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重组PCR技术研究进展和应用


中国生物工程杂志 C h i n aB i o t e c h n o l o g y , 2 0 0 7 , 2 7 ( 5 ) : 1 5 3~ 1 5 6

重组 P C R技术研究进展和应用 ?
? 王 皓 康现江 ?  王 琦 ( 河北大学生命科学学院 保定 0 7 1 0 0 2 )

摘要 重组 P C R是用聚合酶

链反应体系来实现 D N A重组的技术。经过 2 0多年的发展, 该技术 已形成三个各具特色的方法分支: 重叠延伸拼接、 跳跃 P C R和 D N A重排。近几年, 以利用天然的 差异基因作为重组来源为目的, 通过简化操作步骤、 提高捕获变异的效率、 借助于表面展示技术 和荧光探针技术搭建的高通量筛选平台, 重组 P C R技术在基础研究和工程应用研究的众多领域 中的实用价值不断增加。 关键词 重组 P C R  重叠延伸拼接 跳跃 P C R  D N A重排 高通量筛选
中图分类号 Q 7 8 9   D N A重组是基因工程的核心内容。除了为人所熟 知的酶学重组外, P C R技术也被用于制备基因杂合体, C R 方法体系, 与前者相得益彰。 并形成独特的重组 P 随着分子改造和体外定向进化等工程策略的出现, 这 项技术的应用受到越来越多的关注。 这个名称本身就十分形象。它是将完整靶基 s h u f f l i n g 因打成随机碎片, 成分混杂的碎片在热循环过程中互 为引物相互延伸, 并倾向于以随机重排来恢复原基因。   根据上述三个策略可以归纳出重组 P C R的三个阶 段: ( 1 ) 制备用于重组的 D N A组件; ( 2 ) 组件分子作为 3 ) 克隆和定 巨引物互为模板延伸( 无引物的热反应) ; ( 向筛选重组产物。图 1分别描绘了三种策略产生嵌合   在 P C R反应的退火过程中, 具有 3 ′ 末端同源序列 N A ( 不完全延伸的引物或模板碎片等) 可能产 的异源 D 生链间退火并各自提供 3 ′ 羟基作为引物沿另一 D N A 链延伸。这类体外反应中的“ 模板转辙” 的结果是产生 嵌合的 D N A分 子 ( c h i m e r i cD N A ) , 因此形成了重组 P C R的概念, 并用于人为制造重组体的实验中。   重组 P C R策略大致可以分为三类: 重叠延伸拼接 s p l i c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o n ,S O E) 、跳 跃 P C R ( ( j u m p i n gP C R ,J P C R ) 和D N A重 排 ( D N As h u f f l i n g ) 。 S O E通过重叠延伸引物( 上游片段的 3 ′ 端碱基序列和 下游片段 5 ′ 端碱基序列的共线化形式) 人为地在不同 的靶基因片段上引入重叠互补区, 引导这些片段顺序 连接。J P C R策略的关键是产生中止于序列同源区的 一系列不完全延伸的片段, 这些片段以其同源的 3 ′ 尾 N A 巴退火 至 另 一 基 因 片 段 上 的 同 源 区 继 续 延 伸。 D
收稿日期: 2 0 0 6 ? 1 1 ? 1 1   修回日期: 2 0 0 7 ? 0 2 ? 2 8 3 0 3 7 1 1 1 5 ) , 河北省自然科学基金 ? 国家自然科学基金资助项目( 资助项目( 3 0 3 1 1 8 ) 电子信箱: x j k a n g @m a i l . h b u . e d u . c n ? ?通讯作者,

1  重组 P C R的概述

分子的过程。

2  重组 P C R和筛选方法的进展
2 . 1  重叠延伸拼接   S O E技术由 H o r t o nR M和 H o S N ( 1 9 8 9 ) 创建, 主要 应用于制备嵌合分子或完整 c D N A 、 框内删除和插入片 段以及定点突变。其发展方向集中于三方面: ( 1 ) 简化 拼接过程: 采用一对反向克隆载体和通用引物扩增的 一步 拼 接 法 ( o n e s t e po v e r l a pe x t e n s i o nP C R ,O O E? ? P C R )以及应用大量重叠引物组装完整基因等方法都
1 , 2 ] 为实现单管拼接反应积累了经验 [ 。( 2 ) 组件长度两

N A重组受制于靶片段上 极化: 限制性内切酶介导的 D 的酶切位点分布状况, 所以这种方法对短于 1 0 0 b p和 长几十 k b的片段的重组几乎无能为力。 S O E则成功 地弥补了这一缺憾, 短至数十碱基和长至 2 0 k b的片段
3 ] 。( 3 ) 拼接基因组成分: 早期的 S O E 均已实现连接 [

拼接组件来源于序列单一的克隆化 D N A片段, 不能满 足诸如 体 外 等 位 基 因 重 组 等 对 组 件 多 样 性 的 要 求。

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操作, S t E P( s t a g g e r e de x t e n s i o np r o c e s s )通过脉冲式延
5 ] 。但 是 这 种 策 略 会 按 伸造成 大 量 不 完 全 延 伸 产 物 [

“ 就近原则” 产生模板转辙, 即由于靠近引物的区域较 之远离引物的区域更容易被延伸, 所以在引物邻近区 发生转辙的频率较高, 并且转辙频率随距离增加而下 降。O R P C R( o f f s e t r e c o m b i n a n t P C R )采用分段化原 ? 则来解决上述问题, 通过多引物的多点起始延伸制造
图1  三种重组 P C R策略原理示意图
A 、 B 、 C分别显示完成重组的三个阶段

可以跳跃巨引物, 使转辙位置基本均匀地分布于等位
6 ] 基因座内 [ 。

F i g . 1  S c h e ma t i cd e p i c t i o no f t h r e es t r a t e g i e s o f r e c o mb i n e n t P C R
C o n s i d e r t h e c a s e i nw h i c ht w o o r m u l t i p l et e m p l a t e s s h a r eac e n t r a l o v e r l a p p i n gb o x e si nB ) ,f l a n k e db y r e g i o no f s i m i l a rs e q u e n c e( b o xl a b e l i n gw i t he m p t y ,b l a c k , r e g i o n so fd i f f e r e n ts e q u e n c e( d o t t i n g ,s o l i d u s ) .A :I f o n e t e m p l a t e i s i n t e r r u p t e d ,t h e ni t s p r i m e r c a ne x t e n do n l yu pt ot h ep o i n t o f i n t e r r u p t i o n .S y n t h e s i su pt ot h e s t o pc r e a t e s an e w3 ′ e n da t t h es i t eo f t h ei n t e r r u p t i o n .B :O nt h e n e x t r o u n do f P C Rt h e n e w3 ′ e n dc r e a t e db y t h e i n t e r r u p t i o na n n e a l s t ot h es e c o n dt e m p l a t e i s i nt h e r e g i o no f s h a r e ds e q u e n c e a n dp r i m e s :E x t e n s i o nt o t h e e n d s y n t h e s i s t o t h e e n do f t h e s e c o n dt e m p l a t e .C o f t h e s e c o n dt e m p l a t ec r e a t e s a r e c o m b i n a n t m o l e c u l e w i t hb o t h p r i m e r b i n d i n g s i t e s .A b b r e v i a t i o n :s e e t e x t
4 ] M e r g u l h a o 等[ 以基因组为模板首先使用严谨同源引物

2 . 3  D N A重排   D N As h u f f l i n g是体外分 子 进 化 ( i nv i t r om o l e c u l a r ) 的重要手段, 国内已有文章详细介绍这项技 e v o l u t i o n
7 , 8 ] 术及其优缺点 [ 。提高 D N As h u f f l i n g 捕获变异的能 9 ] 力一直 是 研 究 人 员 努 力 的 方 向。 H i r a g a等 [ 开发的

S I S D C (s e q u e n c e ?i n d e p e n d e n t s i t e ?d i r e c t e d c h i m e r a g e n e s i s )技术在组件内部引入限制性内切酶识 别标记, 用相应的限制性内切酶代替 D N a s e I 产生重排 片段。这项技术突破了重排基因同源性较高( 约7 0 %) 的限制, 在仅有 4 9 % 序列一致性的亲本链之间实现重 N A重排体系抗同 排, 利用人为的定向酶切连接赋予 D 源的性 质, 拓 宽 了 可 利 用 的 差 异 基 因 的 来 源。 D O G S ( d e g e n e r a t eo l i g o n u c l e o t i d eg e n es h u f f l i n g ) 则根据保守模 体区序列特征设计简并引物, 扩增出保守同源区后再
1 0 ] 用重排操作生成突变富集体 [ 。由于是在突变耐受的

扩增外源成分, 再用简并引物通过二次扩增引入同源 尾, 成功地实现了基因组片段拼接。 2 . 2  跳跃 P C R   J P C R技术的改进围绕控制引物中止延伸的位置 而展开。J P C R介导的重组存在依赖于序列结构的位 置偏好性, 例如在 D N A模板断裂处、 U V损伤和脱嘌呤 位点以及一些可能形成二级结构的区域、 容易被 T a q 酶降解活性识别并切割的位点附近, 延伸中的引物在 这些部位更容易发生跳跃。为了避免上述损伤模板的

保守区直接增加转辙重组几率, 所以这个方法产生的 突变频率大大增加。   表 1列出了三种策略的异同点。

表1  三种重组 P C R方法比较 T a b l e 1  C o n t r a s t a mo n gt h r e ea p p r o a c h e s o f R e c o mb i n a t i o nP C R
名称 组件来源 延伸引物 转辙位置 库容量 S O E 没有同源性限制, 几乎可以实现任意片 段重组连接 合成的嵌合引物或步移引物 人为设计, 并由嵌合引物携带 低 J P C R 同一基因组内的不同等位基因、 同一基 因断片、 以及存在同源区的片段 端引物部分延伸产物 同源区内引物延伸中止部位
) 4 8 %a 高, 异质性

D N As h u f f l i n g 不同基因组的同一基因家族成员, 整个 基因组 内 的 同 源 片 段 ( 包括非编码序 列) D N a s e I 或其他 水 解 酶 降 解 产 生 的 随 机 断片 同源区, 位置不定
) 0 . 7 %b 高, 异质性

嵌合体产率 几乎 1 0 0 %

G e n ef a m i l y s h u f f l i n g a n d l i b r a t o r y o f c ) , 1 9 9 8 . C L E R Y , 2 0 0 0 . c h i m e r a s O n e s t e po v e r l a pe x t e n s i o nP C R( O O E? ? ? c ) P C R ) ,1 9 9 7 .S u b d o m a i n -s i z e df r a g m e n t S C R A T C H Y ,2 0 0 1 . E x o ns h u f f l i n g ,2 0 0 1 . c ) a s s e m b l y ,1 9 9 7 .G e n es p l i c i n gb yo v e r l a p S t E P( S t a g g e r e de x t e n s i o nP C R ) , 1 9 9 8 . R A P ?S C H E M A 算 法, 2 0 0 2 . Wh o l e-g e n o m e , 1 9 9 9 .T h e r m o d y n a m i c a l l yb a l a n c e d P C R( r a n d o ma r b i t r a r i l y p r i m e dP C R ) , 2 0 0 3 . s 方法改进 e x t e n s i o n , 2 0 0 2 . E n h a n c e d c r o s s o v e r h u f f l i n g c ) i n s i d e - o u t P C R , 1 9 9 9 . L o n g m u l t i p l ef u s i o n , O R P C R( o f f s e t r e c o m b i n a n t P C R ) , 2 0 0 5 ? S C R A T C H Y ,2 0 0 3 .S I S D C ( s e q u e n c e? 2 0 0 4 . T w o - s t e pt o t a l g e n es y n t h e s i s m e t h o d , i n d e p e n d e n ts i t e d i r e c t e dc h i m e r a g e n e s i s ) , ? 2 0 0 4 2 0 0 3 . D O G S( d e g e n e r a t eo l i g o n u c l e o t i d eg e n e ) , 2 0 0 5 s h u f f l i n g   a )根据 K o l k m a nJ A等( 2 0 0 1 ) ; b )根据 P h a nJ 等( 2 0 0 2 ) , 用突变生成率代替嵌合分子生成率; c ) 引自参考文献[ 7 ] 和[ 8 ]

2 0 0 7 , 2 7 ( 5 )

王 皓 等:重组 P C R技术研究进展和应用

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2 . 4  突变体筛选策略   通过上述三个途径制备的的突变体必须通过体外 定向筛选才能获得与设计目的相符的克隆。常规方法 是直接观察小量突变株选择具有嵌合分子特征的突变 株, 或者通过不断加大筛选压从大量突变株中获得符 合条件的突变株, 例如增加底物浓度筛选催化效率增 加的突变株、 升高酶反应温度改进突变株的热稳定性 等等。近年来随着突变体库的库容量不断升级, 高通 量筛选成为主流趋势。噬菌体展示和核糖体展示等多 种表面展示技术将突变株的基因型和表型直接挂钩, 简化转化分离的操作。此外多通道检测仪器等硬件设 备也为高通量筛选提供了必要条件。   但是对于许多真核蛋白( 诸如细胞膜上的受体或 通道、 胞质内的激酶等) 而言, 体外反应系统和原核表 达系并不适用于其活性功能的筛选。目前, 很多实验室 采用以下策略: 转染真核细胞系表达重组体, 再将靶分 子的功能活性水平与荧光强度耦联, 通过下游荧光检 测系统( 如流式细胞仪、 多道荧光检测仪等) 实现真核 蛋白的高通量筛选。筛选条件是通过荧光探针的激发 H敏感、 电压敏感、 离子敏感和渗透 方式来设定的, 如p 压敏感的荧光物质( 包括各色荧光蛋白和荧光燃料) 可 以反映与这些因素变化相关的分子功能; 通过荧光共 振能量转移 ( F R E T )则可以检测靶分子与其他分子之
1 1 , 1 2 ] 。 间的相互作用 [

  ( 4 ) 以1 6 Sr R N A重组 P C R产物克隆中嵌合分子
1 5 ] 比例作为分子钟鉴定环境微生物的系统发生关系 [ 。

  在工程性研究的应用涵盖:   ( 1 ) 开发新型载体。如通过修饰噬菌体表面的宿 主结合蛋白改变噬菌体载体的宿主特异性; 精确删除 病毒载体上的裂解酶编码区提高病毒载体的克隆效率
1 6 , 1 7 ] 和荷载能力 [ 。

  ( 2 ) 升级分子标记, 比如通过 D N A重排来增强绿
1 8 ] 色荧光蛋白( G F P ) 的荧光稳定性 [ 。另外, 重组 P C R

也用于连接这 些 分 子 标 记。在 原 核 表 达 蛋 白 上 添 加 A P E x ( A n c h o r e dp e r i p l a s m i c e x p r e s s i o n ) 标签将表达产物
1 9 ] 导向工程菌内膜外侧 [ 。

  ( 3 ) 重组 P C R在蛋白体外定向进化中的的应用最 N A改组已经获得的重组拟南芥 K+ 引人瞩目。通过 D 转运 蛋 白 可 以 使 植 株 内 的 钾 离 子 富 集 度 提 高
2 0 ] 2 6 . 1 %[ 。除此之外, 该技术可以将不同分子的多种

i s A ( E C5 . 3 . 1 . 1 6 ) 和T r p F 功能集成一体, 产生具有 H
2 1 ] ( E C5 . 3 . 1 . 2 4 ) 双重功能的突变株 [ 。

   ( 4 ) 基于重组 P C R技 术 的 分 子 育 种 ( m o l e c u l a r
2 2 ] b r e e d i n g ) 在疫苗研发中有着 广 阔 的 应 用 前 景 [ 。以

H I V病毒疫苗研制为例,2 0 0 2年运用 D N As h u f f l i n g 技 术突破 H I V宿主专一性, 得到高复制率的嵌合猿 ? 人免
[ 2 3 ] S H I V ) 。 疫缺陷病毒(

  尽管重组 P C R技术显示出许多潜在的优势, 但在 技术突破和实际应用之间还有一定距离。目前大多数 应用该技术的实验中, 重组的基因片段都在 1 k b左右, 实现长片段重组的技术难度较大。另外, 由于重组产 物不是亲本片段通过直接连接产生, 而是通过 P C R扩 增产生的复制品, 因此 P C R反应的保真度也会在一定 程度上限制该技术的应用。笔者尝试过热启动、 p f u聚 a q 酶混合使用、 两步 P C R程序( 将退火和 合酶和普通 T 延伸合为一步) 等方法, 在提高保真度和增加长片段重 组扩增成功率方面取得不错的效果; 在后期突变体筛 选过 程 中,采 用 突 变 库 与 野 生 型 基 因 库 回 交 ( b a c k c r o s s i n g )可以有效减少由于 P C R扩增产生的随 机突变。

3  应用与展望
   重组 P C R技术具有简单、 快速、 高效等特点, 而且 可将基因重组和基因突变同时进行, 三个方法分支各 有特色。该技术在基础研究和工程性研究中被广泛应 用。   在基础研究中的应用包括:   ( 1 ) 精确解析大分子功能和相互作用的结构基础, 如标定活性位点的关键残基、 确认已知蛋白中未知功 能的结构域、 揭示配体 ? 受体识别过程中相互临近的区 域等。   ( 2 ) 探索顺式作用元件的调控机理, 揭示 m R N A的 非翻译区的功能、 确定启动子和增强子成分的功能等。   ( 3 ) 嵌合受体在研究信号途径和胞内定位中具有 独特的“ 钓鱼” 优势, 用功能已知的分子和待研究对象 嵌合来研究结合 T G F之后的 T G F R二聚化形式和内向
1 3 , 1 4 ] 整流型钾通道的脂筏定位过程 [ 。

参考文献
 [ 1 ]U r b a nA ,N e u k i r c h e nS , J a e g e rK E .A r a p i da n de f f i c i e n t d i r e c t e dm u t a g e n e s i su s i n go n e s t e po v e r l a p m e t h o df o rs i t e ? ? e x t e n s i o nP C R . N u c l e i c A c i d s R e s , 1 9 9 7 , 2 5 ( 1 1 ) : 2 2 2 7~ 2 2 2 8  [ 2 ]Y o u n g L , D o n g Q . T w o s t e pt o t a l g e n e s y n t h e s i s m e t h o d . N u c l e i c ?

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A c i d s R e s , 2 0 0 4 , 3 2 ( 7 ) : e 5 9

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V o l . 2 7N o . 52 0 0 7

a d h e s i o nm o l e c u l e r e g u l a t e s c e l l s u r f a c ed e l i v e r yo f G p r o t e i n ? ? ? a c t i v a t e di n w a r d l y r e c t i f y i n g p o t a s s i u mc h a n n e l s v i a l i p i dr a f t s . J N e u r o s c i , 2 0 0 2 , 2 2 ( 1 6 ) : 7 1 5 4~ 7 1 6 4  [ 1 5 ] Wa n gG C ,Wa n gY .F r e q u e n c yo ff o r m a t i o no fc h i m e r i c m o l e c u l e sa sac o n s e q u e n c eo fP C Rc o a m p l i f i c a t i o no f1 6 S r R N Ag e n e sf r o m m i x e db a c t e r i a lg e n o m e s .A p p lE n v i r o n , 1 9 9 7 , 6 3 ( 1 2 ) : 4 6 4 5~ 4 6 5 0 M i c r o b i o l  [ 1 6 ]L a r o c c aD , K a s s n e rP D , Wi t t eA , e ta l . G e n et r a n s f e rt o m a m m a l i a n c e l l s u s i n g g e n e t i c a l l y t a r g e t e d f i l a m e n t o u s , 1 9 9 9 , 1 3 ( 6 ) : 7 2 7~ 7 3 4 b a c t e r i o p h a g e . F A S E BJ 1 7 ]O s o r i o CG , C r a w f o r dJ A , M i c h a l s k i J , e t a l . S e c o n d g e n e r a t i o n  [ ? b a s e di nv i v o e x p r e s s i o nt e c h n o l o g y f o r l a r g e s c a l e r e c o m b i n a t i o n ? ? s c r e e n i n g f o r V i b r i oc h o l e r a eg e n e si n d u c e dd u r i n gi n f e c t i o no f t h em o u s es m a l l i n t e s t i n e . I n f e c t I m m u n , 2 0 0 5 , 7 3 ( 2 ) : 9 7 2~ 9 8 0  [ 1 8 ]C r a m e r iA , Wh i t e h o r nE A , T a t eE , e ta l . I m p r o v e dg r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i nb y m o l e c u l a r e v o l u t i o nu s i n g D N As h u f f l i n g . N a t B i o t e c h n o l , 1 9 9 6 , 1 4 ( 3 ) : 3 1 5~ 3 1 9 1 9 ]H a r v e yB R ,G e o r g i o uG ,H a y h u r s tA ,e ta l .A n c h o r e d  [ p e r i p l a s m i c e x p r e s s i o n , a v e r s a t i l e t e c h n o l o g y f o r t h e i s o l a t i o no f a f f i n i t ya n t i b o d i e sf r o m E s c h e r i c h i ac o l i? e x p r e s s e d h i g h? , 2 0 0 4 , 1 0 1 ( 2 5 ) : 9 1 9 3~ l i b r a r i e s . P r o cN a t l A c a dS c i U SA 9 1 9 8 2 0 ]郭兆奎, 杨谦, 姚泉洪, 等. 拟南芥 K+转运蛋白 A t K u p 1基因  [ 的D N A改组. 中国生物工程杂志, 2 0 0 6 , 2 6 ( 7 ) : 2 5~ 3 0 G u o ZQ , Y a n gQ , Y a oQH , e t a l . C h i n aB i o t e c h n o l , 2 0 0 6 , 2 6 ( 7 ) : 2 5~ 3 0 2 1 ]J ü r g e n s C , S t r o mA , We g e n e r D , e t a l . D i r e c t e de v o l u t i o no f a  [ ( ) 8? b a r r e le n z y m et oc a t a l y z er e l a t e dr e a c t i o n si nt w o β α d i f f e r e n t m e t a b o l i cp a t h w a y s . P r o cN a t l A c a dS c i USA , 2 0 0 0 , 9 7 ( 1 8 ) : 9 9 2 5~ 9 9 3 0 2 2 ]L o c h e r CP , P a i d h u n g a t M, Wh a l e nR G , e t a l . D N As h u f f l i n g  [ a n ds c r e e n i n gs t r a t e g i e sf o ri m p r o v i n gv a c c i n ee f f i c a c y . D N A C e l l B i o l , 2 0 0 5 , 2 4 ( 4 ) : 2 5 6~ 2 6 3 2 3 ]P e k r u nK , S h i b a t aR , I g a r a s h i T , e t a l . E v o l u t i o no f ah u m a n  [ i m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s t y p e 1v a r i a n t w i t he n h a n c e dr e p l i c a t i o n t a i l e dm a c a q u e c e l l s b yD N As h u f f l i n g . J V i r o l , 2 0 0 2 , 7 6 i np i g ? ( 6 ) : 2 9 2 4~ 2 9 3 5

3 ]S h e v c h u kNA , B r y k s i n AV , N u s i n o v i c hYA , e t a l . C o n s t r u c t i o n  [ o f l o n g D N Am o l e c u l e s u s i n gl o n gP C R b a s e df u s i o no f s e v e r a l ? f r a g m e n t s s i m u l t a n e o u s l y . N u c l e i c A c i d s R e s , 2 0 0 4 , 3 2 ( 2 ) : e 1 9 4 ]M e r g u l h a oFJ , K e l l y AG , M o n t e i r oGA , e t a l . T r o u b l e s h o o t i n g  [ i ng e n es p l i c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o n : as t e p w i s em e t h o d . M o l ? , 1 9 9 9 , 1 2 ( 3 ) : 2 8 5~ 2 8 7 B i o t e c h n o l  [ 5 ]Z h a o H , G i v e r L , S h a o Z , e t a l . M o l e c u l a r e v o l u t i o nb y s t a g g e r e d t E P) i n v i t r o r e c o m b i n a t i o n .N a t e x t e n s i o n p r o c e s s (S B i o t e c h n o l , 1 9 9 8 , 1 6 ( 3 ) : 2 5 8~ 2 6 1 6 ]R o z a kDA , B r y a nPN . O f f s e t r e c o m b i n a n t P C R : as i m p l eb u t  [ e f f e c t i v em e t h o df o rs h u f f l i n gc o m p a c th e t e r o l o g o u sd o m a i n s . , 2 0 0 5 , 3 3 ( 9 ) : e 8 2 N u c l e i cA c i d s R e s  [ 7 ]徐卉芳, 张先恩, 张用梅, 等. 体外分子定向进化研究进展. 生物化学与生物物理进展, 2 0 0 2 , 2 9 ( 4 ) : 5 1 8~ 5 2 2 X uHF , Z h a n gXN , Z h a n gYM , e t a l . P r o gB i o c h e mB i o p h y s , 2 0 0 2 , 2 9 ( 4 ) : 5 1 8~ 5 2 2  [ 8 ]张秀艳, 何国庆. 蛋白质突变体基因库构 建方法 的 研究 进 中国生物工程杂志, 2 0 0 6 , 2 6 ( 1 0 ) : 5 2~ 5 8 展. Z h a n g XY , H eGQ . C h i n aB i o t e c h n o l , 2 0 0 6 , 2 6 ( 1 0 ) : 5 2~ 5 8 9 ]H i r a g aK ,A r n o l dFH .G e n e r a lm e t h o df o rs e q u e n c e?  [ i n d e p e n d e n t s i t e d i r e c t e dc h i m e r a g e n e s i s . J M o l B i o l , 2 0 0 3 , 3 3 0 ? ( 2 ) : 2 8 7~ 2 9 6 1 0 ] B e r g q u i s tP L ,R e e v e sR A ,G i b b sM D .D e g e n e r a t e  [ o l i g o n u c l e o t i d eg e n es h u f f l i n g (D O G S )a n dr a n d o m d r i f t m u t a g e n e s i s (R N D M) :t w oc o m p l e m e n t a r yt e c h n i q u e sf o r , 2 0 0 5 , 2 2 ( 1~ 3 ) : 6 3~ 7 2 e n z y m ee v o l u t i o n . B i o m o l E n g 1 1 ]Z h a n gJ ,C a m p b e l lR E ,T i n gA Y ,e ta l .C r e a t i n gn e w  [ , 2 0 0 2 , f l u o r e s c e n t p r o b e s f o r c e l l b i o l o g y . N a t R e v M o l C e l l B i o l 3 ( 1 2 ) : 9 0 6~ 9 1 8  [ 1 2 ]S o u m i l l i o nP , F a s t r e z J . N o v e l c o n c e p t s f o r s e l e c t i o no f c a t a l y t i c , 2 0 0 1 , 1 2( 4 ) : 3 8 7~ 3 9 4 a c t i v i t y . C u r r O p i nB i o t e c h n o l  [ 1 3 ]A n d e r sR A ,L e o fE B .C h i m e r i cg r a n u l o c y t e / m a c r o p h a g e c o l o n y s t i m u l a t i n g f a c t o r / t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r b e t a( T G F ? ? ? b e t a )r e c e p t o r s d e f i n e am o d e l s y s t e mf o r i n v e s t i g a t i n gt h er o l e b e t a s i g n a l i n g . J o f h o m o m e r i c a n dh e t e r o m e r i c r e c e p t o r s i nT G F ? , 1 9 9 6 , 2 7 1 ( 3 6 ) : 2 1 7 5 8~ 2 1 7 6 6 B i o l C h e m  [ 1 4 ]D e l l i n gM , Wi s c h m e y e rE , D i t y a t e vA , e t a l . T h en e u r a lc e l l

T h eP r o g r e s s a n dA p p l i c a t i o no f R e c o mb i n a n t P C R
WA N GH a o  K A N GX i a n j i a n g  WA N GQ i ?
( C o l l e g eo f L i f eS c i e n c e , H e b e i U n i v e r s i t y , B a o d i n g  0 7 1 0 0 2 , C h i n a )

  A b s t r a c t  R e c o m b i n a n t P C Ra p p l i e s t o f u l f i l l g e n e r e c o m b i n a t i o nb y P C Rt h e r m a l r e a c t i o n . O v e r t h e t w e n t y y e a r s , i th a sb r a n c h e di n t ot h r e ec h a r a c t e r i s t i cs t r a t e g i e s : s p l i c i n gb yo v e r l a p p i n ge x t e n s i o n( S O E ) , j u m p i n g p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n( J P C R )a n dD N As h u f f l i n g . R e c e n t l y , t h et e c h n i q u ea i m e dw i t he x p l o i t i n gn a t u r a l s o u r c eo f d i f f e r e n t a l l e l eg e n e s i s d e v e l o p i n gu po ns i m p l i f i c a t i o no f e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e , o nt r a pf o r m u t a t i o n , a n do nh i g h t h r o u g h p u t s c r e e n i n gw i t ht e c h n o l o g yo f s u r f a c ed i s p l a ya n df l u o r e s c e n t p r o b e . T h e a n dv a r i a t i o n ? r e c o m b i n a n t P C Ri s i n c r e a s e s i n gv a l u ei nb r o a dr a n g ef r o mb i o l o g i c a l b a s i cr e s e a r c ht ob i o e n g i n e e r i n gs t u d y . K e yw o r d s  R e c o m b i n a n t P C R  S p l i c i n g b y o v e r l a p p i n g e x t e n s i o n  J u m p i n g P C R  D N As h u f f l i n g  H i g h t h r o u g h p u t s c r e e n i n g ?


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