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植物与病原微生物的交互作用


植物与病原微生物的交互作用

蔡竹固 国立嘉义大学微生物与免疫学系

一、前言 大约是在六到七亿年前之间,多细胞生物开始在地球上出现。首先,细胞与细 胞之间靠细胞表面的黏合分子聚集在一起,但仍然可以移动,这些多细胞生物后来 就演化成了动物的世界。若是透过细胞壁而使细胞聚集在一起,这类多细胞后来就 发展成为真菌和植物,细胞有了很好的保护,不容

易被外物侵犯,安全的多,但是 这样的方式就会限制细胞的移动,同时也就失去了活动的自由!由于植物体生活方 式的"不动性",使其无可避免地遭受到各种逆境的冲击,就其生活史而言,就是一 经历各种逆境且逆来顺受的生理过程。在自然界中,植物经常处在生物逆境和非生 物逆境这两种不良的外在环境中,前者包含真菌、细菌、植物菌质、病毒、拟病毒 等微生物或线虫、昆虫的侵袭,后者像是寒害、盐害、光害等逆境。 人类约在 1 万年前进入农耕时代之后,植物被集约栽培,自然界的动植物及平 衡开始被破坏,植物病害(diseases)即渐趋于剧烈。平均而言,每一种农作物都会被 上百种或更多的病原菌(pathogens)所感染,所以各种植物都有其特殊的病害问题。 不同的植物病原菌可利用不同的分子机制去感染植物并引发病害,而相对地植物在 面临这些生物性逆境时, 会启动防御机制以保护自身免于遭受病原菌的感染, 因此, 植物防御和病原菌感染的交互作用,是一段不断共同演化的历史,植物与生物性病 原菌间经过多年的演化,彼此间建立一平衡共存(coexistence)的现象。 根据调查评估,农作物由种植到收获期间,其所遭受病、虫、草、鼠等危害所 造成之全球作物生产潜能损失约达 45%,其中有数以万计的植物病害会影响所栽培 的作物。目前,每年全世界作物因病害而造成大约 12%的损失。植物病理学的主要 研究范畴,在于认识各种危害植物的病原微生物,包括真菌、细菌、线虫、病毒及 植物菌质,了解非传染性病害的重要性,熟习植物病害诊断技术与病害防治方法, 并探讨植物与病原菌之间的交互作用。

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二、植物与病原菌相互作用相关基因 寄主植物─病原菌基因对基因假说(the gene-for-gene hypothesis),是由Flor (1946)研究亚麻锈病(Melampsora lini Lev.)的抗感性遗传所提出,亦即植物具有抗病 基因(R抗病性,r感病性):病原菌具有致病基因(A无致病性,a致病性),二者基因的 组合,决定抗病或感病反应。植物与病原菌的相互作用类型受基因型组合调控并与 生化特征相关。在寄主抗病/感病等位基因(R/r)和病原菌的无毒/毒性基因(AVR/avr) 相互作用中,寄主抗病基因和病原菌无毒基因都为显性(图一)。在自然状况下,植 物抗病表现型是普遍的,而感病表现型仅在特定情况下才会发生。一种病原菌所能 侵染的植物在植物界中总是少数,多数植物都是非寄主,对病原菌侵染表现抗性反 应。 在古典遗传学中, 植物与病原菌相互作用被看作是由基因型控制的植物抗病性, 常常是由来自于植物的抗病 R (resistance)基因与相应的来自于病原菌的无毒 avr (avirulence)基因相互作用所决定的,即「基因对基因」观念。这种病原菌与寄主之 间的基因对基因的识别机制被描述为受体-配体模式,即(a) 古典的受体-配体模式, Avr 蛋白与相匹配的 R 蛋白之间直接相互作用引起防卫反应。(b) 共受体模式,Avr 蛋白首先连接到一个共受体的高度亲和位点上,后者与 R 蛋白相互作用激发防卫反 应。(c) 看守模式,抗病蛋白保卫着相对应的致病性靶标。(d) 依赖于蛋白酶的防卫 激发反应,有几种细菌、真菌和病毒的 avr 基因编码蛋白酶,它们对寄主蛋白的裂 解作用诱导了植物的防卫反应。另外一类的非生理小种特异性的相互作用,就是由 hrp 基因簇编码的 harpin 蛋白与 harpin 蛋白的受体相互作用引起植物非特异性的 防卫反应。

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图一、寄主抗病/感病等位基因(R/r)和病原菌的无毒/毒性基因(AVR/avr)相互作用 (Deacon, 2006)。 说明:寄主抗病基因和病原菌无毒基因都为显性,且仅寄主抗病(同质或异质)基因 型/病原菌无毒(同质或异质)基因型组合时,植物表现抗病性。 1.植物 基因结构与功能 植物R基因 植物 基因结 近 10 年来,已成功地采用定位选殖(map-based cloning)法和转位子标记法 (transposon tagging),从不同的植物中选殖了多种抗病基因。这些抗病基因编码的蛋 白质产物一般具有白胺酸富集重复序列域(leucine rich repeats, 简称 LRR)、丝胺酸/ 酥胺酸激酶(serine/threonine kinase, 简称 STK)、核苷酸结合位点(nucleotide binding site, 简称 NBS)、白胺酸拉链(leucine zippers, 简称 LZs) 和铎介白素-1 受体类似结 构(Toll/interleukin-1 receptor simility, 简称 TIR)等一种或多种保守结构, 在植物抗病 中可能介导抗病讯息的识别、产生和传递过程。已选殖的 R 基因虽来自不同物种, 介导对不同病原菌的抗性。根据 R 基因产物编码的保守结构的不同,可把 R 基因分 为 5 类:(1)编码含 LRR 和 NBS 的胞质内受体相关蛋白;(2)编码 STK;(3)编码具 有大胞质外 LRR 区域的跨膜受体蛋白; (4)编码具胞外 LRR 区域和胞内 STKs 的 跨膜受体蛋白;(5)编码毒素还原酶。而 R 基因编码的受体蛋白质共有 6 型,其中 3 型为穿膜结构(transmembranous domains),如阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana (L.)
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Heyn.)的 RPW8、蕃茄的 Cf2, 4, 5, 9 及水稻的 Xa21;另外 3 型为膜关联细胞质蛋白 (membrane-associated cytoplasmic proteins),如蕃茄的 Pto、烟草的 N、亚麻的 L6 及 阿拉伯芥的 RPP5, RPM1, RPS2 等(图二)。

图二、六型植物 R 基因编码的受体蛋白质及其存在位置(Agrios, 2005)。 说明: 植物 R 基因编码的受体蛋白质共有 6 型, 其中 3 型为穿膜结构(transmembranous domains),如阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heyn.)的 RPW8、蕃茄的 Cf2, 4, 5, 9 及水稻的 Xa21;另外 3 型为膜关联细胞质蛋白(membrane-associated cytoplasmic proteins), 如蕃茄的 Pto、 烟草的 N、 亚麻的 L6 及阿拉伯芥的 RPP5, RPM1, RPS2 等。

目前已知不论何种生物,从分化上简单如细菌到复杂如人类均具有保护自身免 于消灭的生理反应,即防御反应。生物体藉由自身的免疫系统来抵抗外来病原菌的 入侵。而这些免疫系统,我们可大略分为先天性免疫力(innate immunity)和适应性免 疫(adaptive immunity)两大类,在动物界中所有的生物都具有简单至复杂不一的非专 一性防御力,非专一性(nonspecific)防御力为生物体最基本抵抗病害的能力,又称为

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先天性免疫力。而目前所知具有专一性(specific)反应的生物是含鱼类以上的所有脊 椎动物。 其中, 哺乳动物先天性免疫力最近被发现是利用类铎受体(Toll-like receptor, TLR)来分辨自体和外来的物质。TLR 是一种固定去辨认病原菌上特定物质的受体, 并不会像 T 细胞或 B 细胞的受体会藉由体细胞基因重组去改变其对辨认物的特异 性。 从演化早期开始,生物便需防御病原菌的侵袭,分辨自身与异己的机制应运而 生, 也造成寄主与病原菌间漫长的共同演化史。 免疫防御机制演化出许多不同策略, 例如原核生物运用核酸的限制内切酶、抗微生物胜肽及 RNA 干扰素作为自我防卫。 在多细胞生物中,除了演化出具有专一性的免疫细胞,能行吞噬作用吞食外来细胞 及那些因感染或恶性肿瘤而病变的自身细胞。经由遗传而来的受体所建立的防御机 制为先天性免疫力。分析先天性免疫力发育的演化途径,从植物、无脊椎动物到脊 椎动物所共同与特有之细胞受体及讯息传递途径,最近的一些研究发现显示:在植 物、昆虫和哺乳动物的先天性免疫反应(innate immune response)中,藉由白胺酸富集 重复序列域(LRR)受体来辨识与病原菌相关分子类型的能力,在演化过程中被高度 的保存下来。 一些诱导防卫反应是由植物特异抗病基因介导完成的。从目前来看,至少有 4 类不同的作用机制。 (1).抗病基因编码产物能钝化病原菌侵染时产生的毒素, 进而抑制病原菌的繁殖。 往 往会出现植物局部坏死的病征。这种机制典型的例子就是玉米对玉米圆斑病菌 (Cochliobolus carbonum) 生理小种(physiological race)1 的抗性基因 Hm1。该基因能 编码依赖于 NADPH 的 HC 毒质(HC-toxin)还原酶, 该酶能使玉米圆斑病菌生理小种 1 所产生的毒质失活,从而使玉米获得抗性。 (2).显性基因能编码病原菌致病性的靶标物。 若植物缺乏该靶标物就会产生抗性。 这 方面的例子是玉米粒线体基因 T-urfl3,该基因不仅能编码与雄不稔有关的蛋白,也 能编码与玉米叶枯病菌(Bipolaris maydis)生理小种 T 分泌毒质亲和的产物,导致玉 米与病原菌发生亲和性互作,即植株感病。而缺乏该基因的玉米品种则抗该种病原 菌。最近,在阿拉伯芥抗白粉病研究中也发现类似的机制。

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(3).抗病基因表达产物直接引发抗病反应。 到目前为止, 只在大麦中发现这种作用机 制。研究发现,大麦显性基因 Mlo 编码由 534 个氨基酸残基组成的分子量为 60 kDa 含 7 个跨膜域的膜锚定蛋白, 它可能是植物细胞死亡和其它防卫系统的负调控因子, 而含隐性基因 mlo 的植株则能抵抗大麦白粉菌(Erysiphe graminis f.sp. hordei)的侵 染。 (4).植物抗性基因表达产物能特异性识别病原菌中相应无毒基因编码的产物, 并产生 讯息分子,这些信号分子经讯息传递因子传递后,开启植物防卫基因的表达,最终 对病原菌产生抗性。这就是著名的基因对基因假说。这种防卫作用机制在植物中普 遍存在,也是目前研究最深人的一种作用机制。抗病基因编码的产物与病原菌无毒 基因表达产物直接或间接结合后会引发一系列反应,如蛋白磷酸化、Ca2+浓度变化、 活性氧变化、水杨酸变化和离子流等。植物防卫基因的表达主要包括谷胱甘肽 S 转 移酶(glutathione-S-transferase, GST)、过氧化物酶、细胞壁蛋白、蛋白酶抑制剂、水 解酶(如几丁质酶和 1,3-b 葡聚糖等)及涉及次级代谢的病程相关(pathogenesis-related, PR)蛋白和酶等。

2.病原菌致病基因及其产物 病原菌致病基因及其产物 植物病原菌含有许多致病基因(pathogenicity gene, pat, 致病时所必需),或仅对 1 种或少数寄主增加毒性的毒性基因(virulence gene)。 致病因子(pathogenicity factors) 由致病基因和病害专一性基因(disease-specific gene, dsp)编码产生,与病害的建立有 关,包括寄主植物识别、寄主植物表面附着、发芽和形成侵入构造、感染和侵害寄 主植物组织等。革兰氏阴性细菌的细胞壁脂多醣体合成基因组成则与其寄主范围有 关。细胞壁分解酶(如 cutinase)、毒质(如 victorin、HC toxin)、荷尔蒙(如 IAA、 cytokinine)、多醣类、蛋白酶(proteinases)、铁载体(siderophore)和黑色素(melanin)合 成等都属于致病因子。其它属于毒性因子者有细胞壁分解酶、毒质、荷尔蒙、多醣 类, 例如淀粉酶(amylase)、 脂酶(lipase)、 讯息分子如高丝胺酸内酯(homoserine lactone, HSL) exopolysaccharides 和鞭毛等。

3.病原菌无毒基因及其产物 病原菌无毒基因及其产物

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基因与基因相互作用中,病原菌的无毒基因是指与寄主抗病基因相互作用,其 产物是与寄主抗病基因产物互补的基因。无毒基因是决定对寄主植物特异性不亲和 的基因,也称为寄主专化性基因或反向调节寄主范围的基因。在病原菌与寄主植物 之间存在的基因对基因关系中,病原菌无毒基因产物,与寄主中相应抗病基因产物 相互作用,从而导致不亲和反应,使病原菌在植物中的定殖和扩展受到抑制,甚至 在侵染初期就破坏了亲和关系。 病原菌无毒基因主要决定对植物不同品种的无毒性, 有时也决定对不同种植物的无毒性。 无毒基因的直接或间接产物作为激发子与相应抗病基因产物识别并诱导寄主的 防卫反应,从而表现生理小种-品种相互作用的不亲和性。无毒基因失活或缺乏相应 的无毒基因,则表现生理小种-品种相互作用的亲和性反应。目前发现的所有无毒蛋 白都是由 hrp 基因簇编码的Ⅲ型信道系统所分泌的,且无毒蛋白是被转运至植物细 胞内,引起依赖于 R 基因的过敏性反应(hypersensitivity reaction, HR)。 (1).细菌的无毒基因 细菌的无毒基因 无毒基因存在与否决定着病原菌能否入侵含相应抗病基因的寄主植物,或入侵 后细菌能否大量增殖。典型的诱导抗病性反应是过敏性反应(HR),它引起一种快速 局部的细胞死亡,伴随着受侵染植物组织中的细菌生长受抑制。迄今为止已有超过 40 种细菌的无毒基因被选殖、定序,这些无毒基因主要来源于假单胞属 (Pseudomonas)和黄单胞属(Xanthomonas)。它们位于染色体或质体上,编码亲水性可 溶蛋白,并不具有典型的讯息肽。大部分无毒基因只存在于特定病原菌中的某些生 理小种中,它们的缺失,并不导致病原菌致病性的丧失。尽管很多细菌的无毒基因 已分离到, 但是除了 avrBs3 和 avrRxv/yopJ (YopJ, Yersinia protein J)家族外, 大部分 没有或只有很少的同源性。 (2).病毒的无毒基因 病毒的无毒基因 植物病毒的无毒基因编码着病毒的重要组分,例如病毒衣壳蛋白复制酶蛋白以 及运动蛋白等,研究发现一种病毒可诱发多种植物产生 HR,同种病毒无毒因子可 以诱导不同的抗病基因介导的 HR,如辣椒轻型班驳病毒(pepper mild mottle virus)的 外壳蛋白诱导辣椒抗病基因 L2 和 L3 介导的 HR。

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(3).真菌的无毒基因 真菌的无毒基因 迄今只从为数不多的几种真菌中选殖到了一些无毒基因,主要是由于缺乏简便 有效的选殖方法。目前得到的少数基因也多数是通过反向遗传方法选殖得到的,大 部分真菌 avr 基因是从能在植物组织胞内定殖(colonization)的真菌中选殖到的。 与病 原菌的定殖一样,这些 Avr 蛋白被注射到胞间区域外质体中可诱导 HR 反应。主要 包括西红柿叶霉病菌(Cladosporium fulvum)无毒基因 avr9 和 avr4、稻热病菌 (Magnaporthe grisea)无毒基因 AVR-Pita (以前被称为 Avr2-YAMO)和 AVR1 CO39 编 码品种特异性激发子, AVR-Pita 基因是与水稻相应的抗病基因 Pita 特异互作的无毒 基因。第二类无毒基因编码物种特异性抗性激发子,称为 PWL (pathogenicity on weeping lovegrass)激发子,诱导弯叶画眉草(Eragrostis curvula)对稻热病菌的抗性。 以及大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis)无毒基因 avrNip1 编码的 NIP1,诱导带 有 Rrs1 基因的大麦产生抗病反应。 (4).卵菌纲无毒基因 卵菌纲无毒基因 卵菌是完全不同于真菌的真核性病原微生物,Elicitin 蛋白是一类由疫霉属 Phytophthoa 和腐霉属 Pythium 的某些种产生的低分子量蛋白,其中有些已被证实具 有无毒激发子活性。 (5).在植物防卫反应中的蛋白酶类 Avr 蛋白 在植物防卫反应中的蛋白酶类 R 蛋白可能是引起防卫寄主蛋白的作用, 或者它们本身会受到蛋白酶裂解作用。 有争议的是,来自于病毒、细菌和真菌病原菌中的一些 avr 基因可能编码蛋白酶类 基因。推测的 AVR-Pita 蛋白酶和 Pi-ta R 蛋白可能就是后一种情况。R 蛋白含有蛋 白酶酶切位点,当酶切发生后,它就会被切成为植物防卫反应的激发子。也可能 R 蛋白组成防卫反应负调控因子,并被 AVR 蛋白酶降解时,就诱导了植物防卫反应。 但是后一种模式不太可能,大部分 R 基因是显性而不是隐性的。

4.病原菌 基因及其产物 病原菌hrp基因及其产物 病原菌 hrp 基因(hypersensitive reaction and pathogenicity gene)决定着革兰氏阴性植物病原细 菌在非寄主植物上激发过敏性反应(hypersensitive response, HR)能力和在寄主植物 上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity)。从 Pseudomonas syringae pv.

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phaseolocola 中已鉴定出控制非寄主过敏性反应和寄主致病性的基因-hrp 基因,研 究发现有些 hrp 突变体在寄主和非寄主植物上并不产生任何可视反应。在感病寄主 上观测到 P . syringae pv. syringae、Xanthomonas campestris pv. vesicatoria、Ralstonia solanacearum 及 Erwinia amylovora 的 hrp 突变体生长衰退现象和寄主上生长相比, hrp 突变体并不损害其在培养基中的生长能力,而表现营养缺陷能在基本培养基上 生长,因此 hrp 基因并不编码一般生长或代谢所需的产物。1990 年代初,人们相继 从 E. amylovora、P. s. pv. syringae、P. s. pv. tomato、R.. solanacearum 等植物病原细 菌中鉴定出 hrp 基因簇。 大多数植物病原细菌的 hrp 基因存在于染色体上,而青枯病菌的的 hrp 基因则 存在于一个大质体(plasmid)上。 大多数植物病原细菌中的 hrp 基因簇由两部分构成。 一大的 hrp 基因簇长度为 17-41 kb,另外一小的 hrp 基因簇长度只有 2.5-4 kb,与第 一类大的 hrp 基因簇不相连;不同病原菌的 hrp 调控基因有有所不同。已有多种植 物病原细菌的 Harpin 类蛋白被报导,有的病原菌可能含有多种 Harpin;Harpin 在 hrp 系统表达时可分泌到培养基中,注入烟草和几种其它植物时,有激发 HR 的激 发子活性。 Eden 生物公司的研究小组的研究表明 haprin 处理后,会引起阿拉伯芥中 Cl、 Ca、K、H、Cu、Zn 离子通道的启动、以及各种氧化酶的启动,包括 ACC 合成酶、 Cu/Zn 超氧化物歧化酶、基质抗坏血酸氧化酶、Cu/Zn 超氧化物歧化酶、Cu 分子伴 侣前体等等,这些因子在植物抗病讯息通路中起着重要的的作用。 Harpin 可以启动植物中多种讯息途径,可以分为三大类。其中一类是与植物抗 病性相关的讯息途径的启动,包括过敏性反应与细胞凋亡、离子交换通道、水杨酸 途径茉莉酸途径、苯丙氨酸解氨酶介导的途径以及其它一些抗性基因介导的途径, 比较特殊的是,存在一条不依赖于 NPR1[nonexpresser of PR genes, 一种阿拉伯芥诱 导抗病性正调节子(positive regulator)](又称为 nonindueible immunity, NIM1)的能介导 植物对细菌抗性的讯息途径。

5. harpin 蛋白的受体 HrBP1 harpin 蛋白的受体 HrBP1, 是由 Eden 公司的植物受体和讯息传递小组利用酵母

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双杂交系统从阿拉伯芥中选殖到的,同时发现这一受体在植物中广泛存在,并被定 位存在细胞壁上。

三、植物与病原菌的识别作用 识别(recognition)是指病原菌和寄主植物接触后, 寄主对病原菌的一种早期专一 性的快速反应, 决定是否病原菌继续生长及病害继续发展, 其乃是许多的生化物质、 构造、途径(pathway)之一种。寄主植物和病原菌交互作用后会有两种可能的结果: 亲合性反应(compatible reaction),病原菌进而继续侵害植物;不亲合性反应 (incompatible reaction),植物防御机制的出现,进而抵抗病原菌之侵害,都取决于不 同变数的结合(图三)。而这些变量包括了植物和病原菌的遗传特性和生理状况,以 及数种环境条件,例如光、温度和湿度。当病原菌接触植物表面后,特别是真菌及 细菌性病原会释出如糖蛋白、多醣类、脂肪酸和胜肽等物质,在各种寄主植物-病原 菌组合, 这些物质可作为寄主识别作用的病原菌激发子(pathogen elicitor)。 有时寄主 植物酵素会分解病原菌多醣类之一部分呈病原表面(pathogen surface), 或病原菌酵素 会分解寄主表面多醣类之一部分呈寡聚物(oligomer)或单体(monomer),作为寄主识 别的激发子。寄主植物上对激发子的受体(receptor)可能位在细胞膜外、细胞膜上或 细胞间。 根据其结构特性, 可把植物细胞受体分为数种: 类受体蛋白激酶(receptor-like kinase)、组胺酸激酶(histidine kinase)受体等。现今认为植物类受体蛋白激酶广泛存 在于阿拉伯芥中,可能具有接收各种外来刺激的功用,当然也包括在植物和病原菌 的互动中作用,更有证据指出部分的植物类受体蛋白激酶其实为抗病基因。 病原菌的激发子可能在病原菌侵入前或侵入时所产生,其可能是病原菌表面物 质在植物酵素(如β-glucanase和/或chitinase)作用之后释出的β-葡聚糖(β-glucan)、 几丁 质(chitin)、 壳聚糖(chitosan), 或是病原菌侵入植物后受到寄主讯息分子刺激而产生。 后者包括有细菌之harpine proteins,可诱导寄主植物产生过敏性反应(hypersensitive reaction);某些hydrolipids、peptides及碳水化合物,可诱导寄主植物产生抗菌素 (phytoalexins)。 激发子是病原菌无毒性(avirulence)的决定者(determinants), 可诱导寄 主植物产生过敏性反应或启动与防御有关基因的转录作用(transcription)。

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图三、寄主植物和病原菌交互作用后会有两种可能的结果:植物 R 基因编码受体能 够与病原 avr 基因产物结合,因而产生过敏性反应(hypersensitive reaction, HR),植 物防御机制的出现, 进而抵抗病原菌之侵害; 若植物 R 基因编码受体无法与病原 avr 基因产物结合,病原菌进而继续侵害植物(Freeman, 2005)。

四、植物对病原菌的防御机制 识别作用通常是寄主植物表面存在的讯息分子或构造及病原菌的激发因子之 间,可诱使对方出现专一性(specific)作用或形成专一性产物。植物表面存在可启动 病原菌的讯息分子有很多种,例如植物角质层的脂肪酸,可诱使病原性真菌或细菌 产生角质素分解酵素(cutinase);果胶质之半乳糖醛酸分子,可诱使病原性真菌或细 菌产生果胶质分解酵素;许多植物酚类化合物如strigol,可诱使病原繁殖体发芽; 由植物伤口释出的酚类化合物、糖类,启动某些病原菌之一系列基因,而导致感染。 植物细胞在辨识到病原菌或激发子后,会产生一连串细胞质中的变化和生物化

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学反应,前者包括细胞质流动和细胞核移动,后者则包含了细胞膜上的氢、钾、钙、 氯离子的通透,以及活性氧物质(或激活态氧; active oxygen species, AOS; active oxygen, AO)的产生,这些生物化学反应的部分已被证实和导致防御反应的讯息传递 有关。蛋白质磷酸化和去磷酸化,也是植物细胞在辨识到病原菌后会引发的一种反 应,目前也已知这样的现象会参与诱发植物防御反应所需的讯息传递路径,找寻这 类的蛋白激酶和激酶受体,是目前植物抗病研究上的重要课题。 根据目前的研究发现,植物体本身有相当复杂且有效率的防御系统,植物对病 原菌的防御,首先来自植物原先即已存在的外表结构和生物化学特性,以及在与病 原菌接触之后,才诱发产生的形态上与生物化学上反应的复杂组合。植物的外表结 构特性,包括主要包括细胞壁的角质、蜡质、木质素、特殊的气孔结构,可做为物 理性屏障,构成一道早期的防御机制,防止病原菌的侵入和在植物体中的散播。植 物也可透过分泌抑制物、细胞内存在的抑制物、缺乏病原菌必需因子等机制,包括 小分子抗病物质,如半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂(phytocystatin)以及分解细胞壁有关 的葡聚醣酶(glucanase)、几丁质酶(chitinase)等、种子固有的抗真菌蛋白和能与真菌 几丁质结合的凝集素、破坏真菌细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等,防止病原 菌的侵入。例如洋葱红、黄干鳞片品种鳞茎表面包含有水溶性酚化物,原儿茶酸 (protocatechnic acid)及儿茶酚(catechol),是一种毒菌物质(fungitoxic substances),对 于洋葱污斑病菌(onion smudge fungus, Colletotrichum circinans)孢子发芽有抑制作 用,抵抗其侵入,洋葱白色鳞片品种则不含有。 除了上述原先即已存在的基本防御能力之外,植物亦可直接或间接侦测到病原 菌的存在,继而引发后天存在的(诱导的)防御反应(induced biochemical defenses and induced structural defenses),这是因为植物细胞表面具有受体,而受体是接收环境刺 激的主要物质,对植物个体而言扮演重要的角色。病原菌感染后,诱使植物体产生 过敏性反应(HR)、活性氧、脂氧化酵素及细胞膜破裂、寄主细胞壁的强化因子、植 物受病原菌刺激产生抑制物如致病过程相关蛋白质(pathogenesis-related proteins, PR protein),在植物受到病原菌攻击、以激发子(elicitor)、伤口处理后,诱使基因转译 大量PR蛋白质,原来少量的蛋白质种类会急遽地增加而能毒害入侵的病原菌。受伤 害、生理刺激、病原菌等刺激产生具有杀菌及静菌的物质局部性分布。在被侵入植

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物细胞及病原菌激发子可及之处,会产生植物抗菌素(phytoalexins)。只有当病原菌 突破植物固有的第一道防线时才起作用。病原菌诱导的防卫系统又可分为局部和系 统的抗病反应两种。前者主要是指过敏性反应(hypersensitive reaction, HR),即当植 物受非亲和性病原菌感染后,侵染部位细胞迅速死亡,使病原菌不易获取养分,同 时又诱导周围细胞合成抑制病原菌生长的物质,从而限制了病原菌的增殖。在HR 过程中的细胞死亡,过去称为坏死(necrosis),现在被认为是编程性细胞死亡 (programmed cell death, PCD或细胞凋亡apoptosis)。而后者是建立在前者基础之上 的,又称诱导抗性(induced resistance, IR)。 诱导抗性(IR)是指植物由于外源生物或非生物因子的作用,启动植物自身防御 体系,从而产生对病原菌的系统抗性的现象。其中研究较透彻的是系统获得抗性 (systemic acquired resistance, SAR)和诱导系统抗性(induced systemic resistance, ISR)。 系统获得抗性(SAR)是指植物由死体营养生物(necrotizing pathogen, 又称为兼性寄 生物)侵染或者局部组织经化学诱导物处理,导致植株未侵染(处理)部位产生对后续 多种病原菌侵染表现出的抗性。这种抗性具有系统、持久、广谱的特点。水杨酸 (salicylic acid, SA)是诱发SAR产生的关键讯息分子之一。水杨酸(SA)在植物受到病 原菌感染后,产生防御反应,包括过敏性反应(HR)以限制病原菌扩展、促进寄主细 胞死亡和诱导植物产生系统性抗病。 诱导系统抗性(ISR)则是指由部分非致病性根围 细菌定殖于植物根部,诱发植物产生的整株系统性的抗性。而茉莉酸(jasmonic acid, JA)和乙烯则为诱发ISR产生的关键讯息分子。

五、植物抗病讯息传递途径 植物与病原菌相互作用时所遵循的“基因对基因”假说。简单地说,就是寄主植 物与病原菌相互作用时,病原菌无毒基因表达产物(作为配体, ligand)与寄主植物抗 病基因编码蛋白(作为受体, receptor)相互识别和结合产生讯息分子, 这种信号通过一 系列讯息传递因子或调控因子的传导,最终导致寄主植物细胞特异性抗病防卫反应 基因的表达,从而产生抵抗性。因此,讯息传递相关因子在抗病机制研究中占有非 常重要的位置。当病原菌接受到植物初始识别作用讯息分子后,适合病原菌的生长 和发育,病害就可诱导产生;如果此讯息分子抑制了病原菌的生长和发育,病害发

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展就被中断。反过来说,当植物接受到病原菌激发因子之后,启动了防御反应,病 原菌的生长和活性变缓或抑制,病害可能不发生;如果此激发子抑制或规避(bypass) 了植物防御反应,病害就会发展。

1.植物 G 蛋白与植物防卫反应 植物 植物 G 蛋白(GTP 结合蛋白, guanine nucleotide binding proteins, G proteins)是普 遍存在于真核生物细胞中的一个 GTP 结合蛋白家族,根据其亚基组成及分子量大 小, 可将参与细胞讯息传递的 G 蛋白分为异三聚体 G 蛋白(heterotrimeric G protein)、 小 G 蛋白(small GTPase)。 按照细胞讯息传递学说, 环境讯息主要由位于细胞表面的 受体所接受,然后通过跨膜信号转导将细胞信号转变为胞内讯息分子,通过胞内讯 息传递引起胞内生理生化反应和遗传性状的表达。 植物异三聚体 G 蛋白负责将质膜 表面受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)和质膜内侧的效应器(effectors)偶联起 来,在细胞跨膜讯息传递中发挥着重要的作用,调控许多细胞反应过程,如植物对 激素、干旱和病原菌的反应、离子通道、细胞分裂、极性生长和光反应等。同时植 物小 G 蛋白 Rop GTPase 作为一种讯息蛋白,以单体方式直接或间接的参与细胞形 态建成、细胞极性的形成、细胞凋亡、活性氧产生、细胞分化和激素反应等多种生 命活动的调节作用。 植物细胞中同样发现与动物细胞中同源的小 G 蛋白家族的存在, 包括 Rad、 Arf、 Ran、Rho,但迄今尚未找到与动物 Ras 有较高同源性的小 G 蛋白。自从 1993 年第 一次从豌豆中发现 Rho 相关的 GTPase 以来, 人们先后在 17 种植物中发现 352 种 与 Rho 相关的 GTPase,虽然它们也是由 Rho 家族保守的亚家族 Rho、Rac 和 Cdc42 GTPase 演化而来,但是植物 Rho GTPase 不同于真菌和动物的 Rho GTPase,它属于一种特殊的 ROP (Rho-related GTPase from plants, Rop GTPase)。研 究发现拟南芥中含有 11 种,玉米中含有 9 种,水稻中含有 7 种 Rop GTPase。然而 在美丽线虫(Caenorhabditis elegans)中只发现 4 种,人类只有 3 种 Rac 基因,说明 ROP GTPase 在植物中分布较为广泛, 并且种类繁多。 考虑到异三聚体 G 蛋白, Rop GTPase 和 Ras 蛋白在动植物中分布的悬殊差别,人们推测植物体的讯息传递途径 可能与动物的讯息传递途径有较大的不同,并且 Rop GTPase 有可能在其中扮演着

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独特的角色。 植物 G 蛋白包括异三聚体 G 蛋白和小 G 蛋白是植物防卫反应中重要的调控分 子。但是对于植物 G 蛋白调控植物防卫的讯息传递途径中的许多问题还有待于解 决,如 G 蛋白和植物抗性基因 R 的关系,参与抗病反应讯息传递的 G 蛋白偶联受 体(GPCRs)、G 蛋白的下游效应因子、G 蛋白的调控机制以及与其它防卫反应讯息 传递途径如水杨酸、茉莉酸和乙烯途径之间的交叉对话(cross talk)等。

2.WRKY对抗病相关基因表达的调控 对抗病相关基因表达 WRKY蛋白是近年来发现的一类植物特有的转录因子家族,因在其N-端含有由 WRKYGQK组成的高度保守的氨基酸序列而得名。在阿拉伯芥中,WRKY家族共有 74 个成员,主要与植物的抗逆性和衰老等生理过程有关。病原菌、伤害和植物激素 类物质等多种外界因素均能诱导WRKY基因的表达。 植物受到病原菌侵害时会产生过敏性反应,使病原菌限制在侵染部位而最终保 护植物整体免受侵害, 即系统获得抗性(systemic acquired resistance, SAR)。 在植物抗 病反应过程中,转录因子对抗病相关基因表达起着重要的调节作用。在已研究的 WRKY 因子中,大部分都与抗病性有关。如在阿拉伯芥中,第三组13个成员的多 数WRKY 基因受到病原菌诱导; 阿拉伯芥npr1 (nonexpressor of PR genes)是受病原菌 诱导表达的基因,其启动子区域有3 个W-box 能被WRKY蛋白专一识别,超表达 npr1基因的植株抗病性明显增强,但如果将TTGAC 突变成TTGAA,则启动子不能 启动下游报告基因的表达,含突变启动子的npr1 基因转入npr1-3植株,突变体抗病 功能和水杨酸(SA)诱导的基因表达特性得不到补偿;抗性强的烟草植株受TMV侵染 或用SA处理后,一种DNA序列专一性结合蛋白TDBA12活性(tobacco sequence-specific DNA binding activity)被明显诱导。TDBA12能与几丁质酶基因的启 动子发生专一性结合,而该启动子被证实含有W-box;另一个受TMV诱导的抗性基 因TIZZ (TMV-induced leucine zipper zinc-finger) 的表达产物也含有一个WRKY 结 构和一个C2H2 锌指结构(C2H2 zinc finger proteins);同样在烟草中,抗病讯息蛋白 激酶MAPK及其类似蛋白SIPK首先被TMV诱导, 然后这些激酶启动某种未知的底物 与W-box结合,刺激WRKY 基因表达,WRKY 蛋白又与抗病基因的启动子区域的

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W-box 结合,促进抗病基因(如PR1)表达,产生抗病性反应。

植物抗病讯息传递途径的研究一直是植物病理学关注的焦点,近年来国内外许 多实验室都在大量筛选与植物抗病有关的突变体,选殖和抗病调节有关的基因并研 究其功能。着重对 R 基因介导的抗病讯息途径、细胞凋亡(细胞程序化死亡, programmed cell death)、水杨酸讯息途径(salicyclic acid signal transducer)、茉莉酸和 乙烯讯息途径(jasmonic acid and ethylene signal transducer)和系统诱导抗性途径 (systemic acquired resistance)等。在植物抗病机制研究中,发现两个 R 基因抗病讯息 传递的下游调控因子 RAR1 和 SGT1 在防卫反应中发挥重要作用。此外,涉及许多 讯息传递相关因子,例如水稻(Oryza sativa)的 BWMK1、JAmyb、大麦(Hordeum sativum) 的 Mlo、 RAR1、 SGT1、 玉米(Zea mays)的 Lls1、 阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana) 的 NPR1 (nonexpresser of PR genes)、NIM1(nonindueible immunity)、 NDR1(nonrace-specific disease resistance)、LSD1、COI1、EIN2、EDS1、PAD4、SNI1、 DND1、TIP、EDR1、EDS5、PMR6、蕃茄(Lycopersicum esculentum)的 Pti4/5/6、Pti1、 Prf、Rcr3、烟草(Nicotiana tabacum)的 SIPK (salicylic acid-induced protein kinase)、荷 兰芹(Petroselinum sativum)的 ERMK。实验证明,一些植物抗病讯息途径中的正、负 调节因子及不同讯息传递途径之间形成复杂的调控网络。 在植物和病原菌的交互作用中,除了有专一性的病原菌衍生非致病性激发子的 出现外,还会产生其它种不具有专一性,且会发生在不同种类的植物、病原菌作用 中的一般性激发子(elicitor)。这类的一般性激发子,来自植物或病原菌的寡醣体、脂 类多醣体、糖胜肽和胜肽等,这些激发子都会被植物细胞察觉并引发数种植物防御 反应,包括防御讯息分子(alarm signal)的诱导、抗菌素(phytoalexins)的累积、致病相 关性蛋白质(pathogenesis-related protein, PR-protein)基因的诱发等(图四、五)。过敏 性反应而引起的植物抗病性, 是一种寄主植物抗性基因(R)对病原菌非毒性基因(avr) 系统,存在于绝对细胞内寄生性病原菌(如病毒、植物菌质) 、绝对和兼性病原菌如 细菌、真菌和线虫。不论何种形式的病原菌,其过敏性反应的发生含括了植物抗性 基因(R)编码之受体(receptor)对于病原菌非毒性基因(avr)产物作为特定讯息分子 (作 为一种激发子, elicitor)的识别,因而启动一连串基因级联系统(cascade),导致植物

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体内产生氧化爆起作用(burst of oxidative reactions)、细胞膜破碎(disruption)、酚类 (phenolic)及其它有毒物质释出,造成过敏性反应(hypersensitive response)、细胞凋亡 (programmed cell death)、抑制病原菌生长,因而表现抗病性。同时也会启动其它的 防御相关基因(defense-related genes),因而表现其它形式的抗病性,例如横式抗病性 (horizontal resistance)和系统获得抗病性(systemic acquired resistance)。

图四、植物细胞受病原菌感染后所诱发的反应(陈等,2006)。

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图五、不亲合性的植物-病原菌交互作用。病原菌激发子与植物细胞受体接触,经由 讯息传递启动寄主植物过敏性反应(hypersensitive response),表现抗病,导致后续的 细胞凋亡(programmed cell death)和系统获得抗病性(systemic acquired resistance)(Agrios, 2005)。

一旦寄主植物上的分子识别且和衍自病原菌的激发子反应,植物产生警告讯息

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(alarm signal)分子,和酵素蛋白或核基因结合,将启动植物细胞一连串生物化学反 应及构造改变,其产物会朝向病原菌侵入点移动,以抵挡病原菌,包括其所分泌之 酵素及毒质等。此讯息分子的传递,可经由细胞间或系统性输送。可移动的讯息分 子之化学特性并不确定,细胞内的讯息分子转换者(transducer)包括有各种激酵素 (protein kinase)、钙离子(calcium ion)、磷酸化酵素(phosphorylases)、磷脂酵素 (phospholipase)、ATPase、过氧化氢(hydrogen peroxide)、乙烯(ethylent)和其它物质。 系统性的讯息分子转换作用(systemic signal transduction)和系统诱导抗病性(systemic acquired resistance)有关,经由水杨酸(salicylic acid)、植物细胞壁释出之寡半乳糖醛 酸(oligogalacturonides)、茉莉酸、植物系统素(systemin)、脂肪酸、乙烯和其它物质 所完成。所以某些人工合成化合物如水杨酸、二氯异烟酸(dichloroisonicotinic acid) 能够启动讯息分子途径(signaling pathway),导致对植物病原性病毒、细菌及真菌等 产生系统诱导抗病性。这些防御物质除了在有病征的叶片大量生成之外,同时可造 成同一植株其它叶片甚或邻近植株体内防御物质被诱发。这就是植物的系统性防御 机制,有些类似于动物的免疫反应。

3.活性氧在植物病害发展的调控作用 活性氧在植物病害发展的 活性氧在植物病害发展 植物的抗性基因(R)和病原菌的无毒基因(avr)的产物相互识别后, 植物才能产生 非亲和反应。在非亲和反应中,植物会诱发一些特征性的防御反应;而在亲和性反 应中,一般少有产生,即使有类似的变化,反应的强度和时间都相对地要迟缓。 感染处的细胞会发生过敏性反应(HR),这部分的细胞死亡可以延缓或抑制病菌的生 长和扩散,也使得这部分细胞与周围的健康细胞有所区别。同时来源于感染处的讯 息分子诱导植物的其余部位产生局部获得抗性(local acquired resistance, LAR)或系统 获得抗性(SAR),以防止病原菌的扩散和植株第二次受到病原菌感染。勿庸置疑, 这是由于 R- avr 识别后的讯息传递启动了包括活性氧(AOS)的生成和各类防卫反应, 例如抗菌素的合成和致病过程相关蛋白质(PR)的累积;氧化爆起作用(oxidative burst) 被认为是过敏性反应(HR)的特征性反应,也是植物对病原菌应答的最早期反应之 一。

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氧是生物体赖以生存的必需分子,也是植物行光合作用的副产物,氧分子或其 它分子其外围通常具有成对电子时较为安定,但有时存在于含一个单一电子或一个 以上单电子时,这些分子就叫做自由基(free radical);含自由基的分子本身具有高能 量,可与甚多分子进行化学反应,使之破坏与分解。正常氧原子周围有八个电子围 绕, 如果同一轨道中存在两个互相排斥的电子, 就会各自绕着轨道前进, 因而形成“不 对称电子”, 这种带有不稳定电子的氧自由基, 称为活性氧(或激活态氧; active oxygen species, AOS; active oxygen, AO),其攻击性强、不安定和喜欢抢夺正常细胞的电子, 而被侵害的细胞会再去抢夺别的正常细胞的电子,于是形成一连串氧化连锁反应。 这些活性氧主要的种类有超氧自由基(superoxide anion radical, O2.-)、过氧化氢 (hydrogen peroxide, H2O2)、氢氧自由基(hydroxyl radical, *OH)和单项氧(singlet oxygen, 1O2)。 植物在一般环境下会进行一些与氧有关的生理代谢,如同光合作用、呼吸作用 等,这些代谢会产生一些氧中间代谢产物(ROIs, reactive oxygen intermediates),包括 过氧化氢(H2O2)、氢氧自由基(*OH)、超氧自由基(O2.-)、单项氧(1O2),甚至是一氧 化氮(nitric oxide, NO)、过氧化脂质(lipid peroxide, LPO)。这些物质对细胞是有毒性 的, 而一些研究显示, 这些 ROIs 可以对逆境反应(stress-response)及防御途径(defense pathways)做为活化的讯息。另一方面,植物细胞至少有两套 ROI 清除(scavenging of ROIs)机制来调节细胞内的 ROI 浓度。 过氧化岐化酶(触酶, superoxide dismutase, SOD) 即最早启动的清除机制,另外是过氧化氢酶(catalase)、谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase, GPX)、过氧化酶(peroxidase)。 而在植物与病原菌之交互作用上,主要可分为亲和性及不亲和性反应,前者常 导致植物罹病,后者则诱发植物防御反应的进行,在此过程中,由植物与病原微生 物相互接触认知起始,植物细胞经诱发产生防御讯息传递至细胞核,刺激细胞核内 基因对应生合成防御物质,终而导致抗病作用。在过敏性反应中有些快速过程之特 性似乎包含了最初活化原已存有之物质而非改变基因的表现,其中一项便是 AOS 显著地被释放, 称之为氧化爆起作用(oxidative burst), 此种对病原菌或激发子(elicitor) 的反应可在多种单子叶或双子叶植物(如水稻、 大豆、 烟草及赤松)上观察得到。 AOS 为一有毒之中间产物其源自于氧分子在还原过程中的连续性电子传递步骤,在植物

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与病原菌的交互作用中,明显可侦测到的种类有超氧自由基(superoxide anion, O2.-)、 过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)和氢氧自由基(hydroxyl radical, *OH), 目前已知多 数植物与病原菌交互作用中氧化爆起作用与过敏性反应有着关联性,因此其在植物 抗病性上可能扮演一重要角色。 藉由植物细胞膜G蛋白质的作用使得激发子受体与AOS结合,紧接着钙离子通 道打开而增加胞内钙离子含量且活化kinase蛋白质,进而经由磷酸化作用来活化膜 上NAD(P)H oxidase而合成超氧自由基(O2.-),过氧化物酶(peroxidase, POX)除了作为 H2O2的清除剂之外,在特定的情况下,也能与NADH等反应产生O2.-/H2O2,O2.-进一 步反应形成可通过细胞膜的H2O2,O2.-和H2O2皆可杀死病原菌,而H2O2另一方面亦 能氧化细胞壁蛋白质的横向连结与调控寄主基因表现。生成的H2O2则用于细胞壁的 木质化或蛋白质的交联。 在探讨植物与病原菌交互作用时,期间氧化爆起反应的主要问题为是否限制病 原菌生长时氧化爆起反应扮演一决定因子, 或过敏性反应期间产生 AOS 仅是代谢改 变的结果,虽目前证据有限,但有些研究指出 AOS 可直接降低病原菌的存活能力, AOS 的毒质及其衍生物可能造成寄主细胞在过敏性反应期间死亡, 氧化爆起反应似 乎在植物受到病原菌攻击时, 增加其细胞壁强度上扮演一新的角色, 此外 AOS 可作 为讯号中间物质以诱发合成植物抗菌素(phytoalexin)。AOS 可调控植物抗菌素累积 之机制与其它胞内防御相关之改变,潜在性调控分子 GSH(reduced glutathione)、 GSSG(oxidized glutathione)及其衍生物调控基因之表现会受 AOS 量的增加而影响, AOS 与脂质经由非酵素反应而产生之脂质过氧化, 其为合成茉莉香酸(jasmonic acid) 之先趋物质,目前已知茉莉香酸在过敏性反应期间可调控数种防御相关基因表现, 与 AOS 相关之脂质过氧化可能会增加其磷脂酶(phospholipase)和脂肪氧合酶 (lipoxygenase)产生之酵素路径。 综合上述,AOS 在植物病害发展上所扮演的角色与细胞壁蛋白链接、脂质过氧 化作用、植物抗菌素的产生,与水杨酸的累积以产生诱导抗病性等之关系密切,其 出现可能促进细胞壁蛋白质的交互键结、抗病相关基因的诱导、植物抗菌素的产生 和过敏性反应的发生;所以其在植物防御病原菌上扮演一重要角色。

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4.NO在植物病害发展的调控作用 在植物病害发展的 在植物病害发展 一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种易扩散的生物活性分子,是生物体内重要的讯 息分子。植物细胞通过NO合成酶(nitric oxide synthase, NOS)、硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)、或非生化反应途径产生NO。NO是植物生长和发育的调节分子,能 够对生物和非生物的逆境作出反应,并且在植物体的抗病防御反应中也是一种重要 的讯息物质。 NO是一种亲脂性的不稳定的小分子,它的性质很适合执行许多生物功能。NO 很容易穿透生物膜,这有利于影响与产生NO的细胞相邻近的靶标细胞。NO的性质 不稳定,在过氧化物阴离子或氧合蛋白存在条件下易被氧化成NO2-,然后进一步被 氧化成NO3-, 因而中止NO的讯息传递途径。 另外钙和钙调素(calmodulin, CaM)是NO 介导的讯息途径的组成成分。 在自然条件下植物经常受到生物逆境(虫害、病原菌等)和非生物逆境(高温、 水分、盐分等)的胁迫。植物有一套完整的防御机制,NO 在生物逆境中作为讯息 分子起重要作用。在植物的抗逆反应中,NO 主要以依赖于环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)和不依赖于 cGMP 两条途径介导讯息传递: (1)依赖 于 cGMP 的讯息途径:逆境(如 TMV 等)启动 NO 合成酶,提高 NO 的水平,通 过 NO 与可溶性的鸟苷酸环化酶的结合启动依赖于 cGMP 的蛋白激酶,使环腺苷二 磷酸核糖(cyclic adenosine diphosphoribose, cADPR)的浓度升高。cADPR 启动对钌红 (ruthenium red)敏感的 Ca2+通道,从而使胞内 Ca2+浓度增加。Ca2+刺激水杨酸(SA) 与植物抗病相关基因苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)、水杨酸诱 导的蛋白激酶(salicylic acid-induced protein kinase, SIPK)等的表达。 诱导的有丝分 SA 裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK) SIPK 在 SA 讯息系统中 起重要作用;(2)不依赖 cGMP 的讯息途径: NO 通过抑制顺乌头酸酶(cis-aconitase) 来参与植物的抗病反应,一方面是由于粒线体顺乌头酸酶被 NO 失活后,降低经粒 线体的电子传递链电子流,从而减少活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成; 另一方面由于顺乌头酸酶活性被抑制所导致细胞内柠檬酸浓度的升高,可以诱导与 抗病有关的交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)活性的上升,而后者也可以减少 ROS 的产生。 除直接抑制顺乌头酸酶活性外, NO 还可能经 H2O2 的介导而间接发生
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抑制作用。 NO与讯息物质ROS、SA之间存在协同效应。植物细胞对病原菌侵入的反应之 一是氧化爆起作用,即产生ROS。NO作为讯息分子和ROS协同作用,启动植物防卫 基因和过敏性反应,NO和ROS协同作用诱导大豆悬浮细胞系寄主细胞死亡,用NOS 抑制剂处理则阻止了阿拉伯芥和烟草植株的过敏性抗病反应。 NO不仅同ROS有协同 作用,且还能通过依赖于SA讯息途径启动或增强植物防卫反应。NO能启动PAL, PAL则诱导合成更多的SA,SA具有改变不同NO调控酶的能力,其中包括有顺乌头 酸酶、过氧化氢酶和其它几种血红蛋白。由此可见SA可通过一种选择机制介导和增 强NO的作用。由于多效应因子NO、ROS和SA之间的多种相互作用,使得对NO复 杂机制的认识尚处于早期阶段。

5.水杨酸在植物病害发展的调控作用 水杨酸在植物病害发展的 水杨酸在植物病害发展 水杨酸(salicylic acid, SA)为柳树皮和柳树叶中的一种成份。1828 年,德国化学 家 Johann Buchner 从柳树皮中分离出水杨酸醇配醣体(salicyl alcohol glucoside),此 为柳树皮中最主要的水杨酸盐类化合物。1838 年,意大利化学家 Rafaelle Piria 把这 种具有活性的成分命名为水杨酸。 植体内除了游离的 SA 外, 也含有 SA β-配醣体(SA β-glucoside, SAG)。在 SAR 建立期间,SAG 扮演一个非活化、贮存态的角色。可以 在感染的发生区域快速的水解而释放出游离态的 SA, 进而引起 PR 蛋白基因的表现。 许多证据显示 SA 于植物系统获得抗病性上扮演关键的角色。 在植物受到病原菌 SA 感染后,产生防御反应,包括 HR 反应限制病原菌扩展、促进寄主细胞死亡和诱导 植物产生系统获得抗病性(SAR)。SA 除可引发植物产生系统性抗病反应外,在植物 体内尚有许多生理生化功能,包括促进开花、醣解作用、降低钾离子吸收、气孔关 闭等。 当植物受到病原菌感染或是非生物逆境(abiotic stresses)之后,会造成活性氧物 质(ROS, reactive oxygen species)产量短暂上升以及离子流(ion fluxes), 这些会造成包 括局部的编程性细胞死亡(programmed cell death, PCD)以及系统对于逆境及病原菌 之抗性的提升。水杨酸可以减缓烟草嵌纹病毒感染及病征;它是藉活化及诱导致病 相关性基因,来合成相关性蛋白质达到抗病的效果,包括过氧化酶(peroxidase) 、

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过氧歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 、富含甘胺酸的细胞壁蛋白质(glycine-rich wall protein) 、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)及几丁质酶(chitinase)等。植物 中的氧化逆境反应迄今仍未能被清楚暸解。水杨酸(SA)在植物抗性上扮演多重的角 色,可以加强植物抗性,植体受到逆境之后,水杨酸浓度会提高,已有7种受SA诱 导的蛋白质被发表, 其中四种与抗逆境有关, 而水杨酸本身可以和过氧化氢酶结合, 抑制其作用,打断过氧化氢被分解的途径之一,进而提高氧化逆境,以促进植物的 抗病及抗非生物逆境的能力。

6.茉莉酸在植物病害发展的调控作用 茉莉酸在植物病害发展的 茉莉酸在植物病害发展 茉莉酸(jasmonic acid, JA)、 茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MJ)和其它 JA 的衍生 物, 是一种特殊之环戊酮化合物。 这一类的化合物总称为 Jasmonates (Jose Leon et al., 1999) 。JA 在 1971 年最早由座腔双胞菌(Lasiodiplodia theobromae)的培养液中分离 出来,后来发现为座腔双胞菌的代谢产物。MJ 的发现比 JA 稍早,约在 1962 年 从 大花茉莉的精油分离出来,是精油里香气的成分之ㄧ。JA 广泛的存在高等植物的体 内,当植株受到伤害时,会产生一种传递讯息从受伤的叶片传达到未受伤的叶片。 推测这种讯息为 JA。越来越多的证据显示 JA 是活化植物受到创伤(如昆虫咬食), 或病原微生物感染诱导的防御反应的讯息分子。植物受到伤害或病原菌的感染时, 内生 JAs 的含量会迅速升高, 并累积蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor)、 植物抗菌素 与致病过程相关蛋白质(pathogenesis-related protein, PR-protein)。 另外 JA 也具有其它 生理上的作用,包括促进叶片老化及脱落、促进块茎形成、影响细胞及组织的生长 与分化、抑制种子发芽、影响花芽萌芽、抑制幼苗的生长等。

7.乙烯在植物病害发展的调控作用 乙烯在植物病害发展的 乙烯在植物病害发展 乙烯是一种气态的植物荷尔蒙。除了调节植物的生长、发育与果实的成熟外, 其它如机械性创伤、虫咬、病原菌感染、臭氧、干旱与镉毒害,均可大量生成内生 性的乙烯;但水杨酸不会引起乙烯的生合成。当病原入侵后 48 小时,也就是坏死斑 出现前几小时,植物会快速地引发乙烯合成,乙烯的量与坏死斑的面积成正比例。 除了过敏反应外,乙烯还可经空气传播至邻近区域,活化植物的防御系统来抵抗细

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菌、真菌和病毒。活化的基因产物包括:L-苯丙氯酸氨分解酶、4-羟基桂皮酸乙酰 辅酶 A 连接酶(4-coumarateCoA ligase, 4-CL)、多羟基脯胺酸糖蛋白 (hydroxyproline-rich glycoprotein, HRGP)和苯基苯乙烯酮合成酶(chalcone synthase, CHS)。这些酵素是属于一般代谢途径的关键酵素(key enzyme),可以进行木质素 (lignin)与植物抗菌素(phytoalexin)的合成,两者在植物抵抗病原攻击的机制中,扮演 重要的角色。乙烯也会诱导生成其它的致病相关性蛋白质,例如 β-葡聚糖酶 (β-glucanase)及碱性的几丁质酶(chitinase)等。另外,在实验室中,以酵母菌和植物 细胞壁碎片处理植物细胞悬浮液后,结果会增加乙烯的生成量。

六、结语 植物与病原菌的交互作用,主要可分为亲和性及不亲和性反应,前者表示病原 菌能够产生激发子(elicitor),相对地在寄主植物上存在有该激发子特异性结合蛋白受体(receptor),常导致植物罹病;反之,后者则诱发植物防御反应的进行。在此过 程中,由植物与病原微生物相互接触认知起始,植物细胞经诱发产生防御讯息传递 至细胞核,刺激细胞核内基因对应生合成防御物质,终而导致抗病作用。过敏性反 应常被视为典型的主动防御反应 (active defense),过敏性反应机制的阐明将可使人 们对于植物抗病反应的启动及作用原理有较为清楚的认识。 近年来透过分子遗传学的深入研究,发现这些诱发式的植物防御反应,包括讯 息的生成,例如可调控基因表现的水杨酸、乙烯和茉莉酸的产生;防御分子的产生, 例如活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine lyase, PAL)、抗菌素(phytoalexins)和致病相关性蛋白(pathogenesis-related protein, PR-protein)。这类诱发式植物防御反应可产生保护性生理状态,以限制病原菌在宿 主体内的生长和攻击。在此过程中,由植物与病原微生物相互接触认知起始,植物 细胞经诱发产生防御讯息传递至细胞核,刺激细胞核内基因对应生合成防御物质, 终而导致抗病作用。 例如阿拉伯芥经一旦被纹白蝶(Pieris rapae)的幼虫啃食叶片,经由它散发的挥 发性「绿色清香」便会增强,此乃经由水杨酸、茉莉酸讯息途径,及其下游 JAR1 (insensitive to jasmonate)和 NPR1,产生该挥发性「绿色清香」 。随后,纹白蝶的天敌

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粉蝶盘绒茧蜂接受到「绿色清香」大量拥来,并把卵产到纹白蝶幼虫身上。并可提 高植物自身对病害的抵抗力,转基因阿拉伯芥受黑斑病菌(Alternaria brassicicola)感 染后,叶片散发的清香增强,可以帮助缩小坏死的范围。 植物受到病原菌感染后,会产生类似于动物的免疫反应,即可以诱导「系统诱 导抗病性」(systemic acquired resistance, SAR),此系属于全株性、持久而范围广泛的 抗性,以抵御病毒、细菌或真菌性病原菌的侵袭。产生 SAR 的植株,会伴随有致病 相关性蛋白质(pathogenesis related protein, PR 蛋白)的全株性表现,且此蛋白具有 β-1,3-葡聚糖酶(β--1,3-glucanase)或几丁质水解酶(chitinase)等水解酵素的活性,因而 人们推测 SAR 的全株性表现, 在植物体内存在有可移动讯号, 从而使非接种部位产 生抗性,近十年来的研究结果显示水杨酸类、茉莉酸类和乙烯,在 SAR 过程中显现 扮演关键性重要讯息分子作用,且可能涉及基因表现的层次。此外,钙离子流、及 一氧化氮也可能参与了防卫反应的活化作用。了解了植物防疫功能的生化调控后, 可用来筛选新型化合物以对抗植物病害,例如已发现苯并噻二唑(benzothiadiazole, BTH)、2,6-二氯异烟酸(2,6-dichloroisonicotinic acid, INA)可提高水稻对稻热病的抗 性,花生四烯酸(arachidonic acid, AA)诱导马铃薯对晚疫病的抗性等,所以植物防御 反应活化剂具有实用潜能。 显然植物抗病力的讯息传递途径对真菌、细菌等病原菌都能产生反应,有可能 被用来以基因工程方法处理,以增强农作物对各种病原菌的广泛抗病力。此外,如 何经由病虫害管理措施诱导植物产生防御反应(induced resistance),更是目前各先进 国家尽全力开发的农业生物技术,藉由生物或非生物因子诱导植物产生防御反应, 达到病害防治效果。

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