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胶体金免疫层析技术在真菌毒素快速检测中的应用


第4卷 第1期 2013 年 2 月

食品安全质量检测学报 Journal of Food Safety and Quality

Vol. 4 No. 1

Feb. , 2013

胶体金免疫层析技术在真菌毒素 快速检测中的应用
李 康 1, 应美蓉 2, 盛慧萍 3*, 桑丽雅 3<

br />310022; 2. 浙江省粮油产品质量检测中心 杭州 310051) 310012; (1. 杭州市质量技术监督检测院, 杭州

3. 杭州南开日新生物技术有限公司, 杭州



要: 胶体金免疫层析技术具有快速、简便、特异、敏感等特点, 弥补了真菌毒素传统检测方法的不足, 适用于真

菌毒素快速现场筛选。本文主要介绍了胶体金免疫层析技术的原理及其在真菌毒素快速检测中的应用及发展前景。 关键词: 胶体金; 免疫层析; 快速检测; 真菌毒素

Application of colloidal gold immunochromatographic assay in rapid detection of mycotoxins
LI Kang1, YING Mei-Rong 2, SHENG Hui-Ping3*, SANG Li-Ya3
(1. Hangzhou Institute of Calibration and Testing for Quality and Technical Supervision, Hangzhou 310022, China; 2. Zhejiang Cereals Oil’s Products Quality Inspection Center, Hangzhou 310012, China; 3. Hangzhou Nankai Biotech Co., Ltd., Hangzhou 310051, China)

ABSTRACT: Colloidal gold immunochromatographic assay(GICA), which is a fast, simple, specific and sensitive
detection method and which can make up for the deficiency of trational methods of mycotoxins, is suitable for the rapid detection of mycotoxins. This paper mainly introduced the principle of the colloidal gold immunochromatographic assay, its application and prospect in detection of mycotoxin.

KEY WORDS: colloidal; immunochromatographic assay; rapid detection; mycotoxins

真 菌 毒 素 (mycotoxin)是 一 些 真 菌 (主 要 为 曲 霉 属、青霉属及镰刀属)在生长过程中产生的, 易引起 人和动物病理变化和生理变态的次级代谢产物, 毒 性很高, 可通过污染农作物和那些来源于被真菌毒 素污染了的饲料喂饲的动物性食物(如牛奶、肉和蛋) 而进人食物链, 危害人类健康。其主要的毒性作用包 括致癌作用、遗传毒性、致畸作用、肝细胞毒性、中 毒性肾损害、生殖紊乱和免疫抑制等, 有时以地方性 发病的形态出现
[1-2]

因此要防止食品受污染或食入已被污染的食品, 需 加强对真菌毒素的检测。 进行食品中真菌毒素的现场 快速检测对食品中真菌毒素风险监测及食品质量安 全监管具有重要意义[3-4]。 真菌毒素检测方法主要有: 薄层色谱分析法 (TLC)、高压液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法 (LC-MS) 、 气 相 色 谱 (GC) 、 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 (ELISA)等。 薄层层析法(TLC), 具有经济、对设备和检验人 员要求不高等优点。AOAC 官方方法中 TLC 是分析

。真菌毒素污染面广, 易与食品

中有机化合物结合, 对消费者的健康造成很大威胁。
基金项目: 浙江省科技计划项目 (2010C33187)

Fund: Supported by the Science and Technology Plan of Zhejiang (2010C33187) *通讯作者: 盛慧萍, 本科, 主要研究方向为食品安全快速检测技术。E-mail: huipingsheng@126.com *Corresponding author: SHENG HUI-Ping, Hangzhou Nankai Biotech Co., Ltd., 4 F, 6th Building, Huoshui Industry Park, 95 Binwe n Road, Binjiang District, Hangzhou 310051, China. E-mail: huipingsheng@126.com

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花生及其制品中的总黄曲霉毒素, 谷物中的玉米赤 霉烯酮和杂色曲霉素, 苹果汁中的展青霉素等的法 定方法。但由于 TLC 法的精确度低、操作过程复杂、 分析结果的可重复性和再现性差, 近年来国际上用 TLC 方法检测真菌毒素在逐渐减少 。 高压液相色谱 法(HPLC)、气相色谱法(GC)等仪器法是定量分析真 菌毒素常用的方法, 其分离检测效能高, 分析结果准 确性高, 为同时测定多种真菌毒素提供了条件。 此外, 与质谱联用还可以大大提高分析的灵敏度和可靠性。 AOAC 官方方法中 HPLC 法被用于检测食品中的黄 曲霉毒素和伏马菌素, 许多国家用该法检测谷物中 的 OTA、ZEN、DON、展青霉素等真菌毒素
[6-7] [5]

在弱碱环境下带负电荷, 可与蛋白质分子的正电荷 基团牢固结合[16-17]。胶体金标记, 实质上是蛋白质等 高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。 用还原 法可以方便地用氯金酸制备各种不同粒径、 也就是不 同颜色的胶体金颗粒。 这种球形的粒子对蛋白质有很 强的吸附功能, 可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋 白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋 白多肽缀合物等非共价结合, 因而在基础研究和临 床实验中成为非常有用的工具。 胶体金免疫层析技术是免疫金标记技术和抗原 抗体反应相结合的一种应用形式, 它是将特异性的 抗原或抗体以条带状固定在膜上, 胶体金标记试剂 (抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上, 当待检样本加 到试纸条一端的样本垫上后, 通过毛细作用向前移 动, 溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应, 移 动至固定的抗原或抗体的区域时, 待检物与金标试 剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留, 聚集 在检测带上, 可通过肉眼观察到显色结果[18]。 与其他 标记技术相比, 有以下特点: 易制备, 成本低; 可同 时检测多种物质; 对组织细胞的非特异性吸附作用 小, 具有高度特异性和高敏感性; 不仅可用于光镜, 也可用于透射电镜和扫描电镜; 检测结果直接用颜 色显示, 肉眼判断直观可靠; 操作简单, 耗时少。胶 体金免疫层析技术具有快速、简便、特异、敏感等优 点, 因此广泛应用到生物学的各个领域[19-20]。 根据抗原抗体反应的原理, 可以将胶体金免疫 层析法分为以下几个类型: 双抗体夹心法、双抗原夹 心法、捕获法以及竞争抑制法[21]。

。但

由于仪器法都需配备价格昂贵仪器设备、 操作过程复 杂、检测时需专业的技术人员在实验室中进行, 不适 于大规模现场快速检测。 免疫学检测方法与 TLC、 HPLC、 LC-MS 法比较, 具有前处理简单、样品用量少等特点, 特别适合大规 模的检测。近年来, 在真菌毒素的检测技术方面, 免 疫检测技术因其灵敏度高, 特异性强, 快速、经济简 便等特点, 格外受到研究者青睐[8]。ELISA 法是把抗 原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机结 合起来的一种检测技术 [9-10], 具有精确、灵敏, 检测 时间大大缩短等优点, 但 ELISA 法中酶的活性易受 反应条件影响, 由此易造成测定结果重复性较差。此 外 ELISA 试剂寿命短, 因此需要低温保藏。免疫胶 体金技术是一种新的免疫学方法, 在生物医学、药物 检测各领域得到了日益广泛的应用。现已应用到电 镜、光镜、凝集试验、体外诊断、斑点渗滤及免疫层 析等方面
[11-15]



胶体金免疫层析技术是当今最快速、 灵敏方便的 免疫学检测技术之一, 并开始被逐渐应用于农药残 留、激素、兽药和毒素等的检测。胶体金免疫层析技 术具有快速简便、 单样本检测、 灵敏度高、 特异性强、 无需辅助试剂和仪器、可肉眼观察、结果可长期保存 等特点, 特别适合于对真菌毒素污染监控中大量样 本的筛检工作, 易于普及推广。

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典型真菌毒素及检测方法
目前已知的真菌毒素有 400 余种, 按其主要产毒

菌种可分为曲霉属毒素、青霉属毒素、镰刀菌属毒素 及其它类。其中, 毒性强、对人类危害大、污染频率 高的毒素主要有以下几种: 黄曲霉毒素(aflatoxins, AF)、赭曲霉毒素 A(ochratoxina, OA)、玉米赤霉烯酮 (zearalenone, ZEN) 、 脱 氧 雪 腐 镰 刀 菌 烯 醇 (dexynivalenone, DON)、T-2 毒素(T-2 toxin, T-2 )等。

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胶体金免疫层析技术原理及特点
胶体金是氯金酸 (HAuCl4)在还原剂如白磷、抗

2.1

黄曲霉毒素
黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生

坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下, 聚合成一定大小 的金颗粒, 并由于静电作用成为一种稳定的胶体状 态, 形成带负电的疏水胶溶液, 故称胶体金。胶体金

的, 特曲霉也能产生, 但产量较少。 该毒素有 17 种衍 生物, 其中 2 种衍生物毒性最大且与人类生活密切相

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康, 等: 胶体金免疫层析技术在真菌毒素快速检测中的应用

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关, 一种是 AFB1, 另一种是在牛奶中产生的 AFM1。 AFB1 被公认为是目前致癌力最强的天然物质, 它常 常存在于土壤、动植物、各种坚果中, 特别是在花生 和核桃中, 在大豆、玉米、奶制品、食用油等制品中 也经常发现黄曲霉毒素。欧盟国家规定,人类生活消 费品中的 AFB1 的含量不能超过 2 μg/kg, 总量不能超 过 4 μg/kg; 牛奶和奶制品中的含量不能超过 0.05 μg/kg。中国也制定了相应的 AFB1 限量标准
[22-23]

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胶体金免疫层析技术在真菌毒素快速检 测中的应用
真菌毒素是由产毒真菌产生的代谢物, 广泛存

在于粮油食品和饲料中。据联合国粮农组织估算, 全 球每年约有 25%的农产品受到真菌毒素的污染, 我 国农产品中真菌毒素污染严重, 已成为农业可持续 发展的重要限制因素之一, 严重威胁着人类与动物 的健康。 针对粮食质量安全问题, 《粮食管理流通条例》 和粮食卫生标准都明确规定粮食收购要对真菌毒素 进行检验。 粮食中真菌毒素含量的检测方法一直是制 约真菌毒素与人类疾病研究进展的关键, 现有的真 菌毒素的典型检测方法包括: 薄层色谱法、高压液相 色谱法、酶联吸附免疫法、毛细管电泳法、液相-质 谱法等。随着科技的进步, 也衍生出了其他各种检测 方法, 如光化学衍生-高压液相色谱法、电化学衍生高压液相色谱法、荧光光度法、液相色谱-三重串联 不过, 这些方法均须在实验室条 四极杆质谱法等[29]。 件下操作, 样品前处理操作复杂, HPLC、 质谱法等还 需配备昂贵的仪器设备 [30-32], 检测成本较高、耗时 长、操作复杂, 在实际应用过程中有很大的限制性, 不适宜大规模现场快速检测, 无法及时检测粮食中 真菌毒素含量。 胶体金免疫层析技术是 20 世纪 80 年代在酶联免 疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体 金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一项新 型体外诊断技术。 采用竞争抑制免疫层析原理制备的 胶体金免疫快速检测试剂条, 整个检测过程一步加 样, 具有检测时间短、稳定性好、灵敏度高、结果准 确、易于判定、经济实用等优点, 非常适合于大批量 样品的现场快速检测。虽然, 目前这种方法还只能半 定量, 但作为一种快速筛查手段, 可以有效地筛除真 菌毒素污染的农产品, 防止毒素中毒事件的发生, 保 护人民的身体健康。 胶体金免疫层析技术在食品安全 检测领域已得到了很好的应用, 如畜禽产品中盐酸 克伦特罗、莱克多巴胺残留含量, 水产品中氯霉素、 孔雀石绿、硝基呋喃类代谢物残留含量等的检测。该 方法最大特点是简单快速、特异敏感, 不需任何仪器 设备和试剂, 几分钟就可用肉眼观察到实验结果, 并 可保存实验结果, 特别适合广大基层单位、野外作业 人员以及大批量快速检测和大面积普查等[33-36]。 随着免疫胶体金技术的不断发展, 其在真菌毒



2.2

赭曲霉毒素
赭曲霉毒素是赭色曲霉属和几种青霉属真菌产

生的一种毒素, 包括 A、 C 等 7 种结构类似物; 其 B、 中以赭曲霉毒素 A 毒性最大, 一般容易感染赭曲霉 毒素 A 的食品主要有大豆、绿豆、绿咖啡豆、啤酒、 葡萄汁、调味品、草本植物等。欧盟国家对赭曲霉毒 素在食品中的限量标准极其严格, 如: 在谷物中不得 超过 5 μg/kg, 在谷物制品中不得超过 3 μg/kg, 并且 在干鲜果品中不得超过 10 μg/kg
[24]



2.3

玉米赤霉烯酮
玉米赤霉烯酮是真菌禾谷镰刀菌产生的一种雌

激素真菌毒素。它有 15 种以上的衍生物, 其主要存 在于玉米及其制品中, 小麦、大麦、高粱和大米中也 有一定程度的分布。 玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒 性和致畸作用, 可使动物发生雌激素亢进症, 导致动 物不孕或流产, 对家畜特别是对猪和羊的影响较大, 它会给畜牧业带来经济损失[25-26]。

2.4

脱氧雪腐镰刀菌烯醇
脱氧雪腐镰刀菌烯醇又名呕吐毒素(vomintoxin),

是 F.镰刀菌霉(主要是 F. graminearumh 和 F.culmorum) 的二级代谢产物。这类真菌大多在低温、潮湿和收割 季节时在谷物庄稼中慢慢生长。呕吐毒素一般在大 麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度。大多数国 家一般要求动物饲料中的 DON 不得超过 2 mg/kg, 而人类消费品中的含量不得超过 1 mg/kg
[27]



2.5

T-2 毒素
T-2 毒素是一种单端孢霉烯族化合物, 由多种真

菌主要是镰刀菌产生, 主要污染谷物类食品。对人类 健康危害很大, 导致人类的食物中毒性白细胞缺乏 病, 主要临床症状表现为骨髓空虚、白血球减少症、 粒性白血球缺乏症、脓血症
[28]



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素检测中已有相关应用 [37] 。应用胶体金免疫层析技 术检测黄曲霉毒素、 赭曲霉毒素等真菌毒素已有文献 报道。 邓省亮等 [38] 应用胶体金免疫层析技术, 建立了 一种快速检测食品中黄曲霉毒素 B1 的方法, 用胶体 金颗粒标记抗黄曲霉毒素 B1 单克隆抗体并喷于玻璃 纤维上, 黄曲霉毒素 B1 偶联抗原和二抗鼠抗驴分别 结合于硝酸纤维膜上, 依次将样本垫、胶金垫、硝酸 纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条。 试纸条的 灵敏度为 5 ng/mL, 检测时间为 10 min, 批内和批间 重复性为 100%, 假阳性率和假阴性率均为 0。 舒文祥等 [39] 应用胶体金免疫层析技术建立一种 快速检测食品和饲料中赭曲霉毒素 A 方法。用柠檬 酸三钠还原法制备胶体金溶液, 标记抗赭曲霉毒素 A 单克隆抗体。 胶体金标记单克隆抗体喷涂于玻璃纤 维上, 赭曲霉毒素 A 偶联抗原 OA-OVA 和二抗兔抗 鼠 IgG 分别啧涂于硝酸纤维膜上作为检测限和质控 线, 依次将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水纸 组装成试纸条。试纸条灵敏度为 5 ng/mL, 检测时间 为 10 min, 批内和批间重复性为 100%, 假阳性率和 假阴性率均为 0。 吴文晔 [40] 等应用胶体金免疫层析技术研究制备 了同时检测黄曲霉毒素 B 和赭曲霉毒素 A 两种真菌 毒素的胶体金快速检测卡。以人工合成抗原 OVA-AFB1、 OVA-OA 和抗 AFB1 单克隆抗体、 OA 抗 单克隆抗体为原料, 用硝酸纤维膜和玻璃纤维纸作 为栽体, 制作出同时检测 AFB1 和 OA 的胶体金快速 检测卡。检测卡能同时检测 AFB1 和 OA 两种真菌毒 素, 且两者之间互不干扰, 灵敏度均可达到 2.5 μg/L, 重复性、稳定性均良好。一次操作能检测两种毒素, 节省了检测时间和检测成本。 为了确定胶体金免疫检测试剂的可行性及适用 性, 刘坚 [41] 等用高压液相色谱法和免疫层析试纸法 对粮食中黄曲霉毒素 B1 测定方法进行了对照研究, 对免疫层析试纸法进行了可行性验证。结果表明: 免 疫层析试纸法和高压液相色谱法的相符率可达 90.5 %以上, 免疫层析试纸法操作简单, 检测准确、 方便、 快速, 可用于现场快速检测和初筛粮食中的黄曲霉 毒素 B1。郭建[42]等采用国家标准方法对粮食中脱氧 雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮两种真菌毒素的胶 体金快速测试卡效果进行了验证, 研究胶体金检测 卡在粮食中的适用性、准确性、稳定性、重复性。结 果表明真菌毒素胶体金快速测试卡能够满足快速筛

选的技术要求, 方法简便快捷, 适合粮食收购环节现 场快速筛选工作。

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食品安全关系到广大人民群众的身体健康和生 命安全, 关系到经济健康发展和社会稳定。保障农产 品质量安全在很大程度上依赖快速、准确、灵敏的检 测技术。胶体金快速检测方法由于其快速、便捷, 不 需特殊设备, 结果判断直观等优点, 近年来越来越受 到人们的重视, 在临床诊断、检验检疫等领域中得到 了广泛应用。 胶体金免疫层析技术是基于抗原抗体特 异性反应的原理, 因此在检测实际样品时, 由于待检 样品种类繁多, 成分复杂, 容易影响抗原抗体反应以 及胶体金颗粒与蛋白的吸附, 造成假阳性结果, 因此, 在采用胶体免疫层析技术进行检测时, 要提高检测 的特异性和灵敏度, 提高质量, 减少假阴、假阳性[43]。 进一步提高检测灵敏度、实现多元检测、实现定量或 半定量检测是将来免疫层析分析发展的方向。 胶体金免疫层析技术作为一种新型的免疫学快 速诊断和检测技术, 具有操作简单快速, 可单份测定, 无须特殊仪器等优点, 在食品安全检测领域的应用 已得到了很好的发展。如动物源性食品中违禁药物 (β-激动剂、抗生素、激素等)的残留检测, 在真菌毒 素检测方面, 胶体金免疫层析技术也显示出了它的 优势。总之, 随着胶体金免疫层析技术的发展, 作为 一种简单快速的检测技术, 将会在真菌毒素的快速 检测领域中得到充分的发展和广泛的应用。 参考文献
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食品安全质量检测学报

第4卷

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(责任编辑: 赵静)

作者简介
李康, 高级工程师, 主要研究方向为食 品质量安全检测技术。 E-mail: lik@hzzjy.net 盛慧萍, 本科, 主要研究方向为食品安 全快速检测技术。 E-mail: huipingsheng@126.com


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