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紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性


农业基础科学

《现代农业科技}2009年第20期

紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性
杨兰芳庞静彭小兰闰静静
(湖北大学资源环境学院,湖北武汉430062)

摘要为简便快速测定植物过氧化氢酶活性。进行了紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的新方法试验。结果表明:本法操作简 便,重现好,相时误差

小,不需要特殊的试剂和仪器设备,适合于批量分析;利用硫酸阻止和终止酶促反应,既简化了操作,又减少了误差来 源:本法的测定结果与高锰酸钾滴定法的结果呈极显著线性相关,是一种值得推广应用的测定植物过氧化氲酶活性的新方法。 关键词 过氧化氢酶;紫外分光光度法;植物;硫酸;高锰酸钾滴定法 中图分类号 Q946.8 文献标识码A 文章编号1007—5739(2009)20—0364—03

Abstract

of Catalase ActivitT in Plants by Uitraviolet Spectrophotometry PENG Xiao-lan YAN Jing-jtng YANG Lan-fang PANG jing (College of Kesources andEnvironmental Science,Hubei University,Wuhan Hubei 430062) A new measuring method by ultraviolet spectrophotometry was conducted in order tO analyze the activity of catalase in plants.The

Measurement

results showedthismethodWas suitablefor analyzing samplesmbatchesasits

simple convenientoperation,high reproducibility,little errors,no special and expensive reagents.equipments.The usage of sulfuric acid tO prevent and stop the reaction not only simplified the operation。but also reduced the
of errors.Wi出a very significant linear correhtion between the ultraviolet spectrophotometry and potassium permanganate titration,it proved that ultraviolet spectxophotometry was a valuable medlod and worth popularizing in determination ofcatalase activity in plants.
source

Keywords

catahse;ultraviolet spectrophotometry;plant;sulfuric acid;potassiumpermanganatetitration

过氧化氢酶是植物体内清除过氧化氢的主要酶类【1】,植 物代谢过程会产生活性氧自由基,再转化成过氧化氢,而过

标定,该溶液的浓度为0.3178 mol/L
mg/mL H_020

1/2

H202,亦即5.402 6

氧化氢对植物细胞具有损伤作用因。过氧化氢酶的主要功能
即清除植物代谢过程产生的过氧化氢,从而对植物细胞具有

8%硫酸:吸取40mL分析纯浓硫酸缓慢加入约350mL 蒸馏水中。冷却后定容至500mL。 高锰酸钾溶液:称取分析纯高锰酸钾(KMnO.)3.169,溶 解后定容至1 000mL,其准确浓度用草酸钠标定。经标定该 溶液浓度为0.099 0mol/L 1/5 H202。 紫外分光光度计:UV-9100,北京瑞利分析仪器有限 公司。 冷冻离心机:恰菲尔,GL一20B,上海恰菲尔分析仪器有 限公司。 1.3试验方法 1.3.1植物过氧化氢酶提取液的制备。统一剪取大豆第3 叶带回室内洗净。用吸水纸吸干水分后称重,然后放进研钵 中加入3mL pH值7.8的磷酸盐缓冲溶液,加入少量石英 砂,在冰浴上研磨成匀浆,再加入5mL缓冲溶液研磨均匀, 转入25mL比色管中。并用缓冲溶液少量多次洗涤研钵,洗 液并入比色管中。最后用缓冲溶液定容至刻度。摇匀后取约

保护作用髑。植物过氧化氢酶还与环境污染与胁迫㈣、营养
元素缺乏is一、病虫害危害有关【t.1。研究植物过氧化氢酶,可 以认识植物的生长状况、了解植物是否受到损伤、揭示植物 与不良环境的关系以及为植物营养诊断提供依据。因此,探 索一种简便快速的测定植物过氧化氢酶活性的方法,具有 重要的科学和实用价值。当前对植物过氧化氢酶活性的测定 方法,有的需要特殊仪器装置,有的操作和人为误差大,有 的需要昂贵试剂,有的操作繁琐,都不利于批量样品分析和 快速测定。本试验探索利用紫外分光光度法直接测定植物过

氧化氢酶活性,具有简便、快速和不需要特殊试剂和仪器的 特点.对植物过氧化氢酶的研究具有重要实践意义和运用 价值。
l材料与方法 1.1材料 所用植物为大豆(Glycine卅删Merr.),在大豆结荚期采 取不同环境条件生长的大豆叶片样品6个,分别编号为sl、 S2、s3、s4、s5和s6。 1.2试剂与仪器 磷酸盐缓冲溶液(pH值7。8):称取65.529 NazHPO.? 12H20(分析纯)、2.669 NaH2P04?2H20(分析纯)、109聚乙 烯吡咯烷酮(PVP,分析纯),用约900mL蒸馏水溶解,检查 pH值后定容至1 000mL。

5mL溶液于离心管中。成对调节平衡后用冷冻离心机在
4aC 4

0009下离心10min,上清液即为过氧化氢酶提取液,

转入小试管中保存于40C冰箱中备用。 1.3.2紫外分光光度法测定过氧化氢酶活性。样品测定:取 小试管2支,1支做样品管,1支做对照管。在对照管里依次 加1.5mL缓冲溶液、O.1mL酶提取液、0.2mL蒸馏水、1.0mL

硫酸、O.2mL过氧化氢溶液。在样品管里依次加1.5 mL缓冲
溶液、O.1mL酶提取液、1.2mL蒸馏水,然后加入O.2 mL过 氧化氢溶液。立即计时4min后加入lmL硫酸终止反应。然

过氧化氢溶液:吸取300,6过氧化氢(分析纯)1.5mL,用
蒸馏水定容至lOOmL。用高锰酸钾标定其准确浓度。经过
基金项目 作者简介 收稿日期 湖北省教育厅重点项目(D20091009)。 扬兰芳(1964-),男,湖北武汉人,土家族。剐教授,博士,主 要从事土壤物质循环度其环境效应方面的研究。
2009-08-03

后在240姗处以蒸馏水调零。分别测定样品管与对照管的
吸光度。 标准曲线:取小试管6支并编号,按表1依次加完各种 试剂后摇匀。然后在240nm处以0号管调零,测定其余各管

万   方数据

<现代农业科技)2009年第20期 吸光度。 表1标准曲线的配制

农业基础科学
表2紫外分光光度法测定大豆过氧化氢酶活性的重现性

试管编号缓冲笋液8%鹭酸 些 坠
O 1 2

蒸堡水 些
1.5

过氧乎氢 些
0 0.1 O.2 O.3

H20:




1.5 1.5
1.5 1.5 1.5 1.5

1_0 1.O

1.4 1.3
1.2

0.540
1.080 1.621 2.161

1.O
1.O 1.0 1.0


4 5

1.1
1.0

0.4
0.5

对上述6个样品的同一提取液利用高锰酸钾容量法测

2.701

定过氧化氢酶活性,与紫外分光光度法测定的酶活性相关
图如图2所示。可以看出,高锰酸钾容量法所测定的酶活性

结果计算:植物过氧化氢酶活性E(mg H/D:/min?g)--

!(垒二叁2±垒X三£,其是凡为对照的吸光度,AI为样品的
Wt 0.1

比紫外分光光度法高,但2种方法线性相关系数达到o.994 3
(P<0.01),说明2种方法之间存在极显著线性相关。

吸光度,t为反应时间(rain),a,b为标准曲线回归方程中的 常数。 lB.3高锰酸钾容量法测定植物过氧化氢酶活性。取50mL 三角瓶2个,1个做样品,1个做对照。在对照瓶中,依次加 入lmL酶提取液、1.5mL缓冲溶液、2.5mL硫酸和过氧化氢 2.5mL。在样品瓶中依次加入lmL酶提取液、1.5mL缓冲液
掣 :I穹


懊 ■

和2.5mL过氧化氢溶液后立即计时4min。加入2.5mL硫
酸。然后将对照和样品分别用高锰酸钾溶液滴定至紫红色



保持30s不褪色为终点。对照与样品消耗的高锰酸钾溶液体
积之差所相当的过氧化氢的量即为被酶促反应所分解的过

∞巧加酷∞弱∞钙柏
25 30 35 40 45 5U 55

氧化氢的量。则植物过氧化氢酶活性为:E(mg H20Jmin?g) =![!:xCxl7x25,Ⅵ为对照所消耗的高锰酸钾的体积,
Wt

紫外法酶活性

图2紫外分光光度法与高锰酸钾容量法相关性 利用样品s3的酶提取液同时用紫外分光光度法和高

v.为样品所消耗的高锰酸钾体积,c为高锰酸钾的浓度(mol 1/5KMnO.),17为lmol 克数。 2结果与分析 2.1吸光度与过氧化氢数量的关系 将所测定的标准系列进行回归分析(图1)。可看以出, 过氧化氢的毫克数c与吸光度A之间呈极显著的线性相 关,其相关系数达到0.9996,说明在240 nnl下利用紫外分
1/5

KMnO。所相当的过氧化氢的毫

锰酸钾容量法各做5次重复测定,结果如表3所示。可以看 出,紫外分光光度法的酶活性低于高锰酸钾容量法,但是紫 外分光光度法的变异系数比高锰酸钾容量法略小,说明紫外
分光光度法的重现性优于或与高锰酸钾容量法相当。 表3同一样品2种方法的重现性比较

光光度法进行溶液中过氧化氢的定量分析是可行的。
3O

3讨论
25 2O 1


植物过氧化氢酶是植物的抗氧化酶类,对植物细胞具
有抗氧化损伤的保护作用。因此,测定植物过氧化氢酶活

性可以认识植物是否受到损伤,揭示植物对环境的响应。
测定植物过氧化氢酶活性的方法有紫外速率法、高锰酸钾 滴定法、碘量滴定法、氧电极法、分光光度法、气量法等18-“1。

的S≮0基
1 0

O 5

用紫外分光光度法直接沉淀测定植物过氧化氢酶活性的
方法尚未见报道。虽然紫外速率法也是在240rim下测定吸
0 0.2 0.4 0.6 0.8



1.0

光度is”01,但它是测定吸光度的变化速率,一方面需要在一
定时间内多次读数,操作记录时容易出错,另一方面用吸

吸光度

图l吸光度与过氧化氢量的关系 2.2方法的重现性 对所取的6个样品按紫外分光光度法测定其过氧化氢 酶活性,每个样品重复测定5次,所得结果见表2。可以看

光度的变化率表示酶的活性,只是相对活性,不便于不同
高锰酸钾滴定法比较。陈晓敏l埘利用紫外分光光度法直接

测定过氧化氢含量来测定植物过氧化氢酶活性,但其所用 波长是290rim,而该吸收峰下对过氧化氢灵敏度不如240
nnl处高。王春台等㈣也研究利用紫外分光光度法测定植

出,6个样品所测定的过氧化氢酶活性的变异系数在4.4%~
5.1%之间,表明该方法的测定误差较小,重现性较高。 2.3紫外分光光度法与高锰酸钾容量法的相关性

物过氧化氢酶活性,但他们是根据碘量滴定的原理,在350
nnl下测定碘的浓度。胡常英等【111可见分光光度法测定过
365

万   方数据

农业基础科学 氧化氢酶活性,但需要利用过氧化物酶等特殊试剂,试剂 昂贵且不容易购买。气量法需要特殊装置,不便于批量分

《现代农业科技)2009年第20期 既可减少误差,简化操作,又能稳定溶液中的过氧化氢。 (4)紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性操作简 单、重现性较好,与高锰酸钾呈极显著的线性相关,可用于 植物过氧化氢酶活性的测定。 5参考文献 【1】WITLEKENSH,INZIiD,VANMONTAGUM,et a1.Catahsesinph-

析,氧电极法的重现性不稳定。本试验利用紫外分光光度
法在240nm下直接测定溶液过氧化氢的浓度来测定植物

过氧化氢酶活性,与常用的高锰酸钾滴定法相比具有操作
简单、快速、重现性与高锰酸钾滴定该相当的优点。同其他

烹法相些苎妻不需零特殊试剂的优点,可以用于测定植物 过氧化氢酶活性。本试验结果表明,运用紫外分光光度法
其主要原因是在滴定过程中,由于提取液可溶性有机物的 影响,近终点容易褪色,使得滴定终点不好控制,但2种方

f2】nstHs.IMMolIecsu,laMr盖漾;堂Y,19。Y95A(M1)A:M2007-T2028A,et allnhibidon。f。。妇
~a。d、rityby o妇da石ve

s吣。d虹rcl。d。。hipto saliqdic acid acc岫llla一

测定的同一样品的过氧化氢酶活性低于高锰酸钾滴定法,tioninplants[J].PlantGrowthRegulation,2003(39):285—292.

【31翼譬:篓兰篓‘生物过氧化氢酶研究进展[Jl?中国农学通报,2005,21
【4】王丽红。黄晓华,周青冰稻、,j、麦和油菜种子萌发POD与CAT对

羹竺型塞笆苎景墨曼惹鬯笔竺塑差,琶粤篓签2冀登度篓嘲霎墓藻焉墨鏊譬蓄誉科学,等.应,2用00过5,2氧6化(6)氢:1酶23活-1性25对水培叶菜缺铁 测定植物过氧化氢酶活性是可行的。本试验中运用8%硫
酸来终止酶促反应,对照采用先加酸后再加基质过氧化
【6】R.IO
L A

…1荡簖罚搡i}i淼装蓝吴莩摹翥,j茹ii:盖焉矗萏。……“”“
D.GOMEZ M,YAlqEZ J,et a1.Iron deficiencyin
pea

plants

氢,而没有采用一般方法中的加热煮沸使酶失活,这样既篓嚣嚣:品碧罱;署尝鬈。h10∞phyⅡ勰d
保持对照和样品基体的一致性,又简化了操作过程,还避
免了加热带来的误差。因为在试验中发现加热煮沸使酶失 活时,溶液中蛋白质会因热变性而产生沉淀,导致很大的 吸光度误差。所以硫酸不仅能阻止和终止酶促反应,还能 稳定过氧化氢。 4结论 (1)在240nm下,溶液吸光度与过氧化氢毫克数之间呈

9烈。螂d b”01’phn‘

阴MEDH0 M‘三.Ac曲。。xygen

[81懋烹恚理生化试验原理和技术【M】?北京:高等教育出版社
田.PlantPhysiol,1994(105):467—472.

sp。d岛iIl

plaIlt

de鼬。嚼岫pa血ogcm

【9】郝建军,康宗利,于洋埴物生理试验技术fM】.北京:化学工业出版

n川淼戮晏器髫苗篙差警锄媳悯豁性
’一

社,2007?

【11】胡常英,刘丽娜,胡凤英,等用721一分光光度计测定过氧化氢酶活

銎垩萋紫竺兰望参i粤可以用紫外分光光度法进行溶液 中过氧化氢的定量分析。
(2)紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的变异 系数在5.1%的以下,说明该方法重现性好,相对误差小。 (3)在对照和样品中利用硫酸来阻止和终止酶促反应, (上接第362页) 化素质,所以在4个方面内容都讲授的基础上,重点讲授茶 文化史。

【12篇墨誓葬蝶是裟蠹嬲,性20的05定(6量):测11定U】6-11稍8.教育':川。 ‘’f4¨6一j7 ‘一。……。……一…一…一
[131陈晓敏.测定切花中过氧化氢酶活性的3种方法的比较加热带农

【10望嚣2,0徐02同,2,2刘(5学):群13.-紫1外6.分光光度法测定过氧化氢酶活性D】.华


中农业大学学报,1987,6(1):77—81.

历史上茶艺服装的发展感兴趣;植物保护专业的学生,可 能对历史上茶园管理的发展感兴趣;法律专业的学生.可 能对历史上的茶叶法规感兴趣;经济学专业的学生,可能 对茶叶经济贸易感兴趣;外国语专业的学生,可能对茶叶 对外传播感兴趣;中文专业的学生,可能对茶文学作品的 历史发展感兴趣等等。因此,可以要求其他专业本科生,结 合自己所学专业以及兴趣爱好,写作有关茶叶历史课程内 答的论文。 而对于茶学专业研究生,必须要求所写课程论文具有 一定的深度,不能只是泛泛而谈,应该针对某一个茶叶历史 问题,进行较为深入的分析与讨论,要有理有据地提出自己 的观点,以达到培养学生学术素养的教学目标。 5爹考文献

从学时和学期安排上可以明显看出。茶学专业研究生 需要全面而深入的掌握茶叶历史知识。因此,可以在上学期
讲授茶文化史、茶传播史,下学期讲授茶科技史、茶经济史, 在内容深度上,对重要的茶叶历史问题要展开深入的分析。 对不同的学术观点要进行科学的探讨,以培养研究生的学 术素养。 4关于茶叶历史课程的考核方式

课程教学临近结束时,就进入考核环节。针对不同的教
学对象,需要采取相应的考核方式。对茶艺专业高职学生、 茶学专业本科生,适宜采取闭卷考试的方式,以促进学生记 忆并掌握所学知识点。对其他专业本科生、茶学专业研究生,

‘11曩+‰忑譬翥夏涛?关于茶艺教育招生问题的探讨田现代农业科

适宜采取写作课程论文的方式。不过,同为写作课程论文。 但是对课程论文的要求是不同的。

其他专业本科生,比如服装设计专业的学生.可能对42—48. (上接第363页) 动态变化,保障生物物种资源安全、生态环境安全、促进生 物物种资源持续快速协调健康发展。


罱檗差喜磐掣翌美誓翟然舞亮Ⅱ】.茶叶科学,:00。(,):
121夏涛.中华茶史【M】.厶肥:安徽教育出版社,2008. 现代化,2008(5):282—283.

【2】莫晓凤.刍议生物物种咨源出入境查验田冲国检验检疫,2009(9): [31绿ID报--ID我,国外来生物入侵形势严峻Ⅱ】.湖南林业,2007(2):39.
【4】季生敏.对大兴安岭林区生物多样性保护的探讨叽.民营科技,2009
(3):83.

参考文献

【1】李庆年,申相德.加快产权制度创新防止我国物种资源流失Ⅱ】.商场

万   方数据

紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性
作者: 作者单位: 刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 杨兰芳, 庞静, 彭小兰, 闫静静 湖北大学资源环境学院,湖北武汉,430062 现代农业科技 XIANDAI NONGYE KEJI 2009(20)

参考文献(14条) 1.WITLEKENS H;INZE D;VAN MONTAGU M Catalases in plants 1995(01) 2.王春台;徐同;刘学群 紫外分光光度法测定过氧化氢酶活性 1987(01) 3.陈晓敏 测定切花中过氧化氢酶活性的3种方法的比较[期刊论文]-热带农业科学 2002(05) 4.张宝元;靳卫东 过氧化氢酶活性的定量测定 2007(04) 5.胡常英;刘丽娜;胡凤英 用721-分光光度计测定过氧化氢酶活性的新方法[期刊论文]-中国食品添加剂 2005(06) 6.李仕飞;刘世同;周建平 分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的研究[期刊论文]-安徽农学通报 2007(02) 7.郝建军;康宗利;于洋 植物生理试验技术 2007 8.王学奎 植物生理生化试验原理和技术 2006 9.MEDHY M C Active oxygen species in plant defense against pathogens 1994(105) 10.RIO L A D;GOMEZ M;YANEZ J Iron deficiency in pea plants effect on catalase,peroxidase,chlorophyll and proteins of leaves 1978(49) 11.张耀栋;陈春宏;高祖民 应用过氧化氢酶活性对水培叶菜缺铁诊断初探 1993(01) 12.王丽红;黄晓华;周青 水稻、小麦和油菜种子萌发POD与CAT对酸雨胁迫的响应[期刊论文]-环境科学 2005(06) 13.刘冰;梁婵娟 生物过氧化氢酶研究进展[期刊论文]-中国农学通报 2005(05) 14.SHIM I S;MOMOSE Y;YAMAMOTO A lnhibition of catalase activity by oxidative stress and its rehtionship to salicylic acid accumulation in plants 2003(39)

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