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免疫组化技术


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第八讲 免疫组织化学技术

谢谆怡 全军免疫学研究所 2010-07-27

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内容概要
第一部分 免疫组织化学技术
第一节 组织与细胞标本的取材和保存 第二节 免疫组织化学的基本技术 第三节 免疫酶组织化学技术 第四节 免疫荧光组织化学技术 第五节 结果的分析和判断

附 免疫组化实验室简介

第二部分 ELISA、ELISPOT技术简介

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第一部分 免疫组织化学技术
(Immunohistochemistry,IHC)

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CD3/FOXP3 double staining Red color, membranous for CD3 Brown nuclear color for FOXP3 BMC Cancer 2008; 8:57

Red color, different cellular organelle Green nuclear color for STING Nature 2008; 455:2

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JCI;119(9)

组织原位标记出 抗原特异性T细胞

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基 本 原 理

酶/荧光标记抗体

抗原抗体反应 组织抗原

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基 本 原 理

免疫 immuno- 抗原抗体的免疫反应 组织 histo- 检测组织中表达的抗原性分 子 化学 chemistry 酶促/荧光可见反应 Immunohistochemistry,IHC 免疫组织化学技术——检测组织原位表达的肽类、激素、神经递
质、细胞因子、受体、表面抗原等抗原性物质

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基 本 流 程
Western-blot? FACS?
①取材

ELISA?

特异性 敏感性 定位性

⑥结果判断 ②组织处理 ⑤显色 ④特异性抗体结合

③切片

YY

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? 内容概要 二、培训提纲及概要
第一部分 免疫组织化学技术 第一节 组织与细胞标本的取材和保存 第二节 免疫组织化学的基本技术 第三节 免疫酶组织化学技术 第四节 免疫荧光组织化学技术 第五节 结果的分析和判断 附 全军免疫学研究所免疫组化实验室简介

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基 本 流 程

①取材

⑥结果判断 ②组织处理 ⑤显色 ④特异性抗体结合

③切片

YY

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二、培训提纲及概要 第一节 组织与细胞标本的取材和保存
组织和细胞标本的准备 石蜡切片 冰冻切片 组织与细胞材料的保存

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一、组织和细胞标本的准备 1.组织标本的取材 —— 取材新鲜,固定及时,形态完好
人体组织标本 手术切除标本 主要病灶 病灶与正常组织交界处 远离病灶的正常组织 珍贵、慎重 尽快处理固定

活检穿刺标本 尸体解剖标本

动物组织标本

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一、组织和细胞标本的准备 1. 组织标本的取材

Tips

刀剪锐利 保持清洁 组织大小合宜 (长1cm×宽1cm×厚0.2~0.3cm) 明确编号登记

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一、组织和细胞标本的准备 2. 细胞标本的准备
活体细胞标本 印片法、穿刺吸取法、沉淀法 培养细胞标本 ⑴ 细胞涂片: 将细胞制成悬液(10^6)涂在 涂有切片粘合剂的载玻片上, 晾干后固定(细胞甩片) ⑵ 细胞爬片: 将细胞直接培养在盖玻片上 将细胞直接培养在6孔或9孔板上 防止脱片 玻片预处理(多聚赖氨酸)、温和操作

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一、组织和细胞标本的准备
取材后如何保持组织细胞结构与抗原活性?

3.固定
PURPOSE (1)保持形态 终止和抑制外源性和内源性酶活性,防止

组织细胞的死后变化,防止自溶和腐败,保持组织细胞的 固有形态。 (2)保存抗原 使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种

抗原成份转变成不溶性物质,以保持它原有的结构和定位 与生活时相仿。

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一、组织和细胞标本的准备

(3)硬化作用

固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增

加组织硬度、便于制片 (4)便于观察 使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而

产生不同的折射率,造成光学差异,以便染色后易于鉴别 和观察;经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着 色清晰,便于辨认

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一、组织和细胞标本的准备 固定剂
(1)醛类固定剂 醛类为交联剂,其作用是交联组织中的氨基,保存抗 原于原位。其特点是组织穿透力强,收缩小。常见有:福 尔马林、多聚甲醛等 (2)丙酮及醇类固定剂 该类固定剂为沉淀剂, 其作用是沉淀蛋白质和糖, 组 织穿透性很强, 保存抗原的免疫活性较好。如乙醇 ,氯仿, 冰醋酸等

如何选择?

膜蛋白需用多聚甲醛固定 醇类固定对抗原保存更好

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一、组织和细胞标本的准备 固定方法
(1) 浸入法(Immersion method) 将组织浸泡在固定液内,必要时可在低温(4℃)环 境下进行,固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质 而定,一般在2-12h之间。 (2) 灌注法(Irrigation method) 适用于动物实验、神经组织研究。 自左心室插入主动脉,先以生理盐水冲冼血液后,灌 注固定液。置灌注动物于4℃冰箱内,次日取出脑组织或 其它组织。
灌注法:固定液迅速达到全身各组织,充分固定, 灌注冲洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰 浸入法:主要用于活检和手术标本

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影响固定的因素 1.温度 常规固定温度是室温(22℃),某些酶的固定 要求在37℃下进行,某些病毒则需在低温下固定。冰冻切 片用丙酮固定,最佳在-20℃至4℃ 2.浓度 10%中性甲醛,4%多聚甲醛,乙醇常用95%, 丙酮为原液 3.时间 固定时间要视组织块的大小,固定液的种类 和浓度,固定所处的环境温度等条件而定。原则上,组织 块大小与固定时间成正比 Tips 固定后可在70%乙醇中保存较长时间

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固定组织时应注意: *力求保持组织新鲜, 勿使其干燥, 尽快固定处理. *组织块不易过大过厚, 必须小于 2cm x 1.5cm x 0.3cm, 尤其是组织块厚度须保持在0.3cm 以内. *固定剂必须有足够的量, 在体积上一般大于组织20倍。 *组织固定后, 应充分水洗, 去除固定剂, 以减少固定剂 造成的人为假像.

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组织取材
目的? 厚度? μm

切片

怎么实现? 石蜡切片、冰冻切片

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二、石蜡切片
石蜡组织块制作 (1)取材 (2)固定 (3)梯度酒精脱水、二甲苯透明及浸蜡 (4)包埋

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步 骤
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13)

操作项目
60%乙醇 70%乙醇 80%乙醇 90%乙醇 95%乙醇Ⅰ 95%乙醇Ⅱ 无水乙醇Ⅰ 无水乙醇Ⅱ 二甲苯Ⅰ 二甲苯Ⅱ 石蜡Ⅰ 石蜡Ⅱ 石蜡Ⅲ

小 鼠
15min 15min 20min 20min 20min 20min 20min 20min 5min 3min 10min 20min 30min

大 鼠
20min 20min 30min 30min 30min 20min 30min 30min 8min 5min 15min 25min 30min


30min 30min 40min 40min 40min 30min 40min 40min 10min 5min 20min 30min 40min

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二、石蜡切片
石蜡切片的制作 1-6微米,制作大批的或是连续的切片,长期保存 切片质量的好坏:技术熟练程度、切片机、切片刀

45℃ 恒温 箱中 烘干 后保 存

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三、冰冻切片
减少冰晶形成! (1)液氮法 ①组织块平放于包埋盒内,加OCT包埋剂浸没组织 ②将包埋盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底 接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位 切勿浸入液氮中 ③大约10-20s组织即迅速冰结成块 ④取出组织块立即置入-80℃冰箱贮存备用 或置入恒冷箱切片机进行冰冻切片 (2) 干冰-丙酮(酒精)法 Tips 将组织置于20%-30%蔗糖溶液1~3天,利用高渗吸 收组织中水分,减少组织含水量。

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三、冰冻切片
5-8微米 晾干后(固定) -20℃ ~ -70℃ 根据不同组织调节温度 肝/脾/肾 -10℃ ~ -15℃ 皮肤/胃/肠 -18℃ ~ -20℃ 脂肪组织 -20℃ ~ -25℃

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石蜡切片?冰冻切片?
冰冻切片 ?优点 能够较好的保存组织的抗原免疫活性 最突出的优点! 细胞表面抗原更应该采用冰冻切片 标本处理和实验过程均较快捷 ?缺点 细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构,可能使抗原弥散 切片厚度较石蜡的厚,图像不如石蜡切片漂亮 石蜡切片 ?优点 保持组织细胞形态结构好 容易存放在室温 ?缺点 固定、高温处理过程使抗原的失活

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石蜡切片?冰冻切片?
Tips 要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片;但是要求 做石蜡切片的,一般可作冰冻切片。 因为作石蜡切片时要高温烤片,可能会破坏组织的 抗原性,如果组织的抗原性较稳定,则可作石蜡切片 抗体的选择?

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Tips 载玻片处理——防止脱片
(1)载玻片和盖玻片清洗 清洁液浸泡12~24h 流水充分漂洗后用蒸馏水清洗5遍以上 浸泡在95%酒精内2h 用绸布擦干或烤箱烤干,贮放于玻片盒内备用 必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液清洗

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Tips 载玻片处理——防止脱片
(2)载玻片上涂粘附剂 ①多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine) 多聚阳离子,0.1% w/v 储液,使用浓度0.01% ②APES试剂(3-氨基、丙基三氧基硅烷) 应垂直烤片而不能水平烤片,否则,组织片中易出现气泡 ③铬矾明胶液 铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml ④甲醛明胶液 40%甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml

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四、组织与细胞材料的保存
1.冷冻保存 -80℃,-145℃,-198℃ 组织应在离体30min内,快速取材,放入专用冷冻管 中,并编上号,登记在册 2.蜡块的保存 3.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片 上,9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用,大容量培 养的细胞收集冻存在液氮中 4.切片的保存 石蜡切片:长期保存,4℃ 冰冻切片:丙酮快速固定后-20℃保存6个月

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四、组织与细胞材料的保存

CBS液氮冻存系统
冻存腔内无液氮 样品之间交叉污染可能性降低 使用者安全性增高 自动控制系统 -188℃至-195℃ 稳定冻存状态 大容量 2ml冻存管(×23400)

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? 培训提纲及概要 二、培训提纲及概要
第一部分 免疫组织化学技术 第一节 组织与细胞材料的取材和保存 第二节 免疫组织化学的基本技术 第三节 免疫酶组织化学技术 第四节 免疫荧光组织化学技术 第五节 结果的分析和判断 附 全军免疫学研究所免疫组化实验室简介

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第二节 免疫组织化学的基本技术
实验初步设计 石蜡切片脱蜡至水 抗原的暴露和修复 抗体的选择和质控 最佳稀释度的测定和保存 免疫组化常用缓冲液

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一、实验初步设计
1. 查阅文献,列出拟做IHC指标 选购特异性抗体和检测试剂 2. 列出IHC实验操作流程, 选择IHC前处理方式 3. 通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度 严格设置对照 4. 每批实验应用同一稀释度一抗、孵育时间和温度 及同一的显色时间 5. 列出阳性判定的标准 预期达到的目标

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二、石蜡切片脱蜡至水
冰冻切片从-20℃取出,晾干后可直接进行免疫组化标 记。石蜡切片需经如下脱蜡复水才能做IHC: 二甲苯Ⅰ 二甲苯Ⅱ 二甲苯Ⅲ 无水乙醇 95%乙醇 85%乙醇 75%乙醇 流水冲洗 10min 10min 10min 2min 2min 2min 2min

Tips 脱蜡不完全——假阴性!染色不均!

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三、抗原的暴露和修复
Why? 最优固定剂甲醛
甲醛使蛋白质发生凝固,自身和蛋白之间会发生交 联,交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发 生改变,使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变, 而影响检测。

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三、抗原的暴露和修复
抗原修复(Antigen Retrieval; AR) 酶消化 去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白;断交联 热修复 以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的 一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技 术手段

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三、抗原的暴露和修复
酶消化
胰蛋白酶 0.05%~0.1%,pH 7.8,37℃ 30min 胃蛋白酶 0.4%,0.01N HCl,37℃ 30~180min 蛋白酶K 20μg/ml,pH8.0 0.5M Tris-HCl,37℃ 20~40min 链酶蛋白酶 0.1%,pH 7.4 0.5M Tris-HCl,37℃ 1~4h 无花果蛋白酶 0.1%,0.2M pH7.4 PBS,37℃ 30~60min 菠萝蛋白酶 0.4%~1%,0.01M pH7.4 PBS,37℃ 30~120min 尿素 3M, 37℃ 5~30min 胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前 消化,其余蛋白酶均为细胞内抗原的显示消化。 在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳pH值,消化温 度、浓度和孵育时间。

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三、抗原的暴露和修复
热修复
修复方法 ①微波96℃±10min×2 ②直接加温100℃,15min ③水浴锅100℃,15min ④高压锅/消毒锅120℃,5min 修复介质 0.05MEDTA;0.05MEGTA; 0.01M pH6.0 柠檬酸缓冲液; 0.05MTris-HCL(pH1-12系列);0.01M pH7.0 PBS; 2%硫酸 铝;2%硝酸铝;生理盐水;蒸馏水; 修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小,而 pH值则影响较大





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三、抗原的暴露和修复
Tips 热修复注意事项
①热处理后应注意自然冷却 ②热处理液不要让其煮干 ③不要任何抗原的检测都使用该方法 ④同一批抗原的检测其温度和时间需保持一致 ⑤注意形态学结构的改变:核破裂,苏木素淡染 ⑥修复液的改良:试用不常用的修复液,或加入螯合剂
高温AR因其机理尚不清楚,对某些存在的问题或现象不可能用设 计对照的方法加以解决或解释清楚,例如,有些抗体在冰冻切片上不 表达,或表达率很低,但石蜡切片用AR后,却能很好地表达;某些应 表达在胞浆或膜上的抗原,经过量修复后,绝大部分表达在核内;某 些应表达在核内的抗原,经过量修复后出现在细胞浆内。因此对结果 的判断要作出客观的分析。

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四、抗体的选择和质控
1.选购抗体的注意事项
(1) 单克隆抗体,多克隆抗体,种属
单克隆抗体特异性强、所染切片背景清晰和定位明确,但阳性率较低 多克隆抗体阳性率高,但特异性较差,如果操作不规范易出现假阳性

(2)特异性,交叉反应 (3)能否用于石蜡切片 (4)用何种组织前处理形式
石蜡切片抗原修复的方式?冰冻切片固定方式?

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一抗?二抗? YY YY
V区 具有抗原结合能力,变异度大 C区 序列保守,含有种属特意性标志

一抗:针对组织细胞抗原的特异性抗体 二抗:种属特异性抗体,针对一抗种属特异性标志

YY

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四、抗体的选择和质控
2.抗体最佳稀释度的测定——直接测定法
一抗稀释度 1:50 1:100 1:200 1:400 1:500 阴性对照 特异性染色 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ (-) 非特异性染色 ++ ++ ++ + (-) (-)



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四、抗体的选择和质控
3.一抗和二抗最佳稀释度的选择——棋盘法
第二抗体 稀释度 1:100 1:200 1:400 一抗稀释度 1:50 1:100 +++ √(-) + (-) 1:200 +++ (-) ++ (-)
(-)

1:400 + (-) + (-)
(-)

++++(++) ++++(++) ++++(±) ++(-)

* 括弧内为非特异背景染色

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四、抗体的选择和质控
3. 抗体的使用和保存
抗体稀释液 1克明胶溶在300ml 0.2M pH7.6 TBS中,加温,搅拌使其 溶解,待其冷却后,加入1克牛血清白蛋白和100mg NaN3 4℃保存 抗体的保存 加入防腐剂的商品化一抗或自制一抗,4℃保存一年 一次购置量大,可10μl/支分装,-20℃至 -70℃保存 抗体稀释液稀释一抗可在4℃中保存数月

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四、抗体的选择和质控

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五、IHC常用缓冲液
0.01M pH7.4 PBS 0.05M pH7.6 TBS

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? 内容概要 二、培训提纲及概要
第一部分 免疫组织化学技术 第一节 组织与细胞材料的取材和保存 第二节 免疫组织化学的基本技术 第三节 免疫酶组织化学技术 第四节 免疫荧光组织化学技术 第五节 结果的分析和判断 附 全军免疫学研究所免疫组化实验室简介

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第三节 免疫酶组织化学技术
显示系统及衬染剂的选择 基本原理
酶标记抗体法 卵白素-生物素法 多聚合物酶法

基本操作步骤 抗原定位及非特异性染色

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一、显示系统及衬染剂的选择
1. 酶和底物 辣根过氧化物酶 HRP DAB 3,3’-二氨基联苯胺
3、3’-diaminbezidine 0.03%~0.05%,需过滤 浓硫酸处理用具

不溶性棕褐色颗粒状产物 封片后避光保存 红色可溶性产物 不可长期保存 蓝色或紫蓝色沉淀 玫瑰红、深蓝色产物

ACE
3-氨基-9-乙基卡唑 (3-amino-9-ethlylcarbazde)

碱性磷酸酶 AKP BCIP+NBT(四氮唑蓝) α–萘酚AS-BI磷酸盐 +快红或快蓝

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一、显示系统及衬染剂的选择
Tips 内源性酶的消除
内源性过氧化物酶 骨髓、胎盘、脾 (富含血细胞) 0.3%~3%H2O2甲醇液20min 内源性碱性磷酸酶 肠组织、中性粒细胞 1mol/L左旋咪唑 20min 内源性生物素 肝、脾、肾、脑及胚胎组织 25μg/ml卵白素孵育15min,PBS洗10min, 移至生物素饱和液中处理15min,PBS洗 15min

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一、显示系统及衬染剂的选择
衬染剂的作用? IHC染色后必须进行衬染,以衬托出组织形态结 构,使形态与机能密切相关,以利于结果的分析。 苏木素 (1)Mayer氏苏木素:核红紫色,长期不褪色 (2)Harris氏苏木素:常规HE用核染剂, 分化后呈蓝色 甲基绿 核固红 常用于冰冻切片免疫酶染色后衬染 用于衬托酶的蓝色显色(快蓝、4氯-1-萘酚)

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一、显示系统及衬染剂的选择

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二、基本原理
1.酶标记抗体法 —— 直接法
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶

步骤:一步完成 特点:方法简便、省时 专一性强,非特异染色轻 但敏感性差 一种标记抗体只能检测一种抗原

直接法

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二、基本原理
1.酶标记抗体法 —— 间接法
组织抗原 第二抗体 第一抗原 过氧化物酶

步骤:两步完成 特点:敏感性较直接法高 一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体,检测多种抗原 但较直接法费时

间接法

非特异染色稍重

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二、基本原理
2.生物素-亲和素法 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法 (ABC 法)
亲和素 Avidin HRP 酶标记生物素 Biotin-HRP Complex

生物素标记二抗 Avidin- Biotin-HRP Complex ABC复合物

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二、基本原理
2.生物素-亲和素法 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法 (ABC 法) 步骤:三步法 一抗、生物素标记二抗、ABC复合物 特点:敏感性较高 特异性强 应用范围广 SABC法 Streptavidin 取代 avidin 链亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法
生物素标记二抗

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二、基本原理
2.生物素-亲和素法 链亲和素-过氧化物酶连接法 (S-P法)

步骤:三步法 一抗、生物素标记二抗、酶标记亲和素 特点:操作更为简便

HRP 酶标记的链亲和素

生物素标记二抗

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二、基本原理
组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架

3.多聚合物酶法
最简便的方法 特异性高,无背景染色 但抗体不全,价格高昂

原理 采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架,将特异 性抗体和 HRP 同时标记 在多聚合物分子上,形成 HRP--多聚合物--特异性 抗体聚合物

EPOS方法

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二、基本原理
组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚骨架

3.多聚合物酶法

EnVisionTM方法

第一步

第二步

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三、基本操作步骤
抗原修复 内源性过氧化物抑制 二抗来源正常血清封闭 第一抗体 第二抗体 酶标记体 DAB- H2O2显色 脱水 封片

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例:石蜡切片SABC法染色步骤
1)石蜡切片脱蜡、水化 2)PBS洗两次各5分钟 3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。 4)抗原修复 5)PBS洗5分钟 6)滴加二抗来源动物正常血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体 7)滴加1抗,室温或者37℃ 1小时或者4℃过夜(4℃过夜后在室温复温45分钟) 8)PBS洗三次每次5分钟 9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃ 20分钟 10)PBC洗3次每次5分钟 11)滴加试剂SABC,20℃~37℃ 20分钟 12)PBS洗4次每次5分钟 13)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度) 14)蒸馏水洗,苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化 15)脱水、透明、封片、镜检

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四、抗原定位及非特异性染色
1. 抗原定位 (胞浆内、核内、胞膜上或细胞外基质)
特定抗原表达在特定部位! 如LCA应定位在细胞膜上;CK应定 位在细胞浆内;PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等。不在抗 原所在部位的阳性着色,一概不能视为阳性

HBsAg胞浆定位

ER胞核定位

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四、抗原定位及非特异性染色
2.非特异性染色
特异性抗体不纯 抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异 很大,可引起非特异染色 一抗的交叉反应 共同抗原决定簇 特异性抗原弥散 IgG Fc 受体干扰

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? 内容概要 二、培训提纲及概要
第一部分 免疫组织化学技术 第一节 组织与细胞材料的取材和保存 第二节 免疫组织化学的基本技术 第三节 免疫酶组织化学技术 第四节 免疫荧光组织化学技术 第五节 结果的分析和判断 附 全军免疫学研究所免疫组化实验室简介

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第四节

免疫荧光组织化学技术

常用荧光素简介 免疫荧光组化染色方法 非特异性荧光的消除方法 双重或多重组化染色 Pentamer组织原位染色

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一、常用荧光素简介
异硫氰酸荧光黄(FITC)

最大吸收光谱为490~495nm,最大发射光 谱为520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光 罗达明衍生物,易溶于水,最大吸收 光谱为550nm,最大发射光谱为 620nm,呈橙红色荧光 Cy3 橙红色荧光,Cy5 红色荧光 橙红色荧光

四甲基异硫氰酸罗达明(TRITC)

花青(Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5) 得克萨斯红(Texas red)

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二、免疫荧光组化染色方法
直接法
用已知特异性抗体与荧光素结合,制 成荧光特异性抗体,直接与细胞或组 织中相应抗原结合。 优点 特异和简便 缺点 一种荧光抗体只能检查一种抗原 敏感性较差

间接法 先用特异性一抗与细胞标本反应,
再用荧光二抗与结合在抗原上的抗 体结合,形成抗原-抗体-荧光抗体 的复合物。 优点 提高了敏感性 只需要制备一种种属间接荧 光抗体,可以适用于多种第一抗体 的标记显示

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二、免疫荧光组化染色方法
免疫荧光染色后,为了衬托出细胞和组织的固有形态结构,增加特异性 荧光的可见性,缩短照相时间,根据特异性结合荧光染料发射光的颜色,选 择不同颜色的复染荧光染料 DAPI (4,6—二氨基—2—苯基吲哚) 经典的细胞核和染色体复染剂。DAPI可选择性与dsDNA结合,细胞质几乎 没有背景染色,它的相对低水平的荧光发射不能被来自标记二抗上的绿色或 红色荧光淹没。

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二、免疫荧光组化染色方法
直接法操作流程
(1)冰冻切片经固定,晾干 PBS洗涤2×3min ;石蜡 切片脱蜡至水,抗原修 复,PBS洗涤2×3min (2)适当稀释荧光抗体滴加 在组织切片上,湿盒内 37℃温育1h (3)DAPI复染5min PBS洗涤3×3min (4)pH9.0缓冲甘油封片, 镜检

间接法操作流程

及 早 观 测

(1)冰冻切片与石蜡切片预 处理同左 (2)适当稀释特异性一抗, 37℃孵育1h,或室温4h, 或4℃过夜,PBS洗3×3min (3)荧光标记二抗适当稀释 37℃ 30min,PBS洗3×3min (4)DAPI复染5min PBS洗涤3×3min (5)封片,镜检

缓冲甘油封片介质 0.5mol/l碳酸盐缓冲液(pH8.5),l0ml;无荧光甘油(AR级),90ml 商品化的防淬灭封片剂

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三、非特异性荧光的消除方法
1.荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价, 将荧光抗体稀释至一临界浓度,使特异性染色呈阳性,而 使非特异性染色保持阴性

2.伊文氏蓝衬染法
用0.01%伊文氏蓝的PBS稀释荧光抗体,可将背景细胞和组 织染色,呈红色荧光,与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比, 减少了非特异性荧光

3.切片处理
在加一抗前用胰酶消化组织切片,用第二抗体动物非免疫 血清(1:5-20)或1-5%牛血清白蛋白封闭

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免疫荧光化学 & 免疫酶组织化学
免疫荧光染色优缺点

?优点 步骤简单,节约时间
在多重标记中应用更方便 ?缺点:组织结构不够明晰 切片不能长久保存 需要荧光显微镜

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四、双重或多重组化染色

Increased PD-L1 expression in infiltrating cells and nonparenchymal antigen presenting cells in livers with chronic HBV infection

76

四、双重或多重组化染色
在同一标本上有两种或两种以上抗原需要同时显示, 可同时或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物来标记 免疫荧光双重标记 FITC-TRITC, FITC-Cy3, Alexa Fluor488-Alexa Fluor 免疫酶双重标记 单酶双底物: HRP-DAB/Ni-DAB; AKP-FRed/FBlue 双酶双底物 混合双重标记 酶标记与荧光素配伍

77

四、双重或多重组化染色
消除两种单抗之间的交叉反应 1. 选择不同种属来源的一抗 2. 位点封闭法
第一重染色(抗A)完成后用一抗(抗B)来源动物未免疫血清 封阻潜在结合位点

3. 解离洗脱法(酶法)
第一重染色完成后用高离子或强酸液处理切片,解离第一 重免疫复合物,但第一重的成色产物仍被留下

做好单染预实验 注意指示物的使用顺序:不溶→可溶,强→弱

78

扁桃体 CD3 AKP-FBlue CD20 HRP-DAB

肿瘤 CD34 AKP-FBlue CK8/18 AKP-FRed 扁桃体 CD3 HRP-DAB CD20 HRP-Ni-DAB Multi-CK HRP-purple

79

五、Pentamer 组织原位染色
CD8 MHC-肽

JCI;119(9)

CD8/pentamer CD8

荧光基团

Proimmune

CD8/pentamer Fig. Accumulation of PV NP205-specific CD8 T cells in the islets of Langerhans

80

? 内容概要 二、培训提纲及概要
第一部分 免疫组织化学技术 第一节 组织与细胞材料的取材和保存 第二节 免疫组织化学的基本技术 第三节 免疫荧光组化技术 第四节 免疫酶组织化学技术 第五节 结果的分析和判断 附 全军免疫学研究所免疫组化实验室简介

81

第五节 结果的分析和判断
免疫组化结果的判断原则 对照染色设计 非特异性染色 阳性标记的形态特征和判断 染色失败的可能原因 常用图像分析软件Image Pro

82

一、免疫组化结果的判断原则
1. 抗原表达在特定部位 2. 阴性结果不能视为抗原不表达
由于检测方法灵敏度有高低之分,有时可因染色方法灵 敏度不够,而导致阴性反应,判断时应注意

3. 尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的 阳性表达
特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干 扰,或系人为因素所致。

4. 同时设对照染色

83

二、对照染色设计——目的?
阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原的同源及不同源
组织切片或细胞涂片与待检实验切片同 时作同样处理和免疫染色的组织对照

阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免
疫标记染色的组织对照。正确的结果应 为阴性,目的是除外假阳性

阴性试剂对照 为证实特异性抗体试剂的有效
性和可靠性而所设立的同步免 疫染色对照,常用有:空白对 照、替代对照

自身对照 自身对照是指在同一标记切片上
的自身组织成分的阴性背景对照

84

阴性试剂对照
空白对照 指以缓冲液(PBS、TBS等)取代第一抗体(主要的, 必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代),其他各步不 变的试剂对照染色,结果应为阴性 取代对照 指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清,或与本 实验无关的抗体(靶生物缺如的)取代第一抗体,其他步骤不变的 试剂对照染色,结果应为阴性 吸收试验 抑制试验
原则 ①空白对照不能省,其他对照在预实验中应尽量多做,尤其是应用新抗体试剂 ②对照必需与实验片同步进行染色 ③对照的结果应附合要求

85

三、非特异性染色
非靶抗原着色、假阳性、背景着色
①内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源性生物素等) ②试剂污染(质量差,交叉反应,Fc受体干扰等) ③组织处理不当(组织固定不及时或固定不良所导致的抗原 弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等) 解决办法 在预实验基础上,采用有针对性的纠正对策

86

四、阳性标记的形态特征和判断
免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标, 与抗原含量有关 阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位 指标,与功能有关 阳性标记 "弱(+)、中(++)、强(+++)"

免疫荧光法(FITC为例) 表现为浅绿色荧光、明显 绿色荧光和亮绿色耀眼荧光

87

免疫酶标记(HRP- DAB/H2O2)则表现为淡黄色细颗粒、棕 黄色颗粒和褐黄色粗颗粒,后者耀眼易见。图像摄影原则上 多取强阳性区域。

HER2

88

六、常用图像分析软件 合理分析和看待数据!

计算阳性表达的光密度 计算阳性表达区域面积 计算阳性表达细胞

89

五、染色失败的可能原因
何为染色失败? 实验成功的标准?
两个基本要求: ①实验切片的阳性抗原定位准确,呈色鲜明,背景着色浅或 无,二者的比值应大于1(阳性/背景) ②对照染色的结果应附合要求

染色失败
假阳性 指实验切片呈阳性,阴性组织对照或阴性试剂对照 也呈阳性的结果 假阴性 指实验切片呈阴性,阳性组织对照及阴性试剂对照 也均呈阴性的结果

90

五、染色失败的可能原因
假阴性
①组织处理不当,抗原丢失过多或被遮蔽 ②抗体失活、效价过低或稀释度不合适(主要指一抗 即特异性抗体) ③染色步骤遗漏及差错,或显色剂的选择、缓冲液的 pH和离子强度不当等

假阳性
①自发荧光或内源酶等干扰 ②抗体试剂不纯 (特别是一抗) ③操作失误,如污染、切片干枯或显色剂操作不当等 ④Fc受体的干扰等

91

对照结果判断
阳性对照 1 (-) 2 (+) 3 (+) 4 (-) 5 (+) 6 (+) 7 (+) 阴性对照 (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-) 替代对照 检测结果 (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (+) (-) (+) 结果判断 抗体失活,缓冲液有问题, 操作有误 非特异性染色 阴性对照内含定位抗原 阳性对照不含定位抗原 非特异染色 检测标本不含抗体结合可靠 检测标本含抗体,结果可靠

*表中1~5结果无效,6、7结果可靠

92

? 内容概要 二、培训提纲及概要
第一部分 免疫组织化学技术 第一节 组织与细胞材料的取材和保存 第二节 免疫组织化学的基本技术 第三节 免疫荧光组化技术 第四节 免疫酶组织化学技术 第五节 结果的分析和判断 附 全军免疫学研究所免疫组化实验室简介

93

附 免疫组化实验室(208)简介

Leica RM 2235 转轮式切片机 PHY-III 病理组织漂烘仪 Leica CM 1900 冷冻切片机

94

内 容 概 要
第二部分 相关技术简介
ELISA 技术 一、基本原理 二、常用方法简介 ELISPOT 技术 一、基本原理和应用 二、基本操作规程 三、常见问题

95

酶联免疫吸附实验
(enzyme linked immunosorbent assays ,ELISA)

96

ELISA 基本原理

酶联 enzyme linked 酶标记抗原/抗体 免疫 immuno- 抗原抗体的免疫反应 吸附 -sorbent 固相吸附 enzyme linked immunosorbent assays,ELISA 酶联免疫吸附实验——体液中微量抗原/抗体检测

97

ELISA法测定乙肝表面抗原

双抗体夹心法
待测样本

底物 酶标记抗 HBsAg抗体

Y Y YY
HBsAg抗体

Y Y YY

YY Y Y

E E E E

98

ELISA实验原理
将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面上,使抗原抗体反应在 固相表面进行,通过洗涤将固相上的抗原-抗体复合物与液相中的游 离成分分离,通过酶标记抗体分解底物发生呈色反应,由此进行定 性或定量分析

固相化抗原抗体结合反应
结合 位点 抗原 二抗 抗体

酶的高效催化作用
酶 底物 有色产物

99

ELISA分类
? ? ? ? ?

双抗体夹心法(测抗原常用) 间接法(测抗体常用) 直接法 竞争抑制法 捕获法

100

双抗体夹心法

Y Y YY
将已知抗体吸附 在固相上

Y Y YY
加入待检样本,样 本中的抗原与固相 上的已知抗体结合

Y Y YY
加入酶标记抗体 酶催化底物显色

主要用于抗原含量测定

YY Y Y

E E E E

101

间接法

将已知抗原包被 在固相上

样本中相应的特异性 抗体(一抗)与固相 中的抗原结合

加入酶标记二抗 酶催化底物显色

主要用于抗体含量测定

Y Y YY Y Y YY

E E E E

Y Y YY

实验流程(双抗体夹心法)
包被抗体 加入样品,结合孵育 洗涤 加入酶标记抗体,孵育 洗涤 加显色剂, 避光孵育 加入终止液终止反应

103

酶联免疫斑点
Enzyme Linked ImmunoSPOT

一、前言 二、技术要点 三、常见问题

Elispot实验结果(透明板)

Elispot实验结果(PVDF板)

104

一、前言
1. ELISPOT技术起源与发展 2. 细胞与细胞因子 3. ELISPOT技术原理 4. ELISPOT 技术的应用 5. ELISPOT的优势

105

1. ELISPOT技术起源与发展
1983年, Czerkinsky&Sedgwick 计数分泌抗体的 B 细胞 1985年, More 使用NC板,改进显色底物,不再需要琼脂糖凝胶 1988年, Czerkinsky et.al. 首次将应用扩展到细胞因子检测领 域,T cell IFN-γ; 同年业发展出双色标记技术 1995年, Schielen et.al. 首次将PVDF膜板引入ELISPOT 1997年, Gui et.al. 发展出计算机辅助的斑点技术技术

106

2. 细胞与细胞因子
T细胞、单核/巨噬细胞等免疫细胞在抗原或者有丝 分裂原刺激下分泌细胞因子
Th1 cells → IFN-γ,IL-2 Th2 cells → IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 Tc cells → IFN-γ, TNF-β, 颗粒酶B,穿孔素 单核/巨噬细胞 → TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-10, IL-12

细胞因子在免疫细胞分化、免疫应答及免疫调节过 程中发挥重要功能

107

3. ELISPOT技术原理
用抗体捕获培养中的细胞分泌 的细胞因子,并以斑点显色的 方式将其表现出来

阳性细胞,也称斑点形成细胞spot forming cell SFC

108

4. ELISPOT技术的应用
ELISPOT在国外的应用已经非常普遍,成为一项免疫学检测常规技术 我们国内,应用起始于疫苗研究方面 中国药品生物制品检定所: 《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》《预防用以病毒为载体 的活疫苗制剂的技术指标原则》“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞 分泌γ干扰素功能,应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方 法” WHO:WHO-UNAIDS-sponsored training workshop : 在艾滋病(HIV)疫苗的研究中,推荐使用ELISPOT检测淋巴细胞分泌 γ干扰素功能。

109

ELISPOT在HIV疫苗研究中的应用
疫苗免疫两周后,猴PBMC对 HIV病毒裂解物的IFN-γ ELISPOT反应 A, 肌肉与粘膜联合免疫;B,单 独肌肉免疫。 Makitalo B. et. al. Enhanced cellular immunity and systemic control of SHIV infection by combined parenteral and mucosal administration of a DNA prime MVA boost vaccine r e g i m e n . J Gen Virol. 2004:2407-19.

细胞免疫在控制HIV主治方面发挥了主要作用, 目前没有 任何疫苗能预防HIV的感染,但是可以减轻感染之后的发 病情况,甚至不再发病。 评价HIV疫苗的好坏不在于激发抗体的能力,而在于它激 发的病毒特异性细胞免疫反应的能力

110

4. ELISPOT技术的应用
疫苗研究
HIV疫苗:在小鼠上检验抗原性;在猴体检验保护功效;在 人体检验免疫原性;研究猴子感染SIV动力学;I型与II型 HIV引发的CTL反应差别; HBV疫苗:疫苗的免疫原性;疫苗的治疗效果;疫苗的给 药途径;不同病人的敏感性 肿瘤疫苗 抗肿瘤甲胎蛋白和热休克蛋白DNA疫苗;DC疫 苗预防胃癌;DC疫苗治疗白血病;卵巢癌中的细胞免疫 情况;日本临床DC疫苗治疗黑色素瘤的情况 其它疫苗:疟疾疫苗:疟疾疫苗产生的CD4+8+T细胞和体 液免疫反应;克隆病疫苗;肝癌疫苗;HPV疫苗; 抗原表位筛选: 结核杆菌的CTL表位;丙肝CTL表位; HIV-1表位肽;用肽库筛选T细胞表位肽;HIV蛋白酶和 整合酶功能域中的CTL表位;痘病毒的T细胞表位

111

4. ELISPOT技术的应用
自身免疫病研究、诊断 风湿性关节炎、红斑狼疮 研究红斑狼疮患者肾中的抗 体分泌细胞的影响 牛皮癣(银屑病):致病机理,易感病人预测,治疗 效果评估 I-型糖尿病:致病机理,临床检测,易感病人预测 结核病:多重抗药性、症状不明显的结核病早期诊断 器官移植 肾移植 肝移植 骨髓移植:次要组织相容性抗原(H)在 骨髓移植中的影响;肝移植免疫耐受 研究CCR2在移植排斥中的角色;研究移植耐受性差 异;

112

4. ELISPOT技术的应用
免疫系统研究 研究抗体分泌细胞:B细胞的成熟;活化;抗体分泌细 胞在粘膜的分布 研究粘膜免疫反应:不同的粘膜部位;局部免疫与系 统免疫;各种疫苗的粘膜保护效果 研究基础免疫学:研究基因治疗中的外源蛋白免疫耐 受;肿瘤疫苗对细胞免疫的刺激;研究DC细胞的功 能调节;抗疟疾研究;HIV患者中细胞免疫强度和病 毒载量的关系;同时评估多种细胞免疫反应;测定针 对原生肿瘤细胞的免疫反应;急性丙肝病人体内的细 胞免疫反应;老年人对流感病毒免疫反应低下的原因 分析;

113

5. ELISPOT技术的优势 ELISPOT 和 ELISA的区别
ELISPOT法源自ELISA,又突破传统ELISA法 是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展 两者都可检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白 它们最大的不同如下
ELISA测定的是蛋白浓度,ELISPOT测定的是细胞频率 (整体水平与单细胞水平) ELISA是免疫检测Immuno-Assay,而ELISPOT是生物检测 Bio-Assay(活细胞,功能检测) ELISA检测的特异性表现在抗体上,ELISPOT检测的特异性 表现在双重的刺激源和抗体上

114

5. ELISPOT技术的优势

目前,检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下 几种:ELISA、ELISPOT、FACS、Tetramer、3H胸苷参 入法、51Cr释放法
少至100-1,000个分子/Cell即能够被检测 比 ELISA 的灵敏度高200倍 单细胞水平 即使只有一个阳性细胞也能够检测出来,比 FACS 灵敏 高通量 每个研究人员每天可作数百样本的检测 高灵敏度

115

二、ELISPOT技术要点
技术操作流程 ELISPOT操作要点 塑料板与膜板 膜结构与抗体包被 细胞处理 有血清与无血清 刺激物选择 建立阳性对照 调整适当的细胞浓度 预培养法与直接法 各种染色系统

116

1. ELISPOT一般操作流程
1. 包被抗体 4℃ 过夜,洗涤 2. 37℃封闭1h 3. 加入淋巴细胞和刺激原 37℃孵育8~40h 4. 冰水裂解并移出细胞,洗涤 5. 加入生物素标记的检测抗体 37℃ 1h,洗涤 6. 加入酶联亲和素37℃ 1h,洗涤 7. 加入显色底物,显色10~40min 8. 获得斑点,计数
8 4 5 1,2 3

6

7

117

2. ELISPOT操作要点
细胞培养和培养前阶段无菌操作,避免污染 细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动,包括开关CO2 孵箱 洗涤要充分,尤其是裂解细胞之后的洗涤 洗涤时,枪头不能接触到膜,从孔中移出液体采用倾 倒的方式 洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干

118

3. 塑料板与膜板

塑料板:U-cytech公司特有的透明板 特点 操作简单,方便,省时,价廉, 但是斑点不如膜板漂亮 适于初学者以及临床诊断

膜板:PVDF膜板、NC膜板 特点 操作复杂,但是斑点漂亮 适合有经验的实验者以及科学研究

119

塑料板:U-cytech公司特有的透明板
优点: 透明全塑料板,易于操作,可以随时观察细胞 可以快速包被,节省实验时间 可回收细胞和上清 价格只有PVDF膜板的一半 缺点: 吸附能力比膜差,斑点松散,易受粒细胞的分解 裸视下斑点为灰白色,不如有颜色斑点明显 只有一种染色系统,不能用于多色分析
修饰的HRP/银 染系统

120

膜板:PVDF膜,NC膜
优点: PVDF膜的吸附能力更强,斑点致密、圆润 斑点颜色鲜艳,易于判读 能用于多色ELISPOT实验 缺点: 需酒精预湿等步骤,操作稍复杂 因为膜的渗漏问题,在洗涤步骤稍复杂 几乎不可能回收细胞和上清 膜的脆弱性,实验中的操作与保存更困难

HRP/DAB

AP/BCIP&NBT

HRP/AEC

121

PVDF板、透明板的典型斑点图像
IFN-γ IFN-γ IL-5 IL-10

PMA/ionomycin 2.5x104 hu-PBMC indirect

ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect

tetanus 105 hu-PBMC indirect

ConA 2.5x104 hu-PBMC indirect

IFN-γ

IL-5

IL-12

ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect

PMA/ ionomycin 2x105 hu-PBMC indirect

LPS/ IFN-γ 2.5x104 hu-PBMC direct

122

4. 膜结构和抗体包被
通常的包被条件是4℃过夜,也可以室温2小时 37 ℃包被不能超过1小时,否则包被效率急剧降低 膜吸附能力远远超过包被抗体的量,所以需要封闭 包被后必须立即封闭,否则包被抗体会逐渐失活 封闭之后用纯水或PBS洗涤,可以在4℃长期存储 关于膜的一些参数 厚度:120-150um 最大蛋白吸附量: 80-100 ug ELISPOT所需量:1 ug 包被抗体集中于膜表面1um (透明板容纳量为:30-40 ug)

123

5. 细胞处理 ——技术难点!
从外周血提取淋巴细胞时, 应避免凝血引起的细胞活性降低 血液越新鲜越好,全血不应该存放超过6小时 只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红 细胞、粒细胞和杂质的干扰 从小鼠的脾脏取淋巴细胞时,尤其要注意,加入ELISPOT培养 孔的细胞须为单细胞悬液 预培养的淋巴细胞若有坏死/凋亡 (培养液变黄)会影响斑点的形成 预培养后的细胞入ELISPOT培养板前 应更换培养液

124

6. 有血清与无血清
血清是细胞培养所必需的添加品 而ELISPOT有细胞培养的过程 但是血清批次间差异大、成分未知 为ELISPOT增加了严重的不确定性因素 无血清培养法已经成熟,其优点: 成分固定,彻底消除了批次间的差异 结果可以在全世界的试验室之间比较 不含杂蛋白,背景更弱,斑点更清晰 不含抑制细胞因子分泌成分,斑点更 多,更加反映真实的结果 目前只能用于直接法,间接法孵育时间 过长,细胞生长受影响,结果不理想
119 SFC

5%小牛血清

267 SFC
PHA/10,000 Hu-PBMC

无血清培养基

125

7. 刺激物选择
非特异性刺激物 有丝分裂原 ConA,PMA,PHA,Ionomycin 特异性刺激物 重组蛋白 病毒载体或者病毒颗粒 重叠肽段 表位肽

Tips
直接在ELISPOT培养可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少 此时可以采用预培养法 部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡,可以换用单价抗原刺激物 核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性较弱,应该加强刺激浓度、辅助 刺激物、延长刺激时间等

126

8. 建立阳性对照
非特异性刺激阳性对照 ConA 伴刀豆蛋白A PHA Ionomycin PMA 植物血球凝集素 伊诺霉素 14烷酰佛波乙酯 0.4-1.0ug/well 0.3-1.0ug/well 50-100ng/well 5.0-10ng/well CMV, EBV, influenza virus

特异性阳性刺激原 国际标准多肽池CEF 在PBMC的IFN-γ ELISPOT 分析中

自发斑点频率:10~50/百万PBMC细胞;(十万分之一) PHA刺激频率:104~105/百万PBMC细胞;(百分之一) CEF刺激频率:500 ~5000 /百万PBMC细胞(千分之一)

127

阳性对照实例
未刺激
40 SFC/百万PBMC

PHA 刺 激
26,000 SFC/百万PBMC

CEF 刺 激
3,400 SFC/百万PBMC

4

265

177

人PBMC40万/孔 无血清培养基

人PBMC1万/孔 无血清培养基

人PBMC5万/孔 无血清培养基

128

9. 调整适当的细胞浓度
20-40万/孔形成最大密度的单层细胞 根据所使用刺激原作初步调整 ConA PHA PMA :0.5-5万/孔 特异性刺激物:5-40万/孔 根据预实验的斑点数目作精细调整

844

492

355

192

40万

20万

10万

5万

人PBMC/CEF刺激, 无血清培养基

129

10. 预培养法与直接法
预培养法:即预先将细胞和刺激物加入24孔板中作预孵育和刺
激,然后再加入ELISPOT板进行实验。 大多数ELISPOT实验都可以用直接ELISPOT法得到可接受的结果

预孵育的优点
? 经过预孵育,斑点更分散,清晰 ? 可以除去贴壁的巨噬细胞,从而减少小斑点的影响;粒细胞的影 响(虫啃)也可以大大减轻 ? 某些细胞因子通常很难用直接法得到结果,比如颗粒酶、IL-10

预孵育的缺点
? 需要长时间孵育刺激,更为严格的无菌操作环境 ? 需耗费额外的物资和时间

130

IFN-γ直接法与 预培养法比较
直接法PVDF
刺激物:ICE Peptide Pool 40 Hours, 2 X 105 Cell/ Well

预孵育法PVDF
刺激物:ICE Peptide Pool 24+16 Hours, 2 X 105 Cell/ Well

IL-10直接法与 预培养法比较
直接法PVDF
刺激物:破伤风杆菌 40Hours, 2X105Cell/Well

预孵育法PVDF
刺激物:破伤风杆菌 24+16 Hours, 2X105Cell/Well

131

11. 各种染色系统
透明板 只有一种修饰的HRP/银染系统,白色不透明斑点 PVDF板 两种标记酶
辣根过氧化物酶HRP----显色快,但是背景高 (30min) AEC底物,颜色鲜艳,但易退色 DAB底物,棕色斑点,着色稍牢固,但是板点松散 碱性磷酸酶AP----显色慢,但是背景干净 (2h) BCIP&NBT 混合底物,蓝黑色,着色牢固

修饰的HRP/银染系统

HRP/AEC

HRP/DAB

AP/BCIP&NBT

132

三、常见问题
无斑点 斑点过少(影响斑点数量的因素) 斑点过密 斑点聚集在孔边缘问题 斑点变花或者“拖尾” 透明板“空斑”问题 斑点明显偏大,并且弥散 PVDF膜酒精预湿处理中的问题 细胞凋亡对ELISPOT的影响

133

1. 影响ELISPOT斑点形成的因素
抗体的质量 固相支持物 (polystyrene, nitrocellulose, PVDF) 细胞的组织来源 细胞组成 (T cells, monocytes/macrophages, granulocytes, erythrocytes etc.) 细胞因子产生的动力学 显色系统 洗涤条件/稀释缓冲系统 是否预孵育

134

2. 斑点过密,细胞数量过多
? Human PBMC, stimulate by CEF peptide pool

844

192

40万/孔
人PBMC/CEF刺激 ,无血清培养基

5万/孔

135

3. 斑点聚集在孔边缘问题
细胞集中于孔边缘
与细胞在孔边缘的“层流阻滞”作用相关 常见于PVDF膜板,膜的自然曲率影响

改善方法
接种细胞之后,不要摇动、振荡 细胞体积不要超过100uL 培养箱质量,铝箔包裹均匀受热 方型孔板可杜绝细胞(斑点)的边缘效应

洗板时的流水冲击力过大
见于使用自动洗板机的情景

136

4. 斑点变花或者“拖尾”
这是震 动所导 致的斑 点拖尾

细胞在培养过程中震动导致斑点拖尾
?与细胞在孔边缘的“层流阻滞”作用相关 ?常见于PVDF膜板,膜的自然曲率影响

大部分斑点清晰,但部分出现“拖 尾” 这并非震动的原因
?主要原因是DC所导致的细胞趋化作用 ?常见于多价刺激,没有固定的DC比例 有很大的个体差异

这是细 胞趋化 所导致 的斑点 变花

137

5. 透明板“空斑”问题
主要原因是粒细胞分泌或分 解所至的酶解现象 PVDF膜板因底部是白色的 膜,同时斑点更致密而几乎 看不出来 改善方法 ? 采用单价刺激物,因多 价刺激物时更容易出现 ? 与PBMC分离的质量密切 相关 ? 采用预孵育法可大大减 轻这一现象

138

6.斑点明显偏大,并且弥散
这与包被抗体的质量、浓度有着密切的关系 随着包被抗体浓度的增加,斑点变得清晰致密 由于透明板的吸附能力差,这个问题更突出一些
0.2ug/well 0.5ug/well 1.0ug/well

139

6. 斑点明显偏大,并且弥散

斑点偏大,弥散 (透明板,PBMC,乙肝核心抗原蛋白)

140

7. PVDF膜酒精预湿处理问题
不作酒精预湿

PVDF膜由于其疏水性,需要酒精 预湿润 有些公司的产品声称不需要预湿, 但是斑点减少30-40% 由于膜的通透性,加入过量酒精会 导致其残留在膜的背面 正确方法 ? 减少酒精用量至 15ul 70% 乙醇 ? 快速预湿 30秒,迅速用水或PBS 洗涤至少三遍
过量酒精残留

141

8. 细胞凋亡对ELISPOT的影响

细胞凋亡是高背景、无斑点的重要原因 如果有30%细胞凋亡,完全不会出斑点;即使5%凋 亡,也有严重影响 对策
?台盼蓝活细胞计数 ?复苏冻存的细胞,可以先培养过夜,再做ELISPOT实验

142

免疫组织化学技术

ELISPOT


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在病理学 研究中,免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例,在免疫组化技术出现以前,对 肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平,而引入免疫组化技术后,则使...
免疫组化各步原理
免疫组化各步原理_生物学_自然科学_专业资料。一、免疫组化技术 免疫组织化学(Immunohistochemistry; IHC) 技术是用标 记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或...
免疫组化入门
免疫组化技术的原理、分类和优点 一、免疫组化技术的基本原理 应用免疫学及组织化学原理, 对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、 定位或定量研究,...
免疫组化教程
免疫组化教程_生物学_自然科学_专业资料。详细的免疫组化教程及注意事项第...性抗原抗体 反应, 观察和研究组织细胞特定抗原 (或抗体) 的定位和定量的技术。...
免疫组化和免疫荧光的区别
免疫组化和免疫荧光的区别_生物学_自然科学_专业资料。两者都是蛋白定位的检测(...免疫 组织化学技术现已有:免疫荧光组织(细胞)化学技术、免疫酶组织(细胞)化学...
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