根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳.一般 200~400bp 的 PCR 产物 50V 电压, 电泳 20~40min 即可. (3)溴化乙锭染色后,紫外仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准比较被扩 增 产物的大小.

二,聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质,小于 1Kb 的 DNA 片段和 DNA 序 列分 析.其装载的样品量大,回收 DNA 纯度高.长度仅相差 0.2%(即 500bp 中的 1bp)的核苷 酸 分子即能分离. 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,在催化剂 TEMED(N,N,N,N'一四甲基乙二胺) 和 过硫酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,N,N'一亚甲 双 丙烯酰胺参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶. 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的,不同浓度丙烯酰胺和 DNA 的 有效分离范围见表 2.

丙烯酰胺(%)

有效分离范围 (bp) 100~2000 80~500 60~400 40~200 25~150 10~100

溴酚兰*

二甲苯青*

3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0

100 65 45 30 15 12

460 260 160 70 60 45

*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链 DNA 分子所含碱基对数目(bp). (一)材料 一 材料 1.电泳仪器:电泳仪,垂直电泳槽及其附件. 2.30%丙烯酰胺 丙烯酰胺,29 克 N,N'一亚甲基双丙烯酰胺,1 克

H2O,加至 100ml 装于棕色瓶内,4℃可保存二个月. 3.10%过硫酸铵 过硫酰铵,1 克 加水至,10ml 4℃可保存一周,-20℃可保存一个月. 4.1XTBE 电泳缓冲液 5.TEMED(四甲基乙烯基二胺) (二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 二 聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 根据分离 DNA 片段的大小及需凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶. 1.按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用 1%的琼脂 糖封边,防止封闭 不严而使聚丙烯酰胺液漏出. 2.将装好的玻璃电泳板倾斜成 45~60℃角. 3.按表 3 配制所需%浓度凝胶的毫升数. 4.加入 TEMED 后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液 体接近溢出时 为止. 5.立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力 的夹将梳子夹在一 边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使 成 10°角,可减少液体泄漏的机会. 6.室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入 0.1XTBE 缓冲液. 7.小心取出梳子,立即用缓冲液冲洗加样孔,因为梳子取出后,梳 子上吸附的及凝胶 顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合,产 生不规则的表面,将导致以后 DNA 电泳 带型不规则. 8.将 DNA 样品与适量的载样缓冲液混匀后,加到样品孔内,加样时不 要产生气泡. 9.接好电极,电压为 1-8V/cm,进行电泳. 10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.

11.电泳毕,切断电源,弃去电泳仪,取出胶床板,小心移去一块玻 璃板,让凝胶吸附 在另一块玻璃板上.浸入含 0.5ug/ml 的溴化乙锭溶 液中,15~30min 后取出水洗紫外仪下观 察结果. 12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng 以上量的 DNA 条带.要求更高 的灵敏度,可用 银染 第十章 测序技术
在分子生物学研究中,DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础.目前用于测序的技术 主要有 Sanger 等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam 和 Gilbert(1977)发明的化学降解法. 这二种方法在原理上差异很大, 但都是根据核苷酸在某一固定的点开始, 随机在某一个特定的碱基处终止, 产生 A,T,C,G 四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的 PAGE 胶上电泳进行检测,从而获 得 DNA 序列.目前 Sanger 测序法得到了广泛的应用. Sanger 法测序的原理就是利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物. 直到掺入一种 链终止核苷酸为止.每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷 酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP).由于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基 团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G,A,T 或 C 处终止.终止点由反应中相应的双脱氧而定.每一种 dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物.它们具有共同 的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后 可用 X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测.

第一节 非同位素银染测序系统操作技术
一,概述: 概述: Promega 公司的 SILVER SEQUENCETM DNA 测序系统是一种无放射性的序列分析系统,它通过灵 敏的银染方法检测凝胶中的条带. 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速,廉价的替代方法. 测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经 90 分钟就可读序,这是常规的放射性测序法做不到的. 此 外, SILVER SEQUENCETM 系统用未修饰的 5'OH 寡聚核苷酸作为引物, 减少了特殊修饰寡聚核苷酸的 花费.该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作,也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂.另 外,也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带. Taq DNA 聚合酶在 95℃时极强的热稳定性.本系统利用的测序级 Taq DNA 聚合酶是一种 Taq DNA 聚合酶的修饰产品,对于双链 DNA 模板有非常好的效果,具有高度的准确性,能产生均一的条带,且背 景低. SILVER SEQUENCETM 系统包含被修饰的核苷酸混合物,如 7-去氮 dGTP(7-deaza dGTP,或 dITP)替代 dGTP 可清除由 GC 丰富区域所引起的条带压缩现象. 退火温度是热循环测序中最重要的因素.高退火温度可减少模板二级结构.提高引物结合模板配对的 严谨性.链重退火和模板二级结构则限制了小片断 PCR 产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力.引物 延伸起始于每个循环的退火阶段.在较低温度时,聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域,它可导致聚合 酶解离.则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带.因为这些原因,应该使用尽可能高的退火温度.对 于有牢固二级结构的模板建议使用 95℃变性,70℃退火/延伸的循环模式.一般来说,较长的引物及 GC 含量高的引物能得到较强的信号.实验结果表明,>24mer 的 GC 含量约为 50%的引物可得到最佳结果. 由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处:(1).本方法线性扩增模板 DNA 产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带, 测序反应需要 0.03--2pmol 模板 DNA, 随模板种类而

定. (2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链 DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程, 变性循 环也有助于消除由于线性 dsDNA 模板(如 PCR 反应产物)快速重退火所引起的问题.(3). 高温聚合酶反应 减弱了 DNA 模板的二级结构,允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域. 二,材料 待测已提纯的 DNA,可为单链,也可为双链. 三,设备 高压电泳仪,测序用电泳槽,制胶设备,PCR 仪. 四,试剂 (1)SILVER SEQUENCETM DNA 测序试剂盒. (2)丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液(38%丙烯酰胺 W/V,2%甲叉双丙烯酰胺 W/V):95g 丙烯 酰胺,5g 甲叉双丙烯酰胺溶于 140ml 双蒸水中,定容至 250ml,0.45mm 过滤器过滤后,贮于棕色瓶中, 置于 4℃冰箱可保存 2 周. (3)10%过硫酸铵,0.5g 过硫酸铵溶于 4ml 水中,定容至 5ml,应新配新用. (4)10×TBE 缓冲液(1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸,10mmol/L EDTA): 121.1g Tris,51.35g 硼酸, 3.72g Na2 EDTA 2H2O,溶于双蒸水中定容至 1 升,置于 4℃下可贮存 2 周,其 pH 约为 8.3. (5)TBE 电极缓冲液:10×TBE 缓冲液稀释至 1×TBE 备用. (6)TEMED (7)固定/停止溶液:10%冰醋酸(V/V)配制 2 升备用. (8)染色溶液:硝酸银 2 克,甲醛 3ml,溶于 2 升超纯水中备用. (9)显影溶液:60 克碳酸钠(Na2CO3)溶于 2 升超纯水中,使用前加 3ml 37% 甲醛和 40ml 硫代硫 酸钠溶液(10mg/ml). (10)95%乙醇. (11)0.5%冰乙酸. (12)Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2). 五,操作步骤: 操作步骤: 成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑.银染不如放射性检测法灵敏,而需要 更多的模板量,此外,也不可能通过延长 X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度.因此,请使用推荐的 DNA 模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性,并且注意如下几点: (1) DNA 的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量 DNA 一起电泳. (2) 分光光度法对于很多 DNA 提取物包括质粒小量制备来说,并不能给出一个可信的 DNA 浓度 估计,混杂的染色体 DNA,蛋白,RNA,有机物及无机化合物均可能有 260 nm 光吸收.因此,分光光度 法常常错误地高估 DNA 浓度. (3) DNA 制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸,虽然它们在电泳后 DNA 样品的前面, 并不能观察到,但它们仍会有 260nm 光吸收.

×(一)测序反应: 测序反应:
1. 对于每组测序反应,标记四个 0.5ml eppendorf 管(G,A,T,C).每管加入 2ml 适当的 d/ddNTP 混 合物(d/ddNTP Mix).各加入 1 滴(约 20ml)矿物油,盖上盖子保存于冰上或 4℃备用. 2. 对于每组四个测序反应,在一个 eppendorf 管中混合以下试剂: (1) 样品反应: 质粒模板 DNA 2.1pmol 5×测序缓冲液 5ml 引物 4.5pmol 无菌 ddH2O 至终体积 16ml

(2)对照反应 pGEM-3Zf(+)对照 DNA(4mg) 5×测序缓冲液 5ml pUC/M13 正向引物(4.5pmol) 3.6ml 无菌 ddH2 O 至终体积 16 ml 3. 在引物/模板混合物(以上第 2 步)中加入 1.0ml 测序级 Taq DNA 聚合酶(5u/ml).用吸液器吸动几次 混匀. 4. 从第 3 步的酶/引物/模板混合物中吸取 4ml 加入每一个 d/ddNTP 混合物的管内. 5. 在微量离心机中离心一下,使所有的溶液位于 eppendorf 管底部. 6. 把反应管放入预热至 95℃的热循环仪,以[注意]中循环模式为基准,开始循环程序.对于每个引 物/模板组合都必须选择最佳退火温度.下列程序一般能读出从引物开始 350 碱基的长度. 7. 热循环程序完成后,在每个小管内加入 3l DNA 测序终止溶液,在微量离心机中略一旋转,终止 反应. [注意 1,测序所用模板 DNA 的量一般按下面要求加入: 注意] 注意 模板种类/长度 200bp (PCR 产物) 3000-5000bp(超螺旋质粒 DNA) 48000bp(λ,粘粒 DNA) 模板量 16ng(120fmol) 4mg (2pmol) 1mg(31fmol) 4.0ml

由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链 DNA 弱,因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比 其它模板大一些. 2,计算与 4.5pmol 相当的引物纳克数可用以下一般公式: 4.5pmol=1.5ng×n,其中 n 为引物碱基数 计算与 1pmol 相当的引物微克数可用以下一般公式: dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中 n 为模板碱基对数 ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中 n 为模板碱基数 3,为阻止 Taq DNA 聚合酶延伸非特异性退火引物, 热循环仪必须预热至 95℃.温度变换应越快越 好.下面的循环时间不包括变温时间.如果你无法确定使用何种模式,建议从模式 1 开始. 模式 1:适用于引物<24 碱基或 GC 含量<50% 95℃ 2 分钟.然后: 95℃ 30 秒(变性), 42℃ 30 秒(退火), 70℃ 1 分钟(延伸). 模式 2:适用于≥24 碱基或略短的 GC 含量≥50%的引物. 95℃ 2 分钟, 然后: 95℃ 30 秒(变性), 70℃ 30 秒(退火/延伸). 4. 在加入终止溶液之后样品可在 4℃保 存过夜. (二) 测序凝胶板的制备 , 1,玻璃板的处理: ,玻璃板的处理: 银染测序的玻璃板一定要非常清洁,一般先用温水和去污剂洗涤,再用去离子水冲洗玻璃板,除去残 留的去污剂,最后用乙醇清洗玻璃板.玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色). 短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上. 这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关 重要. (1)短玻璃板的处理 A. 在 1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入 5ml 粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液.

B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都 必须擦拭. C. 4-5 分钟后, 用 95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭. 重复三次这一清洗过程, 每次 均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液. [注意 1. 在 95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附. 注意] 注意 2. 准备长玻璃板之前要更换手套,防止粘染粘合硅烷. 3,防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂. (2),长玻璃板的处理 A. 用浸透 Sigmacote 溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板. B. 5-10 分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的 Sigmacote 溶液. [注意 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去.玻璃板须用去污剂完全清洗.或 注意] 注意 者凝胶用 10% NaOH 浸泡后除去. 为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具 分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰. 2,凝胶的制备: ,凝胶的制备: (1)玻璃板经粘合硅胶和 Sigmacote 处理后,即可固定玻璃板.该方法是用 0.2mm 或 0.4mm 厚的边 条置于玻璃板左右两侧,将另一块玻璃板压于其上.在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘,用夹 子固定住. (2)根据所需要的凝胶浓度,按下表制备测序凝胶,一般 6%-8%的胶浓度可获得较好的结果.配制 过程中,先用适量双蒸水溶解尿素,再加入 Acr&Bis 和 10×TBE 缓冲液,再用双蒸水调终体积至 99.2ml, 并用 0.45mm 的滤膜过滤,然后加过硫酸铵和 TEMED.溶解尿素时不必加热.如果确需加热则应等溶液 完全冷却后,方可加入 TEMED 和过硫酸铵.一般在胶灌制后 4-6 分钟,即开始聚合,如果聚合不好,则 应使用高浓度的 TEMED 和过硫酸铵. 凝胶终浓度 3 尿素(g) Acr&Bis(ml) 10×TBE 缓冲液(ml) 双蒸水(ml) 10%过硫酸铵(ml) TEMED(ml) 42.0 7.5 10.0 47.5 0.8 87 4 42.0 10.0 10.0 45.0 0.8 80 5 42.0 12.0 10.0 43.0 0.8 80 6 42.0 14.5 10.0 40.5 0.8 80 8 42.0 20.0 10.0 35.0 0.8 80 12 42.0 30.0 10.0 25.0 0.8 70 16 42.0 40.0 10.0 15.0 0.7 47 18 42.0 50.0 10.0 5.0 0.7 40?

(3)胶配制好后,即可灌制胶板.一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中,倒完后,静 止放置使之聚合完全. [注意 1,使用夹子固定玻璃板时,最好夹子的力量稍大一些,防止因力量不足使灌胶的过程中出现 注意] 注意 漏胶液现象. 2,灌制凝胶的过程中要严防产生气泡,否则影响测序的结果. (三)电泳: 1,预电泳 (1)当凝胶聚合完全后,拨出鲨鱼齿梳,将该梳子反过来,把有齿的一头插入凝胶中,形成加样孔. (2)立即将胶板固定在测序凝胶槽中,一般测序凝胶槽的上下槽是分开的,因而只有在固定好凝胶 板后,方能加入 TBE 缓冲液. (3)稀释 10×TBE 缓冲液至 1×TBE,将该缓冲液加入上下二个电泳槽中,去除产生的气泡,接上电 源准备预电泳. (4)有些电泳槽,如 LKB 的 Macrophor 等是使用水浴加热的,则应先将水浴加热至 55℃后进行预

电泳.有的不使用水浴加热,依靠电泳过程中自身产生的热进行保温,如上海求精有机玻璃仪器生产的测 序电泳槽,这种槽需夹上二块散热铝板,使整个凝胶板的温度一致. (5)按 30V/cm 的电压预电泳 20-30 分钟.预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子,同时使凝胶板达到 所需的温度.高温电泳可防止 GC 丰富区形成的发夹状结构,影响测序的结果. [注意 注意] 注意 (1). 用鲨鱼齿梳制作加样孔时,应注意将齿尖插入胶中 0.5mm 左右,千万注意不能使加样孔渗漏, 否则得不到正确的结果. (2). 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏,否则极易造成短路而损坏电泳仪. 2,样品的制备: 当在预电泳时,即可进行样品的制备,将 pcr 反应完毕的样品在沸水浴中加热 1-3 分钟,立即置于冰 上即可. 如果样品长时间不用, 则应重新处理. 可使用 4-6%聚丙烯酰胺凝胶, 胶厚 0.4mm. 厚度小于 0.4mm 的胶可能导致信号太弱.加样时不必吸去上层覆盖的矿物油,但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品. 3,上样及电泳 关闭电泳仪,用移液枪吸缓冲液清洗样品孔,去除在预电泳时扩散出来的尿素,然后立即用毛细管进 样器吸取样品,加入样品孔中.上样顺序一般为 G,A,T,C.加样完毕后,立即电泳.开始可用 30V/cm 进行电泳,5 分钟后可提高至 40-60V/cm,并保持恒压状态.一般来说,一个 55cm 长,0.2mm 厚的凝胶 板, 2500V 恒压状态下电泳 2 小时即可走到底部, 在 同时在电泳过程中, 电流可稳定地从 28mA 降至 25mA. 为了能读到更长的序列,可采用两轮或多轮上样. [注意 注意] 注意 1,上样电泳时,一定要注意凝胶板的温度是否达到 55℃左右,如果还没有达到,则应等温度达到后 才能上样电泳. 2,一般来说电泳时,不宜使用太高的电压,因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低,并且使带扩散. 电泳中可进行恒功率电泳. , (四) 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中.因而至少使用两个盘子,大小与玻璃板类似.在盘中加入新鲜溶液 之前须用高质量的水洗涤盘子. 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板,凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上. 2. 固定凝胶:将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘,用固定/停止溶液浸没,充分振荡 20 分钟或直至样品中染 料完全消失,胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡).保留固定/停止溶液,用于终止显影反应. 3. 洗胶:用超纯水振荡洗胶 3 次,每次 2 分钟.从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止 10-20 秒,使水流尽. 4. 凝胶染色:把凝胶移至染色溶液充分摇动 30 分钟. 5. 凝胶显影: (1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400l)以完成显影液的配制. (2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗 5-10 秒.注意,把凝胶从超纯水转移到显 影溶液的总时间不能长于 5-10 秒.浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号.若浸泡时间过长,可重复第 五步用染色液浸泡. (3). 立刻将凝胶转移至 1 升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第 一批条带,把凝胶移入剩下的 1 升显影液中继续显影 2--3 分钟,或直至所有条带出现. 6. 固定凝胶:在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液.停止显影反应,固定凝胶. 7. 在超纯水中浸洗凝胶两次,每次 2 分钟,注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指 纹. 8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥.在可见光灯箱或亮白,黄色背景(如纸)上观察凝胶,若

需永久保存的记录, 则可用 EDF 胶片保留实验结果. [注意 注意] 注意 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法,本系统的成败受几个因素的影响. 1. 水的质量对于染色的成功极其重要.超纯水(NANOpureR 或 Milli-QR 的水)或双蒸水可获得 较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现. 2. 碳酸钠也非常重要.使用新鲜的,美国化学学会级碳酸钠较好,如 Fisher 和 Kodak ACS 试剂 级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500 或 S262-3,或 Kodak Cat #109-1990),一般可获得较好的结果. 3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的.如果凝胶洗涤时间太长,银颗粒会脱离 DNA, 产生很少或 没有序列信号.如果洗涤时间过长,染色步骤可以重新进行. 4. 如果凝胶厚度超过 0.4mm 或丙烯酰胺浓度高于 4-6%,则有必要延长固定和染色的时间.如果 凝胶比 0.4mm 薄,染色反应后的洗涤必须缩短至不超过 5 秒. 5. 在室温下进行所有步骤,显影反应除外.显影溶液必须预冷至 10-12℃以减小背景杂色.注 意:临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠.用新配的染色及显影溶液.不要重复使用任何溶 液. ,EDF 胶片显影 (五 ) , 使用 EDF 胶片可增强测序条带的对比度, 如果测序胶上条带很淡, 我们建议把数据转移至 EDF 胶片, 银染胶在其影像转移至 EDF 胶片之后可增强条带可读性. 1. 在暗室内,将染色过的粘于玻璃板的凝胶(胶面向上)置于荧光灯箱上.如有合适的漫射板,亦可用 白灯箱, 为确保曝光时间, 用一小条 EDF 胶片曝光不同时间, 检查不同的曝光强度, 一般曝光 20--40 秒可 得较好结果. 2. 在红灯下找到 EDF 胶片有缺刻的一角, 然后把胶片置于凝胶上,使缺口位于左上角.由于 EDF 胶 片是单面的,因此必须确保缺口在左上角. 3. 在 EDF 胶片上放置一干净,干燥的玻璃板,开亮灯箱约 20 秒. 4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影 EDF 胶片,可使用下列操作过程: a. 在 Kodak GBX 显影液中显影 1-5 分钟; b. 水洗 1 分钟; c. 在 Kodak GBX 定影液中定影 3 分钟; d. 水洗 1 分钟. [注意 1. 进行 EDF 胶片显影之前凝胶必须完全干燥.戴手套进行操作, 以免印上指纹.同时注意 注意] 注意 EDF 胶片不能用自动胶片处理器. 2. 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同,通过对一小条 EDF 胶片曝光不同时间以选择你 所用 光源的最佳曝光时间,参阅胶片说明书. 3. 曝光时间短则 EDF 胶片影像较深,曝光时间长则有助于减弱背景.

1)银染序列 DNA 测序系统有什么组分? 银染序列 DNA 测序系统(目录号 Q4130)的所有试剂可作 100 次测序反应,可对 10 块测序胶 作银染.系统还包括 pGEM-3Zf(+)质粒模板和 pUC/M13 顺向引物作为正对照.系统所含的组 分可在银染序列 DNA 测序系统技术手册 TM023 中查阅. 2)银染序列 DNA 测序系统和染色试剂是分开提供的吗? 银染序列 DNA 测序系统和染色试剂可分开定购.目录号 Q4131 所提供的所有试剂可作 100 次测序反应,并包括正对照模板和引物,目录号 Q4132 所提供的所有试剂可对 10 块测序胶 作银染.

3)银染序列 DNA 测序系统的染色试剂能同其它系统的测序试剂一同使用吗? 银染序列 DNA 测序系统的染色试剂和银染序列 DNA 测序试剂一同使用, 不能和其它系统的测 序试剂一同使用. 4)用银染序列 DNA 测序系统需要额外的装备吗? 额外的装备包括: 热循环仪,SigmaCote 溶液(Sigma 目录号 SL-2) ,无核酸酶的纯水(目录号 P1193) 冰 , 乙酸,震荡器和旋转平台,比测序胶大的聚乙烯盒. 5)银染序列 DNA 测序系统用的是什么类型的测序方法? 银染序列 DNA 测序系统是一个热循环测序系统.它用 TaqDNA 聚合酶在高温下加入核苷酸. 测序反应用 pmol-fmol 量的 DNA(10(-12 次方)-10(-15 次方),单链模板特异引物,优 ) 化的脱氧和双脱氧核苷酸混合物, 测序级的 TaqDNA 聚合酶. 反应随后在 95oC 变性, 42-70 oC 的温度下引物退火/延伸,循环 45-60 次.产物在普通测序胶上分离后,用银染试剂染色. 6)银染序列 DNA 测序系统中用的热循环仪有哪些优点? 与普通测序系统比有几个优点: A) 得率:热循环测序可得到模板 DNA 的线型扩增.用少量的初始材料所得的产物用银染技 术得到可辩的序列梯度.依据模板类型,每一次测序反应用 0.03-2pmolDNA. B) 疑难模板:热循环测序可测具有次级结构的疑难模板,如 PCR 产物,lambdaDNA 和其它 具大量次级结构的模板. 热循环测序所用的较高温度可使次级结构变构, 以免干扰延伸和伸 延.热循环测序所用的较高退火温度提高了引物杂交的紧密度,并降低了背景信号. C) 无碱变性步骤:热循环测序的另一个优点是,95oC 的变性步骤可免去碱变性步骤. 7)银染序列 DNA 测序系统比放射同位素方法有哪些优点? 优点有: A) 安全:银染序列 DNA 测序系统完全是非放射的,比常规的放射同位素方法有效,无需放 射废物处理. B) 快速:一天即可得到结果.放射同位素方法通常需要 1-2 天的曝光时间. C) 省费:省去放射同位素的购买和处理费. 8)银染序列 DNA 测序系统和 fmolDNA 测序系统比有哪些差别? 银染序列 DNA 测序系统和 fmolDNA 测序系统均是热循环测序系统. 银染序列 DNA 测序系统较 fmolDNA 测序系统每条带的 DNA 得率高.与放射自显影相比,银染产生信号所需的 DNA 的量 更多.fmolDNA 测序系统所得的延伸产物不能用银染染色观察. 9)银染序列 DNA 测序系统和其它非放射同位素测序系统比有哪些不同? 其它手功非放射同位素测序系统需要将修饰的测序引物掺入到延伸产物中作检测. 常用的修 饰包括生物素和地高辛标记. 这些系统要求在对测序梯度作检测前, 要将测序胶转移到膜上, 测序梯度用化学发光和颜色反应检测.相反,银染序列 DNA 测序系统用非修饰的测序引物. 这省去购买或合成修饰的引物,测序梯度的检测不需作转移,转移大而薄的测序胶很困难, 膜也很贵.在银染序列 DNA 测序系统中,银染时胶附在玻璃板上.少的操作意味着减少检测 时间.在电泳后 90 分钟可读序列.用荧光标识进行的自动测序也是一种非放射同位素测序 法.但仪器和试剂的花费贵.银染序列 DNA 测序系统相比较而言较适用.

10)银染序列 DNA 测序系统所用的酶的性质如何? 银染序列 DNA 测序系统使用 Promega 专利化的测序级 Taq 聚合酶,修饰过的 Taq 聚合酶在 SDS-PAGE 上的分子量为 80, 道而顿, 000 而全酶的分子量为 94, 道而顿, 000 并有低的 5`-3` 外切核酸酶活力.测序级 Taq 聚合酶产生均匀强度的带型,背景低,准确度高.每一批号的 酶的品质在热循环仪上用 fmol DNA 测序系统确认.每一次酶制剂均检测非特异的核酸酶和 TaqI 限制性内切酶污染. 11)一次测序反应能测多少个碱基? 标准反应所得的序列梯度的长度为 500 个核苷酸. 但要读出这个长度的核苷酸, 需作多次加 样.每一次加样能读的序列数决定于所用的测序胶装置,和染色的强度.每一次加样可读 100-150 个核苷酸, 每一次实验可读 300-450 个核苷酸. 为了读更多的核苷酸, APC 胶片. 用 12)银染序列 DNA 测序系统的出错率是多少? 热循环测序不产生高的出错率.DNA 测序梯度代表所有单个引物-延伸反应,单个反应的出 错率在许多百万次的反应中被大大掩盖.

13)能用什么类型的 DNA 模板? 银染序列 DNA 测序系统所用的模板包括 PCR 产物,ssM13 或噬菌粒 DNA,lambdaDNA,质粒 DNA, 用普通方法制备的模板适用于这一系统.Promega 提供一系列的 DNA 纯化产品可免去 有机溶液抽提,乙醇沉淀.所有 Wizard 和 Wizard plus DNA 纯化系统所得 DNA 纯度好,可 用于制备测序级的模板.染色体 DNA 不能作为模板,随着模板长度的增加,非特异引物结合 和自配引物结合增加. 14)用多少模板 DNA? 模板的量取决于模板的长度(类型)而异 200bp(PCR 产物), 16ng(120fmol) 3,000-5,000bp (超螺旋的质粒 DNA), 2-4ug(1-2pmol) 48,000bp (lambdaDNA), 1ug(31fmol) dsDNA: ng 模板= fmol 模板 X6.6X10(-4 次方)XN, N 是模板的碱基数 ssDNA: ng 模板= fmol 模版 X3.3X10(-4 次方)XN, N 是模板的碱基数 15)为什么用超螺旋质粒 DNA 的量多于其他模板的量? 超螺旋的质粒 DNA 用加热很难变性,增加质粒的量有助于使引物退火到变性的模板上. 16)应用什么类型的引物? 银染序列 DNA 测序系统用非修饰的引物.为获得好的结果,用的引物的长度应不短于 24 个 核苷酸,GC-含量约为 50%.通常,更长的引物和 GC-含量高的引物使信号更清楚,这类引物 的退火温度更高,需增加引物杂交的紧密度,来降低模板次级结构,抑制链的再退火.短的 引物则需对退火温度作相应的调整. 17)应用什么退火温度? 退火温度是用热循环仪测序的最关键的因素. 高的退火温度增加引物杂交的紧密度, 降低次

级结构,抑制链的再退火.因此应用尽可能高的退火温度.对于不短于 24 个核苷酸的引物, 或短的 GC-含量接近或大于 50%的引物,用 70oC 作为退火温度.短于 24 个核苷酸的引物或 引物的 GC-含量小于 50%,用 42 oC 作为退火温度.依据每个引物的长度和 GC-含量,退火 温度应作进一步优化. 应用尽可能高的退火温度. 在银染序列 DNA 测序系统技术手册中讨论 了退火温度和热循环的设计. 18)对照反应的循环参数是多少? pUC/M13 顺向引物作对照实验,引物长度为 24 个核苷酸,用热循环设计程序 2,在 70oC 退 火/延伸 30 秒. 19)用多少量的引物? 4 次测序反应中的每一个反应用 4.5pmol 引物.将 pmol 换算成 ng 的式为:pmol X N X 330pg/pmol X 1ng/103 pg =ng,N 为引物长度的核苷酸. 20)银染的机制是什么? 银离子和 DNA 相互作用的化学原理发表在:Bloomfield VA, Crothers,DM, and Tinoco,IJr (1974)Physical Chemistry of Nucleic Acids, Harper and Row, Publlishers, New York, P422. 通常银染序列 DNA 测序系统所用的银染方法简单,只需几步.电泳后,在醋酸中固定测序胶 除去电泳液和凝胶中的尿素,并防制小的延伸产物的扩散.换几次蒸馏水除去固定剂.胶在 硝酸银和甲醛中染色.在染色后,将凝胶用水清洗,在含甲醛和硫代硫酸钠的碱性碳酸钠溶 液中显色.甲醛将银离子还原为金属银.硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银,否则会 增加背景.在显色一定的时间后,用水清洗一下,在空气中干燥. 21)推荐用什么类型的测序胶? 用 4-6%的聚丙烯酰胺凝胶(19:1 丙烯酰胺:双叉丙烯酰胺)厚度为 0.4mm.胶薄于 0.4mm 所得信号弱, 胶厚于 0.4mm 或更高浓度的胶需用更长的处理时间. 厚而高浓度的凝胶在干燥 中容易裂.不用楔型胶,它们染色不均匀. 22)玻璃板应如何处理? 与放射自显影相反,银染胶在处理过程中一面附着在玻板上.为此,一玻板必需用如 SigmaCote 的试剂作硅化处理使胶易脱离,另一玻板用硅烷液作硅烷化处理使胶易附着.银 染时测序胶附着在长的玻板上, 不一定每次用 SigmaCote 试剂对玻板作硅化处理, 另一玻板 却每次需用硅烷液作硅烷化处理.GelBond 膜干扰胶的染色,不能用. 23)成功银染的关键因素是什么? 成功银染的关键因素包括: A) 用超纯水(比如,NANOpure 或 Milli-Q 纯化)或者是双蒸水作银染 B) 用提供的碳酸钠或者 ACS 试剂级的碳酸钠 C) 在染色后,水清洗所用时间的长短很重要,用不超过 5-10 秒的时间清洗胶,然后放入 显色溶液中,一般在水里浸一下就好. D) 甲醛和硫代硫酸钠(400ul/1ml)在使用前,及时加入到显色液中. E) 在使用前及时配染色液.

24)如何获得测序数据的永久拷贝? 要获得测序数据的永久拷贝, 应用银染序列自动处理兼容相片 (APC) 目录号 Q4411, ( Q4412) . APC 相片是正片,在白的不透明的背景下留下原胶的像.使用方法简单,只需 APC 相片和白 色的荧光光箱.一般的曝光时间为 1-2 分钟.不用垂直光使 APC 曝光.可用手功或自动洗相 机冲洗 APC 相片.可在银染序列 DNA 测序系统技术手册 TM023 中查寻到更多的相关资料. 25)染色效果弱,如何加深带型的颜色深度? 用 APC 相片的优点是可在正像上加深银染带型的颜色.银染序列 DNA 测序系统技术手册 TM023 对测序和银染反应中出现的疑难问题给出了详细的解答. 26)还有什么有关的参考资料? 公司免费提供的资料包括银染序列 DNA 测序系统技术手册 TM023,操作录像. xuexue99 2006-09-10 11:51 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术. 我们实验室应用该项技术进行基因组甲 基化的筛选, 取得了一定结果. 因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度, 背景干扰降到最低, 因此在对凝胶进行染色时,往往采用同位素法或银染法,而且配制的胶往往很大,我们配制 的是大约 40×35cm 的胶,0.4mm 厚.同位素十分灵敏,特异,但是由于其操作的复杂性, 许多实验室开展有一定困难.银染法相对简便易行,便于一般的实验室开展. 需要指出的是, 应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法, 这样才能保证灵敏性, 我们在长期的工作中积累了一些银染的经验,与大家分享. 下面是网上的一个银染方法,我们使用后觉得效果不错,然后以此为基础,介绍一下我们的 经验 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中.因而至少使用两个盘子,大小与玻璃板类似.在盘中 加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子. 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板,凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上. 2. 固定凝胶: 将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘, 用固定/停止溶液浸没,充分振荡 20 分钟 或直至样品中染料完全消失, 胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡). 保留固定/停止溶 液,用于终止显影反应. 3. 洗胶:用超纯水振荡洗胶 3 次,每次 2 分钟.从水中取出, 当转移至下一溶液时拿 着胶板边沿静止 10-20 秒,使水流尽. 4. 凝胶染色:把凝胶移至染色溶液充分摇动 30 分钟. 5. 凝胶显影: (1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制. (2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗 5-10 秒. 注意, 把凝胶从超 纯水转移到显影溶液的总时间不能长于 5-10 秒. 浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号. 若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡. (3). 立刻将凝胶转移至 1 升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显 现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的 1 升显影液中继续显影 2--3 分钟,或直至所有 条带出现. 6. 固定凝胶: 在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液. 停止显影反应,固定凝胶.

7. 在超纯水中浸洗凝胶两次,每次 2 分钟,注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免 在胶上印上指纹. 8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥.在可见光灯箱或亮白,黄色背景(如纸) 上观察凝胶,若需永久保存的记录, 则可用 EDF 胶片保留实验结果. 经验分享: (1)固定液:网上有好几种固定液的配制方法,我们采用的是 10%的冰乙酸,用蒸馏水稀 释即可,简便易行.可提前配制,室温放置. (2)染色液:我们用的是 0.1%的硝酸银溶液,加入 3ml 甲醛.硝酸银要现用现配,时间 长了硝酸银会分解,一般在固定的时候配制,要有一段时间让硝酸银充分溶解. (3)显影液:用 10%碳酸钠,北化的质量就不错,完全不用买进口的,显影液要提前配制, 放入 4 度冰箱预冷.这一步很重要,如果没有充分预冷,显色时很难控制显色时间,不是染 过了导致背景很高,就是染的很浅.因此在固定前就要把显影液配好. (4)在 2L 显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制,这 一步要在显影前加,不要提前加.原理忘记了,但是一般都是这样做的. 甲醛将银离子还原为金属银, 硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银, 否则会增加背 景.甲醛和硫代硫酸钠溶液的量是变化的,根据凝胶染色的效果决定.当时我是把甲醛调整 为 2.7ml,硫代硫酸钠改为 420μl,两者作用不一样,所以调整的时候一个多,一个少,而 且要微调.具体什么方向调整忘记了,需要摸索最合适的条件. (5)也是比较重要的,即一定要分两次显色,第一次显色出现条带后马上转移至剩下的显 影液中.显色时间第一次大概是 5 分钟左右,操作中一定要在边上看着.显色后马上放入终 止液(10%的冰乙酸)中,两分钟后放入纯水中即可,两分中后取出即可. (6)对我来说教训最为惨痛的,即显色时间的控制.第二次显色时不要等所有条带都出来 后再终止,因为显色有一个延续效应.当时我染色时,忽然走神了,就走神 5 秒钟,胶全黄 了,背景奇高.我两天的工作因为 5 秒钟全部 over 了,当时差点疯了. 我的经验是:当染色离自己期望的效果还差那么两点时马上终止,具体时间需要摸索,但 一定要提前终止.再加一句:万一染色浅了是可以复染的,效果差不太多.

AFLP 的银染程序
南京农业大学 园艺学院 逯明辉

银染原理:
(1) 散; (2) (3) (4) 换几次蒸馏水以除去固定剂(醋酸) ; 胶在硝酸银和甲醛中染色; 染色后将凝胶用蒸馏水清洗,以除去未与 DNA 结合的银离子,但不能过度清洗, 以防已与 DNA 结合的银离子被洗掉; (5) 凝胶在含甲醛和硫代硫酸钠的碱性碳酸钠溶液中显色,显影液中的碱性愈强,显影 活力也就愈大,碳酸钠促进银离子还原.甲醛将银离子还原为金属银.硫代硫酸钠是一种抑 制剂,防止自由银离子还原为金属银,它能溶解未被还原的卤化银和可溶性银盐,防止背景 的加深.在显色一定的时间后,用水清洗一下,在空气中干燥. 电泳后,在醋酸中固定测序胶除去电泳液上凝胶中的尿素,并防止小延伸产物的扩

银染程序

1 玻璃板的准备 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) 2 灌胶 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 将准备好的玻璃板水平或稍稍倾斜放置; 称取 25.2252 g 尿素,加入 6 ml 10 × TBE 缓冲液[3]和 12 ml 30% PA 胶[4],用蒸馏水 定容至 60 ml 后,搅拌溶解; 溶解后加入 50 l TEMED 和 250 l 10% APS[5],迅速摇匀后置于冰板上防止凝固; 用移液管吸取凝胶溶液从玻璃板上端连续注入,流速较慢的部分可用吸耳球敲打, 使其均匀流动; 待凝胶溶液到达玻璃板底部后,将玻璃板放平; 插梳子:将梳子插在玻璃板中间,注意只能往前推不能往后拉,否则会产生气泡; 凝固 3-4 小时(建议过夜) . 3 电泳 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) 4 染色 固定:电泳结束后,将玻璃板从电泳槽上取下,并轻轻撬起短板,放入 1.5L 10%的 醋酸溶液中轻轻摇动,固定约 30 分钟,直至溴酚蓝完全褪去; (2) 漂洗:取出长板,在蒸馏水中漂洗两次,每次 3 分钟; (3) 染色:在 1.5 L 硝酸银染色液[7]中染色 30 分钟(硝酸银应充分溶解,如多次使用, 需避光保存) ; (4) 显影:染色完毕后,在蒸馏水中迅速漂洗 3-4 秒钟,然后转入预冷的碳酸钠显色液[8] (1) 拔去梳子并刮去插梳子处的尿素; 将玻璃板固定在电泳槽上,并灌 1× TBE 缓冲液作为电泳缓冲液; 用 1ml 的枪将胶孔内的大气泡吹出; 用加样枪头将胶孔内的小气泡和硅化油吸出,重复两次; 60W 恒定功率预电泳 30 分钟(冬天 40 分钟) ; 再用加样枪头冲洗胶孔直至无硅化油残留; 预电泳期间准备样品:5 l PCR 产物+5 l 溴酚蓝[6],混匀; 变性:将样品在 94-95 ℃水浴中变性 4-5 分钟后立即置于冰上; 上样; 电泳:60 W 恒功率电泳约 2 小时 30 分钟. 用清洗液将电泳槽两块玻璃板彻底洗净; 蒸馏水冲洗; 吸水纸擦干(两块纸不要用同一张纸) ; 75%酒精擦洗后晾干; 用吸水纸沾少许硅化油[1]涂抹短板,从中间往外擦,注意涂匀; 用反硅化剂[2]擦洗长板; 室温晾干 20 分钟; 长板用 75%酒精擦洗,先从左到右,再从上到下,重复两次; 晾干; 将边条和梳子洗净,擦干; 将边条放在长板两边,短板放在边条上,对齐; 两边用长尾夹夹紧,用梳子试好松紧.

中,轻轻摇动进行显影; (5) 终止:待条带清晰时,倒掉显影液,用自来水冲洗长板后,放入 10%的醋酸溶液中 终止显色反应 2 分钟; (6) 漂洗:蒸馏水漂洗 10 分钟; (7) 拍照:在灯箱上进行观察拍照. 5 所用试剂的配制 [1] [2] [3] 至 1 L; [4] [5] [6] [7] [8] 30% PA 胶:275 g 丙稀酰胺(Acr)+15 g 甲叉(Bis) ,加蒸馏水至 1L; 10% APS(过硫酸铵) g APS,加蒸馏水至 10 ml,分装后贮藏在-20℃冰箱; :1 溴酚蓝:47.5 ml 甲酰胺+2 ml 0.5 M EDTA+0.125 g 溴酚蓝,加蒸馏水至 50ml; 硝酸银染色液:2 g 硝酸银+3 ml 甲醛,加蒸馏水至 2 L; 碳酸钠显色液: g 无水碳酸钠+400 l 1%硫代硫酸钠+3 ml 甲醛, 60 加蒸馏水至 2 L; 1%硫代硫酸钠:硫代硫酸钠 1 g,加蒸馏水至 100 ml,4℃保存. 琼脂糖电泳 Preparation of Agarose Gels for DNA separations 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 11:05:00 Weigh out the desired amount of agarose and place in an Erlenmeyer flask with a measured amount of electrophoresis buffer, e.g. for an 0.8% gel, add 0.8 gm of agarose and 100ml of TBE Buffer (1X), to a 200 ml flask. The larger flask insures against the agarose boiling over. Dissolve the agarose in a boiling water bath or in a revolving-plate microwave oven. All the grains of agarose should be dissolved and the solution clear. Cool the solution to 60°C (70°C for concentrations 2% or above) and pour immediately. Allow the gel to set for one-half hour before using. Make sure to use the same electrophoresis buffer in the gel as for the running buffer. DNA Size Separation by Agarose Concentration Effective Range of Separation for Linear Fragments (kb) Agarose (%) 30 to 1 0.5 12 to 0.8 0.7 10 to 0.5 1.0 7 to 0.4 1.2 3 to 0.2 1.5 硅化油(剥离硅烷) ml 氯仿+300 l Repel; :3 反硅化剂(亲和硅烷) ml 无水酒精+10 l 冰醋酸+10 l Binding; :3 10 × TBE 缓冲液:108 g Tris 碱+55 g 硼酸+40 ml 0.5 M EDTA(pH8.0) ,加蒸馏水

Prepare sample by adding concentrated DNA loading buffer. DNA always migrates

towards the positive electrode. Bromophenol blue (BP) generally co-migrates with 0.5 kb fragments of DNA. Stain with 0.5 mg/ml ethidium bromide for 10 minutes.

------------------------------------------------------------------------------Acrylamide Gel for Small DNA Fragment Separations Acrylamide is used at a 19:1 ratio with bis-acrylamide, filtered and refrigerated. For 40 ml of gel use 25 ml of TEMED and 250 ml of 10% APS solution to polymerize. Prepare sample by adding concentrated DNA loading buffer. DNA always migrates towards the positive electrode. Stain with 0.5 mg/ml ethidium bromide for 10 minutes. DNA Size Separation by Acrylamide Percentage DNA Size Range (Base Pairs) Acrylamide (%) 100 - 1,000 3.5 80 - 500 5.0 60 - 400 8.0 40 - 200 12.0 10 - 100 20.0

DNA Mobility in Acrylamide Gels Migration of marker dyes in bp for native polyacrylamide non-denaturing gels Gel % Bromophenol blue (BP) Xylene cyanole (XC) 3.5 100 460 5.0 65 260 8.0 45 160 12.0 20 70 20.0 12 45

Migration of marker dyes in bp for polyacrylamide denaturing gels Gel % Bromophenol blue (BP) Xylene cyanole (XC) 5.0 35 130 6.0 26 106 8.0 19 75 10.0 12 55

20.0 8 28

Agarose Gel Electrophoresis of DNA 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 10:19:00 Agarose Gel Electrophoresis of DNA

1) Dissolve 1 g of agarose in 100 ml of 1X TAE or TBE buffer (gives a 1% gel). See note for making LMP agarose gel.

2) Cast the gel with the comb in place.

3) Add 6X gel loading buffer to sample and load the samples into wells.

4) Run the gel submerged in 1X TAE or TBE (30-60 min. at 100-150V)

5) Stain the gel with ethidium bromide solution (10 l per 100ml of buffer) for 10 - 15 min.

6) View on a long wave UV transilluminator.

note: a) TAE is better for cloning work as the borate in TBE may affect subsequent ligation reaction if it is not removed well. See FMC bioproducts for more details on comparison of buffers. TTE (Tris Taurine EDTA) may be used as an alternative. b) The percentage of gel used depend on the size of DNA to be separated. Low percentage gel separates high m.w. DNA while high percentage gel separates low m.w DNA. c) Gel may be cast with ethidium bromide solution added. This will save time staining but the gel will also run slightly slower (note that ethidium bromide is a powerful mutagen, so be careful in its use). d) In general the supercoiled circular plasmid run faster than cut plasmid. Multiple bands can be seen with closed circular plasmid (supercoiled DNA, relaxed DNA, denatured DNA, catenae, etc.). e) The distance tranvelled in a gel by a DNA molecule has a roughly logarithmic relationship with the m.w. of the DNA.

f) Higher concentration of DNA may retard the movement of the DNA band. Higher concentration of salts in the buffer may also have the same effect. g) The RNA normally runs well in front of the DNA. Chromosomal DNA may be stuck in the well or move very slowly if present. h) Smear in the lane may indicates the degradation of the DNA by nucleases or maybe RNA. See also trouble-shooting i) To prepare low m.p agarose gel - first pour 50 ml (volume depends on gel apparatus used) of 2% of usual agarose (not LMP), let it set, put comb in (leave a small gap between gel surface and comb) and pour 100ml of ~1% LMP agarose. This method helps the low m.p agarose to set and provide a firm base for the handling of the gel. j) When loading DNA sample into the well of your gel, if the DNA sample is contaminated with ethanol or mineral oil, or if the gel is not completely submerged with buffer, the DNA solution may move out of the well. If this is a problem, use more loading buffer, or prepare the loading buffer in TAE instead of water, or use glycerol in the buffer and mix well, or make sure that your DNA sample is free of ethanol. k) Note that UV can damage your DNA. Although the UV transilluminator should be operating at a wavelength safer for your DNA, it is generally a good idea not to expose your DNA to UV light for too long. Overexposure to UV can result in ligation failure. It has been suggested that addition of 1-10mM cytodine or guanosine in gel can protect against UV damage. l) Electrophoresis of the gel can be done at constant current or constant voltage, however, it is safer to use constant voltage. m) You can destain the gel after staining (10-15 min. in water), but it is generally unncessary but would be useful if the band is faint. n) Methods of extracting DNA from gel: there are many methods for extracting DNA from gel apart from using commericial kits, some methods however yield cleaner DNA than others. In general, use LMP agarose if you wish to use the DNA for further manipulation. Freeze squeeze - Excise band and place pieces of it in a home-made spin-column (a piece of filter placed in a PCR 0.5ml eppendorf, pierced the bottom of the PCR tube with a needle). Place The PCR tube at -20 °C for 15-20 mins or freeze in liquid N2. Then place the PCR tube into the 1.5 ml eppendorf and spin at top speed in a microfuge for 15 mins, collect DNA solution which can be EtOH ppt or use directly. Syringe squeeze - Li and Ownby, (1993) BioTechniques 15,976-978 Powdered silica - see bionet.molbio.methds-reagnts FAQ (also useful for lots of other information on molecular biology. Melt excised bands at 70°C cool and add equal volume of TE-buffered phenol and mix. Spin for 5 min, remove aqueous phase, repeat and EtOh ppt. the DNA. See also phenol-base method . Electroelution - cut a small trough just ahead of the DNA band, place DEAE-cellulose paper, or dialysis tubing, or affinity membrane, or just buffer containing 0.3 M NaOAc and 10% sucrose into the trough and run the gel at 150 volt for a minute or two until all the DNA has gone into the trough. Collect DNA (then spun out in a

home-made spin-column if it's trapped in paper) and ethanol precipitate. Kits - gives clean DNA for further manipulation. e.g. Geneclean (Bio 101), Prep-a-gene (Bio-rad), Qiaex (Qiagen), GELase (Epicentre), etc. Some work better than others. Buffers: 50x TAE (per litre) 242 g Tris base, 57.1 g glacial acetic acid, 100 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 10x TBE (per litre) 108 g Tris base, 55 g boric acid, 40 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0 20X TTE buffer (per litre) Tris Base 216 g, Taurine 72 g, EDTA disodium salt 4 g 6x gel loading buffer 0.25% Bromophenol blue, 0.25%Xylene cyanol FF, 15% Ficoll Type 4000, 120 mM EDTA

Top 10 Fun Facts for DNA Electrophoresis 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 10:26:00 Did you know: When preparing agarose for electrophoresis, it is best to sprinkle the agarose into room-temperature buffer, swirl, and let sit at least 1 min before microwaving. This allows the agarose to hydrate first, which minimizes foaming during heating. Electrophoresis buffer can affect the resolution of DNA. TAE (Tris-Acetate-EDTA) buffer provides better resolution of fragments >4 kb, while TBE (Tris-Borate-EDTA) buffer provides better resolution of 0.1- to 3-kb fragments. In addition, use TBE buffer when electrophoresing >150 V and use TAE buffer with supercoiled DNA for best results. Migration of DNA is retarded and band distortion can occur when too much buffer covers the gel. The slower migration results from a reduced voltage gradient across the gel.. Loading DNA in the smallest volume possible will result in sharper bands. You can preserve DNA in agarose gels for long-term storage using 70% ethanol. [See Jacobs, D. and Neilan, B.A. (1995) BioTechniques 19, 892.] Electrophoresing a gel too "hot" can cause the DNA to denature in the gel. It can also cause the agarose gel to deform. Cool the gel with a small fan during the

electrophoresis. For the Supercoiled DNA Ladder electrophoresed on <1% agarose gels, add 2 1lg/ml ethidium bromide to the gel. Otherwise, smeared bands and extra bands will be seen because of different degrees of supercoiling. [See Longo, M.C. and Hartley, J.L. (1986) Focus 8:3, 3. (reprinted on page 63, this issue).] When glycerol-containing loading buffers are used in DNA samples electrophoresed through acrylamide gels, smiling bands may be accentuated especially in TBE. On a polyacrylamide gel, DNA fragments having AT-rich regions migrate slower than other DNA fragments of the same size. This anomalous migration is enhanced at lower temperatures and disappears at high temperatures. This anomalous migration is not observed on agarose gels. [See Stellwagen, N.C. (1983) Biochemistry22, 6186.] The minimum amount of DNA detectable by ethidium bromide on a 3-mm-thick gel and a 5-mm-wide lane is 1 ng. Do not exceed 50 ng of DNA per band on a 3-mm-thick gel and 5-mm-wide lane. 琼脂糖凝胶电泳

作者:佚名

实验频道来源:37C

点击数:

更新时间:2003-11-1

在凝胶电泳中,首先应用的是琼脂电泳,它具有下列优点: (1)琼脂含液体量 大,可达 98-99%,近似自由电泳,但是样品的扩散度比自由电泳小,对蛋白质的吸附 极微. (2)琼 脂作为支持体有均匀,区带整齐,分辨率高,重复性好等优点. (3) 电泳速度快. (4)透 明而不吸收紫外线,可以直接用紫外检测仪作定量测定. (5) 区带易染色,样品易回收, 有利于制止备.然而琼脂中有较多硫酸根,电渗作用大. 琼脂糖是从琼脂中提取出来的, 是由半乳糖和 3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多 糖.含硫酸根比琼脂少,因而分离效 果明显提高. 琼脂(糖)电泳常用缓冲液的 pH 在 6-9 之间,离子强度为 0.02-0.05. 离子强度过 高时,会有大量电流通过凝胶,因而产生热量,使凝胶的水份量蒸发,析出盐 的结 晶, 甚至可使凝胶断裂, 电流中断. 常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液. 为 了防止电泳时两极缓冲液槽内 pH 和离子强度的改变, 可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲 液,混匀后再用. TROUBLESHOOTING DNA AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 10:27:00

If you see faint or no bands on the gel:

There was insufficient quantity or concentration of DNA loaded on the gel. Increase the amount of DNA, but don't exceed 50 ng/band. The DNA was degraded. Avoid nuclease contamination. The DNA was electrophoresed off the gel. Electrophorese the gel for less time, use a lower voltage, or use a higher percent gel. Improper W light source was used for visualization of ethidium bromide-stained DNA. Use a shortwavelength (254 nm) W light for greater sensitivity. Note: For preparative gels, using a longer wavelength (312 nm) W light will minimize DNA degradation. If you see smeared DNA bands: The DNA was degraded. Avoid nuclease contamination. Too much DNA was loaded on the gel. Decrease the amount of DNA. Improper electrophoresis conditions were used. Do not allow voltage to exceed ~20 V/cm. Maintain a temperature <30 ° C during electrophoresis. Check that the electrophoresis buffer used had sufficient buffer capacity. This is done by checking the pH in the anode and cathode chambers. There was too much salt in the DNA. Use ethanol precipitation to remove excess salts, prior to electrophoresis. The DNA was contaminated with protein. Use phenol extractions to remove protein prior to electrophoresis. Small DNA bands diffused during staining. Add the ethidium bromide during electrophoresis. If you see anomalies DNA band migration: Improper electrophoresis conditions were used. Do not allow voltage to exceed ~20 V/cm. Maintain a temperature <30 ° C during electrophoresis. Check that the electrophoresis buffer used had sufficient buffer capacity. The DNA was denatured. Do not heat standards [except for l DNA/Hind III fragments (figure 1)] prior to electrophoresis. Dilute DNA standards in buffer with 20 mM NaCl. DNA mobility in gels 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 10:23:00

1. Migration of marker dyes in native polyacrylamide non-denaturing gels

Gel %

Bromophenol blue (BP)

Xylene cyanole (XC)

3.5 100 5.0 65 8.0 45 12.0 20 20.0 12 2. Migration of marker dyes in

460 260 160 70 45 polyacrylamide denaturing gels

Gel %

Bromophenol blue (BP)

Xylene cyanole (XC)

5.0 35 130 6.0 26 106 8.0 19 75 10.0 12 55 20.0 8 28 3. Relative positions of different DNA forms on Tris-acetate agarose gels

The exact distance between bands is influenced by percentage of agarose, time of electrophoresis, concentration of Ethidium bromide, degree of supercoiling and the size and complexity of the DNA.

Standard neutral agarose electrophoresis 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 10:26:00 Standard neutral agarose electrophoresis Standard agarose gels can be prepared using either TBE or TAE running buffers. You will need: Either 10 x TBE or 10 x TAE buffers 1 x TBE buffer - 89mM Tris, 89mM boric acid, 2mM EDTA, pH 8. 1 x TAE buffer - 40mM Tris-acetate, 2mM EDTA, pH 8. 10mg/ml ethidium bromide stock solution

10 x Type III loading buffer (50% glycerol, 0.5% bromophenol blue, 0.5% xylene cyanol, this solution should be stored at 4°C) N.B: Extreme caution should be excersised when handling solutions containing ethidium bromide as it is a powerful mutagen. Gloves should always be worn. Solutions containing high levels (> ca. 10ug/ml) of ethidium bromide should be treated with a strong oxidizing agent (i.e. potassium permanganate) to render the ethidium bromide less dangerous before disposal into waste bottles for that purpose. Disposal of waste should be by a route capable of dealing with such reagents (i.e. a contracted company). 1) Agarose gels (0.6-2%) are prepared by dissolving powdered agarose in the required volume of the appropriate electrophoresis buffer using either a bunsen burner or a microwave oven. 2) Once completely dissolved, allow to cool to approximately 50-55 ° C, add sufficient 10mg/ml ethidium bromide to give ~0.5ug/ml and pour into the appropriate electrophoresis gel forming rig with the comb inserted. 3) Once set, remove the comb and transfer the gel to the appropriate gell apparatus. Cover the gel with the appropriate running buffer. For routine gels, ethidium bromide at a concentration of 0.5 ug/ml (from a 10mg/ml stock) should be incorporated into the gel running buffer. 4) Prior to loading DNA samples, 0.1 volumes of 10 x Type III loading buffer should be added. 5) Electrophoresis should be performed at voltage gradients of between 2 and 12 volts per centimetre depending on whether accurate sizing of fragments (2V/cm) or routine checks of plasmid concentration and yield (12V/cm) are required. 6) Continue electrophoresis until the slowest dye front (xylene cyanol FF) has migrated approximately half the length of the gel. This should give sufficient resolution for most purposes. The operators discretion should obviously be used here depending on the size of the DNA molecules of interest. 7) Visualize DNA by illumination of the gel using a 302nM UV transilluminator. Molecular weight markers can be used to estimate the size of DNA fragments

电泳切胶小窍门 信息来源:本站原创 更新时间:2006-7-21 8:08:09

一些注意事项 1.电泳的 buffer 和 gel 都是新制的,切胶的台子清理干净,刀片最好洗净灭菌,总之一句 话就是保证切下的带没有外源 dna 污染. 2.切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收. 为了减少胶的体积, 可以用相对比较薄 的胶来做,只要够点样即可,也可采用薄而宽的梳子来跑胶. 3.关于防护,在一般有机玻璃后就足够了,戴上防护面具以保护眼睛,如果你戴树脂眼镜就 可以了.要是非常害怕紫外照射,或者对于胶有特殊要求,例如要求不含 EB,你可以采用 点 marker 和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶. 按照正常程序点 marker 跑胶,然后切下有 marker 的胶,EB 染色,紫外灯下与带刻度的尺 子一起照相.由于要回收的带与 marker 间的相对位置已知,根据尺子来衡量未染色胶上目 的带的位置即可.如果觉得很难判断,可以直接在 marker 边点少量的样,这样位置就容易 确定了.

丙烯酰胺凝胶电泳 信息来源:本站原创 更新时间:2005-2-23 16:25:00

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法. 在这种支持介质上可根 据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离. 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点: ①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和 N,N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子.凝胶有 格子 是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物,没有或很少带有离子的侧基,因而电渗作用比较小,不易 和样品相互作用. ②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质, 在聚合前可调节单体的浓度比, 形成 不 同程度交链结构, 其空隙度可在一个较广的范围内变化, 可以根据要分离物质分子 的大小, 选择合适的凝胶成分,使之既有适宜的空隙度,又有比较好的机械性质.一 般说来,含丙 烯酰胺 7-7.5%的凝胶,机械性能适用于分离分子量范围不 1 万至 100 万物 质,1 万以下的 蛋白质则采用含丙烯酰胺 15-30%的凝胶,而分子量特别大的可采用含 丙烯酰胺 4%的凝胶, 大孔胶易碎,小孔胶则难从管中取出,因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰 胺,以改进凝胶的机械性能. ③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定. 凝胶无色透明, 易观察, 可用检测仪直接测定. ④丙烯酰胺是比较纯的化合物,可以精制,减少污染.合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙 烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺.丙烯酰胺称单体,甲撑双 丙烯酰胺称交联剂,在水溶液中,单 体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝 胶. 在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中,需要有催化剂参加,催化剂包括引发剂和 另速 剂两部分.引发剂在凝胶形成中提供始自由基,通过自由基的传递,使丙烯酰胺 成为自由 基,发动聚合反应,加速剂则可加快引发剂放自由基的速度.常用的引发剂 和加速剂的配

伍如下表: 聚合反应催化剂配伍 引 发 剂 加 速 剂 (NH4)2S2O8 TEMED (NH4)2S2O8 DMAPN 核 黄 素 TEMED

注:(NH4)2S2O8,过硫酸胺 TEMED:N,N,N,N';四甲基乙二胺 DMAPN:β-二甲基胺 基丙晴 用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应; 用核黄素引发, 需要强光照射反应液, 称光聚合反应. 聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响: 1,大气中氧能淬灭自由基,使 聚合反应终止,所以在聚合过程中要使反应液与空气 隔绝. 2,某些材料如有机玻璃,能 抑制聚合反应. 3,某些化学药物可以减慢反应速度,如赤血盐. 4,温度高聚合快,温度 低聚合慢. 以上几点在制备凝胶时必须加以注意. 凝胶的筛孔,机械强度及透明度等很大 程度上由凝胶的浓度和交联决定.每 100 亳升 凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝 胶浓度,常用 T%表达;凝胶溶液中交联剂 占单体和交联体总量的百分数称为交联度,常用 C%表示,可用下式计算: 公 式 a:丙烯酰胺克数; b:甲撑双丙烯酰胺克数;m:缓冲液体积(毫升) 凝胶浓度过高时, 凝胶硬而脆,容易破碎;凝胶浓度太低时,凝胶稀软,不易操作. 交联度过高,胶不透明并缺乏弹性;交联度过低,凝胶呈糊状. 聚丙烯酰胺凝胶具有 较高的粘度,它不防止对流减低扩散的能力,而且因为它具有三 度空间网状结构,某分子 通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大 小和形状,这是凝胶的分子筛 作用.由于这种分子筛作用,这里的凝胶并不仅是单纯 的支持物,因此,在电泳过程中除 了注意电泳的基本原理以外,还必须注意与凝胶本 身有关的各种性质(网孔的大小和形状 等) .可通过下式计算来选择适当的凝胶网 孔. 公 式 式中: 为网孔平均直径, 为多聚体浓度, 为该多聚体分子直径 P C d (若不是卷曲的分 子 应为 5A) K 为常数, 值取决于涨胶的几何构型, , K 假如多聚体的链是以近似于直角 交联的, 则约为 1.5 根据此式,我们可以通过多聚体浓度 C 近似地计算出网孔直径,例 如已知多聚

体浓度为 5%,其网孔平均直径应为: 公 式 这样的计算是粗略的,与实际情况有一定距离,有人测定了总浓度(T)为 20%的丙烯 酰胺液,在六种不同比例的双丙烯酰胺存在 下,聚合后的网孔大小,发现孔径与总浓度有 关,总浓度愈大,孔径相应变小,机械 强度增强,与总浓度不变时,甲叉双丙烯酰胺(Bis) 的浓度在 5%时孔径最小,高于或 低于此值时,聚合体孔径都相对变大,凝胶孔径在凝胶电 泳中是一个重要的参数,它 往往决定了电泳的分离效果.经过不断的实践,得到了如表 3 所示的经验值,在一般情况下,大多数生物体内的蛋白质采用 7.5%浓 度的凝胶,所得电泳 结果往往是满意的,因此称由此浓度组成的凝胶为"标准凝 胶" . 对那些用于重要研究的凝胶,最好是通过采用 10%的一系列凝胶浓度梯进行预先试验,以选 出最适凝胶浓度.

表 3 不同分子量范围的蛋白质和核酸在凝胶电泳 中所选用的凝胶浓度百分率 物 质 分子量范围 适用的凝胶浓度(%) 蛋白质 <10 1-4×104 4×10-1×105 1-5×105 >5×105 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5 核酸 <104 104-105 105-2×106 10-20 5-10 2-3.6

聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类,前者指整个电泳系统中所用缓冲 液, 值和凝胶网孔都是相同的, pH 后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液, pH 值和孔径,不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层,从而提高分辨 能力. 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素.如果加入一种试剂使电荷因素消除,那电泳迁移率就取决于分子的大 小, 就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量.1967 年,Shapiro 等发现阴离子去污剂 十二烷基 硫酸钠(SDS)具有这种作用.当向蛋白质溶液中加入足够量 SDS 和巯基乙 醇,SDS 可使蛋 白质分子中的二硫键还原.由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白 质—SDS 复合物都带 上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量, 因而掩盖了不同种蛋白

质间原有的电荷差别,SDS 与蛋白质结合后,还可引起构象改 变,蛋白质—SDS 复合物形成 近似"雪茄烟"形的长椭圆棒,不同蛋白质的 SDS 复合物 的短轴长度都不一样,约为 18A, 这样的蛋白质—SDS 复合物,在凝胶中的迁移率,不 再受蛋白质原的电荷和形状的影响, 而取决于分子量的大小,因而 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量. ELECTROPHORESIS OF DNA IN POLYACRYLAMIDE GELS 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 10:58:00 ELECTROPHORESIS OF DNA IN POLYACRYLAMIDE GELS Gel Sizes Small: 165 x 130 mm Medium: 165 x 200 mm Large: 165 x 260 mm 5% Analytical Gels Reagent 1 mm Small 1 mm Medium 1 mm Large 10X TBE Buffer (ml) 3 3.5 5 40% bis/acrylamide (ml) 3.75 4.4 6.2 Water (ml) 17.25 20.1 28.8 50% Glycerol (ml) 6 7 10 APS (mg) 34 40 57 TEMED (ul) 12.8 15 21.4 Total Volume (ml) 30 35 50

With other concentrations of a bis/acrylamide stock substitute: 25% bis/acrylamide (ml) 6.0 7.0 10.0 Water (ml) 15.0 18.5 25.0 30% bis/acrylamide (ml) 5.0 5.8 8.3 Water (ml) 16.0 18.7 26.7 50% bis/acrylamide (ml) 3.0 3.5 5.0 Water (ml) 18.0 21.0 30.0

5% BAC Cross-linked Polyacrylamide Gels Reagent 1 mm Medium 1 mm Long 4 mm Small 4 mm Medium 10x TBE Buffer (ml) 8 10 16 20 Water (ml) 14 17.5 28 35 50% Glycerol (ml) 8 10 16 20 20% bac/acrylamide (ml) 10 12.5 20 25 APS (mg) 16 20 32 40 TEMED (ml) 200 250 400 500

Total Volume (ml) 40 50 80 100 Pre-run gels for 30 minutes at 80V. Rinse the wells with running buffer. Load and electrophorese samples at 80V until dyes separate, then boost to up to 150 V. Medium sized polyacrylamide gels can be run overnight at 55-60 V to see all phi-X/Hae III cut molecular weight standards on the gel.

7.5% Mini (10 x 8.2 cm) Polyacrylamide Gels 10 ml 7.5% Polyacrylamide Gel Solution 65 l 10% (w/v) APS 12.5 l TEMED

SEQUENCING GELS (8% Polyacrylamide, 8 M Urea) Reagent 40 cm gel 80 cm gel 1 m gel Urea (g) 48 86.5 120 Water (ml) 37 66.5 92.4 50% bis/acrylamide (ml) 16 28.8 40 10x TBE Buffer (ml) 10 18 25 10% (w/v) APS (ml) 0.668 1.2 < 1.67 TEMED (ml) 50 85 118 Total Volume (ml) 100 180 250 Pre-run sequencing gels at 1800 V for 30 minutes. With other concentrations of a bis/acrylamide stock substitute: 30% bis/acrylamide(ml) Water (ml) 47.3 65.7 48 66.7

40% bis/acrylamide (ml) Water (ml) 59.3 82.4

36 50

------------------------------------------------------------------------------RECIPES

10X TBE (1M Tris, 1M Boric Acid, 20mM EDTA, pH 8.3) 242.2 g Tris 123.66 g boric acid 14.89 g EDTA Adjust pH to 8.3. QS to 2 liters. Autoclave. (Biotechniques 10:182, 1991 claims that filtering up to a 20x TBE solution through 0.2 - 0.45 cellulose acetate or cellulose nitrate filters prevents formation of precipitants during long-term storage. The solution may be reautocalved to dissolve precipitates that form.) 50% Glycerol 25 ml 100% glycerol 25 ml water Autoclave. Concentrated glycerol is quite viscous. Be sure all of it has been transferred from the stock bottle. 30% Acrylamide Solution (0.8% bis) 60 g acrylamide 1.6 g bis Heat to dissolve in approximately 100 ml of water. QS to 200 ml with water and filter with Whatman #1 filter paper into a foil wrapped bottle. 40% Acrylamide Solution (19:1 acrylamide:bis) 80 g acrylamide 4.21 g bis Heat to dissolve in approximately 100 ml of water. QS to 200 ml with water and filter with Whatman #1 filter paper into a foil wrapped bottle. 50% Acrylamide Solution (19:1 acrylamide:bis) 237.5 g (97%) acrylamide 12.5 g bis Dissolve in 250 ml hot water. Filter to remove debris and wrap in foil. 20% Bac-Acrylamide Solution WARNING: wear gloves 100 ml solution 18.98 g acrylamide 1.02 g BAC (N',N'-bis-acrylylcystamine) Heat approximately 75 ml of water to almost boiling. Add acrylamide and cover with a watch glass. Mix briefly to dissolve and reheat to near boiling. Add BAC. QS to 100 ml with water. Do not autoclave. Filter sterlize with Nalgene 0.45 or 0.2 micron filter and store in foil wrapped bottle.

7.5% Polyacrylamide Gel Solution

40% Bis/Acrylamide Stock Solution 18.75 ml 37.5 ml 10x TBE buffer 10 ml 20 ml 50% glycerol 20 ml 40 ml Water 51.25 ml 102.5 ml TOTAL VOLUME 100 ml 200 ml Preparation of Polyacrylamide Gels 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 11:01:00 1. Prepare 20X TBE as: 216 g Tris Base 110 g Boric Acid 80 mL 500 mM EDTA, pH 8.0 700 mL ddH2O Mix. Bring volume to 1 L. Autoclave. 2. Prepare Acrylamide solution as: 6 % Acrylamide 60.0 g Acrylamide 0.25 % Bis-Acrylamide 2.5 g Bis-Acrylamide 8 M Urea 422.0 g Urea 0.5 X TBE 25 mL 20X TBE 500 mL ddH20 Mix. Bring volume to 1 L. Filter. Store at 4 C in the dark. 3. Wash glass plates on both sides with soap. Rinse well with water. Rinse well with distilled water. Hold vertical and douse each side with 95% Ethanol to promote drying. Stand on edge and dry with Kim-Wipe. 4. Lay the plates flat. Etch one side of each plate to mark it as 'Siliconized.' Spread 100 mL Sigmacote solution on each plate and distribute with a small Kim-Wipe. 5. Allow to dry for 2 min. Place spacers on long plate. Place short plate on top providing a 2 mm gap is provided at the bottom. Clamp the bottom 2/3 with 3 bulldog clamps. 6. Prop up the top edge of the plates with a 25 mL pipet to provide a shallow slope from top to bottom. 7. Mix the appropriate amount of acrylamide solution in a 60 mL syringe. As a guide: 100 mL Acrylamide Solution 600 ml Fresh (2 weeks) 10% Ammonium Persulfate

30 ml Fresh Temed 8. Mix by inversion. Quickly apply 3 mL across the top of the plates and allow to run between the plates. 9. Continue to provide acrylamide to the top of the plates as it runs in. DO NOT allow the top to run dry or bubbles will form. DO NOT overfill. Tap any slow-running spots to quicken flow and avoid bubble formation. 10. When acrylamide solution fills the space between the plates, remove the 25 mL pipet and lay the plates flat. Insert comb teeth up and clamp. Layer excess acrylamide over the comb and across the bottom lip. Polymerize for 30 min. 实验频道录入:Protocol 责任编辑:Protocol Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Oligonucleotides 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 11:01:00 1. Pour and polymerize a 20% polyacrylamide gel, no Urea. 2. Remove clamps. Rinse with water. Remove comb. Rinse top of gel well. 3. Insert comb teeth down until teeth just touch the gel. Mount the plates in apparatus. Fill chambers with 0.5X TBE and prerun at low wattage for 10 min. 4. Load oligonucleotides to gel. 5. Run narrow gels at 35 W. Run wide gels at 80 W. Run until Bromophenol Blue is 3/4 way down. 6. Decant buffer from apparatus. Remove gel and lay flat. 7. Remove comb and side spacers. Pry apart plates with a spatula. If the gel is stuck to the top plate, resettle plates and invert. 8. Lift the upper plate off. If bubbles arose, wet gel with 10% Acetic Acid and work them out. Pat dry gently with a Kim-Wipe. 9. If 35S or 33P nuclides are used: A. Soak gel 15 min in 10 % Acetic acid. Pat dry. B. Cover gel with Whatman 3MM paper. Lift off gel stuck on paper. Cover with plastic wrap. C. Dry in vacuum gel drier for 20 min at 80 C. If soaked, dry 60 min. D. If soaked, removed plastic wrap.

E. Expose to X-ray film. 10. If non-radioactive, stain with Ethidium bromide for 5 min. Illuminate with ultraviolet Acrylamide Urea Gel (35 ml) 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 11:03:00 Acrylamide Urea Gel (35 ml) 10% 15% 40/2% acrylamide 10 ml 13.1 ml 10X TBE 3.5 ml 3.5 ml Urea 15 g 15 g H20 10ml 7.0 ml

Microwave ~10 seconds and stir until dissolved Degas 1-2 min Add 0.3 ml 10% ammonium persulfate Add 35 microliters TEMED. Pour Gel and wait at least 20 minutes before removing comb. The gel can be stored overnight at room temp. if the top of the gel is wet with water and is wrapped tightly in Saran Wrap 实验频道录入:Protocol 责任编辑:Protocol

Preparation of denaturing 6% polyacrylamide gels for microsatellite analysis 信息来源:本站原创 更新时间:2004-7-29 11:04:00 Preparation of denaturing 6% polyacrylamide gels for microsatellite analysis (also for SSAP, high-resolution IRAP/ISSR and other analyses) Saadiah Jamli and Pat Heslop-Harrison November 2003 University of Leicester Preparation of the plates

Bigger plate for treatement with Repel-silane a) Wear gloves. Clean the plate with laboratory detergent (type used for cleaning radioactivity – e.g. 25% Lipsol) and warm water. Rinse. b) Clean the upper surface with 100% ethanol. Using blue rolls of tissues, polish until it 'squeaks'. c) Apply a few drops of Repel-silane to the upper surface of the plate and spread evenly using blue roll. d) Wipe with warm water and then 100% ethanol, and let air dry.

Change gloves between working with Repel-silane and Bind-silane Eared plate for binding a) Clean the plate with detergent (25% Lipsol) and warm water. (You may also need to use a razor blade to remove old bits of gels that have stuck). Rinse. b) Clean the upper surface with 100% ethanol. Using blue roll, polish until it squeaks. c) Apply 20 ml Bind-silane to the upper surface of the plate and spread evenly using blue roll. d) Wipe with warm water and then 100% ethanol, and let air dry.

Ensure the spacers are clean and dry. Align and sandwich between square plate and the eared plate. Secure plates with bulldog clips.

Preparation of polyacrylamide gel With gloves, prepare 4.5 ml acrylamide solution (care – neurotoxin) 3.0 ml 10X TBE 14.4 g urea Top up with deionized water to 30 ml for 20cm x 20cm plates. De-gas this mixture (evacuate 2-3 times in a vacuum desiccator). Add 15 ml TEMED to the solution. Add 150 ml 10% fresh ammonium persulfate (or from aliquots frozen at –20C) and swirl around.

Working quickly (maximum 5 min), pour the gel mix on square plate carefully to avoid bubbles, while sliding in the eared plate (or use a 50ml syringe). Insert comb into to of plate: if using sharkstooth/sawtooth comb, place flat side against the top of the gel, displacing some liquid. Leave to polymerise for about 1 hour. Remove top spacer, and wash well with distilled water from a wash bottle to remove both unpolymerized acrylamide and crystallized urea. This is very important. Wash bottom of gel to removed unpolymerized acrylamide. Polyacrylamide gel running Pour 1X TBE into the top reservoir and lower reservoir of the gel apparatus. Pre-run at 25 watts for 30 minutes to 'clean' and pre-heat gel. Meanwhile denature the PCR reaction for 5 minutes at 95OC and straight away place on ice. Load the sample. Marker ladder: 5 ml hyperladder + 3 ml formamide loading buffer PCR reaction: 3 ml PCR product + 3.0 ml formamide loading buffer Load 6 ml of each sample into individual wells of the gel Run gel until the dark blue just runs off the bottom of the gel or as appropriate. Silver staining a) Fixer (10% acetic acid) Add 50 ml glacial acetic acid to 450 ml distilled water b) Silver stain

Add 3 ml 1N silver nitrate solution in 500 ml distilled water. Then add 0.75ml formamide c) Developer

Dissolve 15 g sodium carbonate in 500 ml distilled water and put at 4OC 1. Remove the gel and separate the plates carefully with a single-edged razor blade. 2. Place the gel in tray with the fixer and leave shaking in a fume hood for 30 minutes. Pour off fixer (save). 3. Wash with water for 10 – 15 minutes, on shaker. Rinse again and pour off the water.

4. Add silver-stain and leave shaking for 30 minutes (Silver stain can be re-used up to 10 times). 5. Immediately before developing the gel, add in 75 ml sodium thiosulphate solution (0.1N) and 0.75 ml formamide to the pre-chilled developer solution. 6. After silver-stain (step 4), agitate the gel several times for 10 seconds.

7. Immediately agitate the gel in the developer until band development progress sufficiently. 8. Stop the reaction by adding the fixer saved earlier (step 2). Agitate until bubbles cease. 9. 10. 11. Rinse gel in water for 20 minutes. Leave to surface dry by standing vertically for 10 min. Scan the gel with a computer flatbed scanner, or photograph.

相关文章:
蛋白质银染原理与方法
(3.65g) 加双蒸水至 250ml 10min 冲洗 双蒸水 3 次 我室固定的蛋白银染方法,效果很不错,也很简单,步骤如下: 1)PAGE 切下后用 50%乙醇(100ml ...
蛋白胶银染方法
跑胶银染 46页 1下载券喜欢此文档的还喜欢 银染经验谈 2页 免费蛋​白​胶​银​染​方​法 暂无评价|0人阅读|0次下载|举报文档硝酸...
银染操作步骤
4. 增敏:(辅染)现配现用 弃水,加入100ml银染增敏液(1X),在摇床上室温...或采用适当的方式制备成干。 常见问题: 1. 背景太深: a. 显色时间过长...
银染
银染操作步骤 3页 2下载券 银染 暂无评价 2页 免费 银染经验谈 2页 免费 银染方法 2页 免费 我们实验室用的银染方法 9页 免费 跑胶银染 46页 1下载券 银...
跑胶遇到问题
跑胶遇到问题_生物学_自然科学_专业资料。SDS-PAGE 电泳 蛋白质的分子量大小不...每个加样孔的最低蛋白质的质量是:0.1μg(考马斯亮蓝染色) ,2ng (银染) ...
考染与银染
考马斯亮蓝染色法经过改进能获得高的蛋白质检测灵敏度,甚至可与银染媲美。 银染法是利用银离子与氨基酸共价结合,还原剂的加入使与内蛋白质结合的银离子形成金属...
我们实验室用的银染方法
我们实验室用的银染方法_医药卫生_专业资料。我们实验室用的银染方法 1.50%...呵,传张 的照片佐证啊! 顺便请教一下各位, 为什么我跑电泳的时候靠近电极的...
银染电泳实验方法
E. 开始电泳,电压 150V 跑 70min。 F. 结束电泳,将 15%拆开固定 15min—水洗 6min—致敏 5min—水洗 1min—银染 15min—水洗 5s— 显色至条带清晰...
PAGE 电泳过程及银染
PAGE 电泳过程及银染电泳过程 1. 将玻璃板装入电泳槽,拧紧。 2. 做封口:称量...点样量为 1.2ul,点完一个电泳槽后插上电线 300V 开 始跑电泳大约跑 25...
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验 一 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配制溶液: 1、30% ...配置 10%的 10ml:8M*10ml*60g/mol=4.8g 尿素 6.1ml water 3.3ml 30...
更多相关标签: