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gateway重组技术


也可以被视为一种克隆操作平台: Gateway 也可以被视为一种克隆操作平台:把目的基因克隆到入门载体 Vector) 就不用依赖限制性内切酶, (Entry Vector)后,就不用依赖限制性内切酶,而靠载体上存在的特定重组 位点和重组酶,高效、 位点和重组酶,高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体 Vector,目的载体) (Destination Vector,目的载体

)上。 定点整合到细菌宿主基因组上。 Gateway 的原理也是建立在噬菌体 DNA 定点整合到细菌宿主基因组上。在 噬菌体和细菌的整合因子(INF、Int)的作用下, 噬菌体和细菌的整合因子(INF、Int)的作用下,lambda 的 attP 位点和大肠 位点可以发生定点重组, 杆菌基因组的 attB 位点可以发生定点重组,lambda 噬菌体 DNA 整合到大肠杆 两侧产生两个新位点: attR。 菌的基因组 DNA 中,两侧产生两个新位点:attL 和 attR。这是一个可逆的过 IHF、 程,如果在一个噬菌体编码蛋白 Xis 和 IHF、Int 的共同介导下这两个新位点 位点,噬菌体从细菌基因组上裂解下来。 可以再次重组回复为 attB 和 attP 位点,噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这 一过程的方向是受控于两个重要因素:存在的介导蛋白和重组位点。 一过程的方向是受控于两个重要因素:存在的介导蛋白和重组位点。 系统中, attL2, 在 Gateway 系统中,入门载体包含两个重组位点序列 attL1 和 attL2,大小 100bp,中间夹着一个自杀基因—— ——ccdB 基因。 均为 100bp,中间夹着一个自杀基因——ccdB 基因。由于 ccdB 基因的表达产 生长, 物能抑制普通的 E.coli 生长,在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化 时不能生长。在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因, 时不能生长。在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因,接入目的基 基因两端可以选择的酶切位点有限( ),同时还必须考虑读码框 因。ccdB 基因两端可以选择的酶切位点有限(2 个),同时还必须考虑读码框 启动子、终止密码等问题, 架、启动子、终止密码等问题,因此 Gateway 系统提供了 5 种不同的入门载体 以供选择。 附加体的, 以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含 F 附加体的,因为它表 基因,影响筛选结果。 达的一种产物能阻断 ccdB 基因,影响筛选结果。 同样,目的载体( Vector) 系统配套, 同样,目的载体(Destination Vector)也必须和 Gateway 系统配套,即 目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点 attR2, 目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点 attR1 和 attR2,大小均为 125bp, 自杀基因。 125bp,同样也夹着一个 ccdB 自杀基因。 当需要将目的基因从入门载体( Vector) 当需要将目的基因从入门载体(Entry Vector)转移到目的载体 Vector) 只要将两种质粒混合( (Destination Vector)时,只要将两种质粒混合(线性化能有效提高重组 ),加入含有 Int、IHF、 重组酶混合物, 率),加入含有 Int、IHF、Xis 等重组因子的 LR 重组酶混合物,attR2 序列和 序列发生重组,生成一个融合质粒。 序列重组, attL2 序列发生重组,生成一个融合质粒。attL1 序列再和 attR1 序列重组, 融合质粒分解为两个新的质粒, 融合质粒分解为两个新的质粒,目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发 生重组置换,得到一个带目的基因的目的载体 一个带目的基因的目的载体( attB1、B2) 生重组置换,得到一个带目的基因的目的载体(生成新的重组位点 attB1、B2) 和带自杀基因的入门载体( attP1、P2)。 )。反应过程需要 和带自杀基因的入门载体(生成新的重组位点 attP1、P2)。反应过程需要 25 小时(时间越长,重组率越高,特别是较大的质粒, 度保温 1 小时(时间越长,重组率越高,特别是较大的质粒,反应过夜能提高 倍重组效率), ),蛋白酶 分钟,转化。 5 倍重组效率),蛋白酶 K37 度处理 10 分钟,转化。由于带自杀基因的载体不 能生长,加上抗生素筛选, 90%以上 同样, 以上。 能生长,加上抗生素筛选,转化产物重组率高达 90%以上。同样,转化用的菌 附加体的。 株必须是不含 F 附加体的。

序列重组, 由于在这个反应中 attL1 序列只和 attR1 序列重组,attL2 序列只能与 序列重组, 反应。 attR2 序列重组,这个方向的反应称为 LR 反应。LR 反应生成新的位点称为 attP1/2(200bp) attB1/2(25bp)序列。 在一定的条件下, attP1/2(200bp)和 attB1/2(25bp)序列。 在一定的条件下,attP 和 attB 序列也能发生重组, 序列, 反应。 序列也能发生重组,生成 attL 和 attR 序列,这个反向反应称为 BP 反应。 表达载体, 当用户得到一个含目的基因的 Gateway 表达载体,希望将目的基因转移 表达载体中时, 到另外几个 Gateway 表达载体中时,只要先将目的基因从 Gateway 表达载体中 转移到入门载体上,在由入门载体转移到其它的表达载体就行。 转移到入门载体上,在由入门载体转移到其它的表达载体就行。将含目的基因 表达载体(attB1—目的基因— 序列) attP1-ccdB(自 的 Gateway 表达载体(attB1—目的基因—attB2 序列)与带有 attP1-ccdB(自 杀基因) 序列的供体载体(pDONR, 杀基因)-attP2 序列的供体载体(pDONR,注意这个载体不同于入门载体 Entry Vector)混合, Int、 重组酶混合物, 小时, Vector)混合,加入含有 Int、IHF 的 BP 重组酶混合物,25 度保温 1 小时,37 分钟,根据与上面相同的原理, 度蛋白酶 K 处理 10 分钟,根据与上面相同的原理,attP 和 attB 序列也能发生 重组,生成带有目的基因的入门载体( Vector) 重组,生成带有目的基因的入门载体(Entry Vector)和带自杀基因的表达载 同样,由于抗性不同以及自杀基因的作用, 体。同样,由于抗性不同以及自杀基因的作用,只有含目的基因的入门载体能 被筛选出来。 反应。 被筛选出来。这即是 BP 反应。需要特别注意的是表达载体如果也是卡那霉素 抗性,就必须选择另外一个供体质粒以便筛选。 抗性,就必须选择另外一个供体质粒以便筛选。 系统的第一步即为入门载体的构建,有以下几种方法: 使用 Gateway 系统的第一步即为入门载体的构建,有以下几种方法: A PCR 重组克隆 引物, GGGG序列(25bp) 以下列方式合成 PCR 引物,即 GGGG-attB1 或者 attB2 序列(25bp)-基 因特异性序列( 个碱基或以上), ),这样在 因特异性序列(18 到 25 个碱基或以上),这样在 PCR 扩增目的基因时就可以 基因的片断。 直接得到两端带有 attB1/2 基因的片断。将 PCR 产物直接与上述的供体载体 attP1-ccdB(自杀基因 自杀基因) 序列)混合, 重组混合酶, (带有 attP1-ccdB(自杀基因)-attP2 序列)混合,加入 BP 重组混合酶,25 度 小时, 分钟, 保温 1 小时,再 37 度蛋白酶 K 处理 10 分钟,即可转化并得到带有目的基因的 入门载体。当然, 个产物最后是需要测序鉴定的,并且, 入门载体。当然,这个产物最后是需要测序鉴定的,并且,克隆到入门载体的 基因不能表达,所以不能用抗体筛选检测。还有一点值得注意的是, 基因不能表达,所以不能用抗体筛选检测。还有一点值得注意的是,由于 的末端( 个碱基) attB1 的末端(第 25 个碱基)是 T,所以跟在后面的基因特异性序列的头两位 AA、 以免提前出现终止密码。得到的入门克隆中, 碱基不能是 AA、AG 和 GA 以免提前出现终止密码。得到的入门克隆中,目的基 重组位点, Gateway?目的载体进行重组 目的载体进行重组。 因两侧具有 attL 重组位点,可以与任何 Gateway?目的载体进行重组。 B 限制性内切酶消化 克隆的替代方法, Gateway?入门载体可以使用传统的限 作为 PCR 克隆的替代方法,有 5 种 Gateway?入门载体可以使用传统的限 制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体 制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体,可以用于 端融合标签的重组蛋白。 表达天然蛋白或带有 N 端或 C 端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效 地翻译蛋白, Gateway?入门载体提供了 序列。此外, 地翻译蛋白,所有的 5 个 Gateway?入门载体提供了 Kozak 序列。此外, (Shine-Dalgarno)序列 便于在大肠杆菌中有效的翻译。 序列, pENTR?11 提供了 SD (Shine-Dalgarno)序列,便于在大肠杆菌中有效的翻译。

Gateway?改造过的 C Gateway?改造过的 cDNA 文库 文库, 如果您已经有了用 Gateway 兼容载体构建的 cDNA 文库,您就可以通过 酶混合物进行一个简单的重组反应, pDONRTM 载体和 BP ClonaseTM 酶混合物进行一个简单的重组反应,很容易地把 Gateway?入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序, 单个克隆转换成 Gateway?入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序,为您节约 数小时的时间。 pCMV·SPORT( 数小时的时间。SuperScript cDNA 文库使用 pCMV·SPORT(登录 获得更多信息)构建,有几种的人组织来源可供选择, www.invitrogen.com 获得更多信息)构建,有几种的人组织来源可供选择,这 些文库有很大一部分是全长的插入片段, mRNA。 些文库有很大一部分是全长的插入片段,可以完全代表来源 mRNA。

GATEWAY 技术:
Gateway 克隆技术是 invitrogen 的专利,基于 lambda 噬菌体的位点特异性重组反应,在 目的片段两端添加重组位点,将 PCR 产物与含重组位点的目的载体混合重组反应便可直接 转化筛选重组克隆,与经典克隆多个步骤相比,该方法只需一步生化反应便能达到目的, 是高通量克隆基因的好方法,缺点是通用性不如经典克隆强,对于本身含有重组类似或保 守序列的片段或结构复杂的片段应用此法可能会受影响。

摘要: Gateway 技术提供以下可能: 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您 的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外,细菌,酵母,昆虫,或哺乳动 物――分析表达 一、一种更好的克隆方法 Gateway 技术能够克隆一个或多个基因进入到任 何蛋白表达 Gateway 技术提供以下可能: 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外,细菌,酵母,昆虫,或哺乳动物――分析表达 一、一种更好的克隆方法 Gateway 技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统(图 1)。这项强大 的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤,而同时典型的克隆效率高达 95%或更 高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时,还可以保证正确的方向和阅读框。 Gateway 也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。 图 1 Gateway 技术的灵活性

目的基因克隆进入门载体后,可以同时转移目的基因到多个目的载体。 Gateway 利用了位点特异重组,所以在构建入门载体后,不再需要使用限制性内切酶 和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆,就可以多次使用它,转移您的目的基因到 Gateway 改造过的各种表达载体(目的载体)。 此外,由于在重组时 DNA 片段的阅读框和方向保持不变,因而您不必再为新的表达 克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时,将会节省您更多的时间。 二、一项强大而可靠的技术 Gateway 技术是克隆和亚克隆 DNA 序列的一项新颖的通用系统,便于功能基因的分 析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统,DNA 片段可以通过位点特异的重组 在载体之间转移。 Gateway 技术是基于已研究的非常清楚的 λ 噬菌体位点特异重组系统(attB x attP → attL x attR)。BP 和 LR 两个反应就构成了 Gateway 技术(表 1 和图 2)。BP 反应是利用 一个 attB DNA 片段或表达克隆和一个 attP 供体载体之间的重组反应,创建一个入门克隆。

LR 反应是一个 attL 入门克隆和一个 attR 目的载体之间的重组反应。LR 反应用来在平行的 反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 表 1 反应和术语总结
反应 BP 反应 LR 反应 反应位点 attB×attP attL×attR 产物 入门克隆 表达克隆 产物结构 attL1-基因-attL2 attB1-基因-attB2

图 2 Gateway 技术总结

在 BP 反应中基因转移形成入门克隆,在 LR 反应中入门克隆可以作为反应物产生最终 的表达克隆。 完成构建 Gateway 表达克隆仅需两步(图 2): (1)创建入门克隆,通过 PCR 或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。 (2)混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及 Gateway LR Clonase 酶, 构建表达克隆。(表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。) 有几种方法可以构建 Gateway 入门克隆。无论您选择何种方法,创建的入门克隆都 是准备用来与各种目的载体进行重组。 (1)PCR 克隆(定向 TOPO 克隆至入门载体或与供载体 B×P 重组) (2)限制性内切酶消化和连接进入入门载体 (3)使用 pCMV?SPORT6 或 pEXP-AD502*构建 Gateway 兼容 cDNA 文库

(4)Gateway 改造过的克隆资源* * 这些克隆资源和 cDNA 文库两边加有 attB 位点。这些克隆可以通过与供载体及 BP Gateway 酶反应转换到入门载体。获得已有克隆资源的更多信息。 三、PCR 定向(PCR-Directional)TOPO 克隆 定向 TOPO 克隆使得克隆 PCR 产物和其它的 DNA 分子更加快速和有效。进行 5 分钟 的简单连接,产生>90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆,而 且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。 定向 TOPO 克隆提供高效的一步法克隆策略,可以定向克隆平端 PCR 产物到入门载 体。平端 PCR 产物定向克隆的效率>90%,从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR 后续步骤或者限制性内切酶。 目前有两种定向 TOPO 克隆载体。pENTR/D-TOPO 和 pENTR/SD/ D-TOPO(表 2 和 图 3)有以下特点: 位于 PCR 产物插入位点两侧的 attL 重组位点可以与 Gateway 目的载体进行有效重组 通用 M13 位点便于测序 基于 pUC 的 ori 位点提供高产量质粒 大肠杆菌中卡那霉素(kanamycin)抗性基因筛选 表 2 两种 pENTR/D-TOPO 载体的简单比较
入门载体 pENTR/D-TOPO pENTR/SD/ DTOPO 特点 无 SD (ShineDalgarno)位点 含 SD (ShineDalgarno)位点 优点 真核细胞中天然、N-或 C-端融合;大肠杆菌中 N-端融合;如果基因包含 有 SD 序列,可在大肠杆菌中进行 C-端或天然蛋白表达 包含基因 10 和一个 SD 序列,可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠 杆菌中的表达

图 3 Gateway 定向 TOPO 克隆

四、构建入门载体的各种选择 1、限制性内切酶消化 作为 PCR 克隆的替代方法,有 5 种 Gateway 入门载体可以使用传统的限制酶切和连 接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体,可以用于表达天然蛋白或带有 N 端或 C 端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白,所有的 5 个 Gateway 入门载体提供了 Kozak 序列。此外,pENTR11 提供了 SD (Shine-Dalgarno)序列,便于 在大肠杆菌中有效的翻译。 2、PCR 重组克隆 重组是从 PCR 产物创建 Gateway 入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并 attB 位点到上游和下游引物上,然后共同孵育 PCR 扩增产物和 pDONR 载体(包含 attP 位点) 以及 Gateway BP Clonase 酶混合物。接着转化进大肠杆菌中,您将会获得包含目的基因的 入门克隆,同时目的基因两侧具有 attL 重组位点。这个入门克隆可以与任何 Gateway 目的 载体进行重组(参看图 2)。 3、Gateway 改造过的 cDNA 文库

如果您已经有了用 Gateway 兼容载体构建的 cDNA 文库,您就可以通过 pDONR 载体 和 BP Clonase 酶混合物进行一个简单的重组反应,很容易地把单个克隆转换成 Gateway 入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序,为您节约数小时的时间。 SuperScript cDNA 文库使用 pCMVSPORT 构建,有几种人组织来源可供选择,这些文 库有很大一部分是全长的插入片段,可以完全代表来源 mRNA。 4、入门克隆的切入点——克隆资源 您可以从与 10000 个人类基因相关的 35000 个克隆中进行选择,这些克隆的 70%以 上是全长序列的。这些克隆来源于使用特殊的高级 cDNA 文库构建技术、oligo dT 引物以 及 SuperScript II 反转录酶所构建的文库。许多克隆来源于 I.M.A.G.E.协会,NCI CGAP 项 目,ResGen 库或 UltimateORF 库。 克隆资源因为已克隆到 Gateway 改造过的载体,所以可以快速地将基因转到各种表 达系统中。 图 4 进入 Gateway 系统的各种路线

* 目前的克隆资源带有 attB 位点,需要与 pDONR 质粒重组

五、触手可及的最高级表达系统 一旦您构建好 Gateway 入门克隆,蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。使用 Gateway 技术,您可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统蛋 白适合于每一种蛋白,优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白(图 5)。 图 5 在 Gateway 系统表达全长开放阅读框

基因、 基因平行转移进目的载体, 大肠杆菌 GUS 基因、人类 MAP4 和 Eif-4E 基因平行转移进目的载体,在 Sf9 昆虫 细胞(杆状病毒)或大肠杆菌 BL21-SI 菌株表达天然蛋白、N-端 His 或 N-端 GST 融合蛋白。 细胞 在所有的系统中均观察到 GUS 良好的表达,而 MAP4 只在昆虫细胞中表达,Eif-4E 只在大 肠杆菌中表达。在 Hartley, J.L.et al. (2000) Genome Research 10(11):1788-95 可以找 到更多的细节。 为了扩展表达的选择,Invitrogen 已将 Gateway 技术合并到部分最高级的表达系统中。 无论您选择哪个系统――体外,细菌,酵母,昆虫,或哺乳动物――都可以获得 Gateway 目的载体。此外,你可以很容易地把您自己最称手的表达载体转换成 Gateway 目的载体。


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