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蛋白质分子的糖基化改性及其乳化性能的研究


全国第十三次工业表面活性剂研究与开发会议

蛋白质分子的糖基化改性及其乳化性能的研究
杨林峰 赵剑曦*
福州大学化学化工学院 化学系 350002 福州 摘要 采用天然的高分子物质蛋白质和多糖 利用羟氨反应 使蛋白质分子的侧链氨基与多糖分子的 末端不饱和羰基反应形成稳定的共价键 形成以多羟基多糖部分为亲水基 蛋白质部分为疏水基的新 型两亲分

子 同时也生成一种新型的 Gemini 分子 具有更好的界面膜强度性质 且兼有多糖的增稠性 良好的生物亲和性 关键词 分子 天然的高分子两亲分子 蛋白质多糖共价化合物 羟氨反应 天然的高分子乳化剂 Gemini

1.

引言

天然高分子物质 如水溶性蛋白质 树脂是早已熟知的保护胶体 许多合成高分子物质 如聚乙 烯醇 部分水解的聚丙烯酰胺以及聚丙烯酸盐等 一般多用作乳化剂和分散剂[1] 两亲分子在乳状液 液滴的界面上聚集 形成界面膜 大分子两亲分子所形成的界面膜具有更好的硬度 从而具有更好的 稳定性 但是合成高分子物质对于生物体存在安全性的问题 尤其是对于人体 当用作药物的乳化剂 时 无论是口服还是静脉注射 都存在很大的隐忧 而天然高分子物质在这方面有着得天独厚的优势 天然亲水高分子化合物 如海藻酸钠 阿拉伯胶 黄胶等常在医药中被用于配制乳状液 它们具有安 全 无毒的特点[2] 多糖 蛋白质都是具有表面活性的[3] 许许多多我们日常使用的蛋白质和多糖对人 体都是安全且有营养的 蛋白质是一种两亲分子 具有独特的表面活性 作为高分子乳化剂 其分子量大 能改善乳化体 中各种组分之间的表面张力 使之形成均匀的分散体或乳化体 但蛋白质遇热 有机溶剂等不稳定 会变性或分解失去其表面活性 如果修饰蛋白质就可使其达到一种稳定状态 多糖在液相中有增稠性 和凝胶行为 且多糖为多羟基化合物 水溶性好 如果把多糖链接到蛋白质上 不仅可以改善其水溶 性 也可增加其稳定性 更可以以多糖部分为亲水基 蛋白质部分为疏水基形成界面活性更好的两亲 分子 并且由于具有多糖的增稠作用 提高了乳状液的稳定性 乳化性能更佳 况且由于蛋白质分子 的赖氨酸侧链上的 氨基与多糖分子的还原性羰基末端之间的羟氨反应[4]生成的共价键(即Shiff碱的 碳氮双键 很稳定 使蛋白质 多糖复合物对于高温 酸碱性 高盐度有很好的耐受性 其表面活性 很稳定

2
2.1

实验

主要试剂 大豆分离蛋白 辽宁博丰集团有限公司提供 纯度 90% 葡甘聚糖 重庆里茂农产品开发有限 公司提供 纯度 90% KBr 分析纯 丙烯酰胺 分析纯 硫酸铵 分析纯 肉豆蔻酸异丙酯 IPM 化学纯 去离子水 主要仪器 冷冻干燥机 德国 Christ 公司 DHG-9030A 恒温箱 美国 Bio-Rad 公司 MODEL868 PH 计 美国 Orion 公司 筒 干燥器 单滴法实验装置 自制 2.2 2.3 实验方法 2.3.1 蛋白质和多糖的共价反应

上海精宏实验设备有限公司 凝胶电泳仪 飞鸽牌离心机 上海安亭科学仪器厂 针

万方数据

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将葡甘聚糖和大豆分离蛋白以质量比 1 1 溶于去离子水成 6g/L 的溶液 然后冷冻干燥[5] 获得的样品 置于干燥器中 干燥器底部装有溴化钾饱和溶液 把干燥器置于恒温箱中 在保持相对湿度 79%的条 件下 温热 60o C 缓慢反应 1~2 周
H2O L NH 2 + 0 = C L N = C →

Fig.1 protein and polysaccharide covalent reaction 2.3.2 SDS-PAGE 十 二 烷 基 硫 酸 钠- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 SDS-PAGE[6] 分离胶与浓缩胶配制 Table. 1 The preparation of SDS-PAGE 20ml,15% 10ml,3% 试剂名称 分离胶 浓缩胶 分离胶储液 8 30%Acr-0.8%Bis 分离胶缓冲液 2.5 pH8.9Tris-HCl 浓缩胶储液 3 10%Acr-0.5%Bis 浓缩胶缓冲液 1.25 pH6.7Tris-HCl 10%SDS 0.2 0.1 1%TEME 2 1 重蒸馏水 3.2 4.6 混匀后 置于真空干燥器中 抽气 10 min 10%AP 0.1 0.05 电泳最初电流为10mA 样品进入分离胶后调至20~30mA 当样品中染料迁移至距硅胶框底边2cm 时停止电泳 固定过夜 考马斯亮蓝G250染色7 h[7] 最后醋酸脱色过夜 以 schiff 试剂对多糖染色[8] 依以上方法操作 2.3.3 产 物 提 纯( 等 电 点 盐 析 法) [9] 取少量产物 0.2g 溶于去离子水 10mL 加稀盐酸溶液以调节 pH 为大豆分离蛋白的等电点 pH 4.2~4.5 以硫酸铵盐析法来测试其沉淀曲线 以离心沉降来获得沉淀物 对较大饱和度下的沉淀物加 浓硝酸变黄 说明是蛋白质 染以 schiff 试剂后经脱色剂泡洗而不褪色 说明是多糖

万方数据

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0.150

the amount of settle quality

0.145 0.140 0.135 0.130 0.125 0.120 0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

(NH 4 ) 2 SO 4 saturation degree

Fig.2 Variation of the amount of precipitation quality for the soy protein–glucomannan mixture after 14 days of the reaction with (NH4 )2 SO4 saturation degree 以沉淀曲线上硫酸铵饱和度 40%~60%的沉淀区间有较多沉淀为依据 调节硫酸铵饱和度为 40%~60% 以 20000r/min 离心沉降得到沉淀产物 2.3.4 透 析 法 去 离 子[10] 将制得的产物溶于少量去离子水 放入半透膜中封闭好 置于去离子水中透析两天 每天换水一 次 2.3.5 冷冻干燥 透析后的产物冷冻干燥得成品 2.3.6 单 滴 法[11] 测 试 产 物 乳 化 性 能 配制 4.417g/L 的产物溶液 28ml 加入单滴法实验装置 类似竖立的粗短冷凝管 中 稳定在 30o C 回流 从顶部入口加入 3ml 肉豆蔻酸异丙酯 IPM 从底部注射器小心挤出 IPM 油珠 记录其接触到 油水界面层到破裂的时间 共记录 30 滴 往产物溶液中加入 NaCl 使 NaCl 浓度为 0.19mol/L 重复上面操作 配制质量浓度为 4.417g/L 的 Tween–60 的水溶液 重复以上实验操作

3

结果与讨论

蛋白质与多糖的共价键合反应条件很苛刻 因为蛋白质分子是卷曲状的 由于其疏水链的疏水相互 作用 其赖氨酸的 –氨基是包埋在内部 很少外露的 通过加热 使蛋白质分子慢慢疏展开来 使其 –氨基充分外露 参与反应 同时 水溶剂的存在 与 –氨基的氢键作用和溶剂化作用 使 –氨基 被水分子包围 不易与同样被水分子包围的多糖末端不饱和羰基反应 所以需在无水的条件下进行反 应 在碱性条件下 可以加强 –氨基的亲核性 但由于不好控制反应程度 褐变剧烈 产物颜色加深 甚至发黑 不能使用 所以只能采用干热法 使其生成颜色浅的复合物 3.1 SDS–PAGE 十 二 烷 基 硫 酸 钠- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳

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2 1 2 A B Fig.3 Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoretic patterns of soy protein–glucomannan mixture after 14 days of the reaction.Lane1, soy protein–glucomannan mixture after 14 days of the reaction;lane2,native soybean protein.(A) Protein stain;(B) carbohydrate stain. 由SDS–PAGE考染图可见 右边为大豆分离蛋白水溶液的电泳轨迹图 左边为反应二周的未提纯产 物的水溶液的电泳轨迹图 通过数小时的电泳迁移 不同分子量的物质迁移距离不同 分别用考马斯 亮蓝G250和schiff试剂对蛋白质和多糖染色 如果迁移距离相同 说明该物质既含有蛋白质又含有多糖 在原蛋白质染色位置后面出现 拖尾 现象 也说明了有分子量更大的蛋白质复合物的生成 且为混 合物 右边的电泳轨迹中明显的四条横向的痕迹 是大豆分离蛋白中的四种蛋白质 因分子量不同而迁移 距离不同所致 而左边的产物电泳轨迹中无横向的痕迹 说明这四种蛋白质分子量发生变化 而反应 物中只有蛋白质和多糖 可以认为蛋白质分子共价键合上了多糖分子 且是随机的 所以为混合物 在电泳中迁移的距离是不同的 左边电泳轨迹中迁移较远处的模糊痕迹的 拖尾 现象也说明了蛋白 质多糖共价复合物分子的生成 由SDS–PAGE糖染图可见 右边为大豆分离蛋白水溶液的电泳轨迹图 左边为反应二周的未提纯 产物的水溶液的电泳轨迹图 左边轨迹上端有分子量较大迁移较慢的多糖分子的糖染痕迹 最下端有 分子量较小迁移较快的多糖分子的糖染痕迹 与考染图中左边轨迹的相应的位置的染色痕迹相对应 应为既含蛋白质又含多糖的分子 即蛋白质多糖共价复合物分子 因含有未反应的多糖 故染色痕迹 比较浓 3.2 等电点盐析法提纯 利用等电点盐析法沉淀蛋白质 快速的分离以保证蛋白质不至于变性 少量产物的盐析沉淀曲线

1

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上 在硫酸铵饱和度为 0 时的沉淀为不溶物 10%时为少量未反应的大豆蛋白质 40%~60%时的较大 量沉淀为蛋白质-多糖复合物 因为在大豆蛋白质的等电点附近 盐度稍微加大就会使大豆蛋白质沉淀 而蛋白质-多糖复合物由于亲水性增强 不易沉淀 必须在更高的盐度下才会析出 多糖分子由于含负 电荷很小 只有在极高的盐度下才会部分析出 所以可以认为硫酸铵饱和度 40%~60%时的较大量沉淀 为蛋白质-多糖复合物 3.3 渗 析 法 去 除 离 子 通过半透膜透析去除离子 以避免离子对产物乳化性能的影响 3.4 冷 冻 干 燥 蛋白质是活性物质 冷冻干燥以保证蛋白质不变性 避免其它蒸发干燥的方法对蛋白质性能的影 响 3.5 单 滴 法 测 试 产 物 乳 化 性 能 不 同 PH 不 同 盐 度 高 温 条 件 下 将未破油珠数和油珠稳定时间做图 根据方程 Ln(Ln N0 /N)=LnK+nLn(t-t0 )做 Ln(Ln N0 /N)对 Ln(t-t0 )的直线 求得斜率 n 和截距 LnK 下面是蛋白质 多糖共价复合物的实验图

the number of oil droplets not coalescing in time. t / min

30 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5

coalescence time. t / min

Fig.4 Variation of the number of oil droplets not coalescing with coalescence time for IPM droplet at IPMprotein-polysaccharide conjugates water solution interfaces

万方数据

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0.50 0.45

FRACTION OF DROPLETS COALESCING IN TIME. t / min

0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0 1 2 3 4 5 6

COALESCENCE TIME. t / min

Fig.5 Gauss distribution of fraction of droplets coalescing in time for IPM droplet at IPM–proteinpolysaccharide conjugates water solution interfaces
2

1

ln(ln(N 0/N))

0

-1

-2

-3 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0

0.5

1.0

1.5

ln(t-t0 )

Fig.6 Relation between ln(ln(N0 /N)) and ln(t-t0 ) for IPM- protein-polysaccharide conjugates water solution system 经处理 由 LnK=-0.6314 得 K=0.5318 n=1.2558 t1/2=2.2min 最可几分布 tm=2.1min 以下是加入盐溶液的蛋白质 多糖共价复合物的实验图

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30

the number of oil droplets not coalescing in time. t / min

25 20 15

10 5 0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

coalescence time. t / min
Fig.7 Variation of the number of oil droplets not coalescing with coalescence time for IPM droplet at IPM– protein-polysaccharide conjugates water solution(containing NaCl) interfaces

0.35

FRACTION OF OIL DROPLETS COALESCING IN TIME. t / min

0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

COALESCENCE TIME. t / min

Fig.8 Gauss distribution of fraction of droplets coalescing in time for IPM droplet at IPM–proteinpolysaccharide conjugates water solution(containing NaCl) interfaces

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2

1

ln(ln(N 0/N))

0

-1

-2

-3 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5

0.0

0.5

1.0

ln(t-t0 )

Fig.9 Relation between ln(ln(N0 /N)) and ln(t-t0 ) for IPM–protein-polysaccharide conjugates water solution(containing NaCl) system 经处理 由 LnK=0.1252 得 K=1.1334 n=1.4446 t1/2 =1.7min 最可几分布 tm=1.9min 以 Tween–60 来对比其性能 的实验图 配制相同浓度的 Tween–60 水溶液 通过相同的单滴法的实验 获得以下

30

the number of oil droplets not coalescing in time. t / min

25 20 15 10 5 0 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

coalescence time. t /min

Fig.10 Variation of the number of oil droplets not coalescing with coalescence time for IPM droplet at IPM– Tween–60 water solution interfaces

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0.6

FRACTION OF OIL DROPLETS COALESCING IN TIME. t / min

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

COALESCENCE TIME. t / min

Fig.11 Gauss distribution of fraction of droplets coalescing in time for IPM droplet at IPM– Tween–60 water solution interfaces

1.5 1.0 0.5

ln(ln(N0/N))

0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -2.0 -2.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5

ln(t-t 0 )

Fig.12 Relation between ln(ln(N0 /N)) and ln(t-t0 ) for IPM –Tween–60 water solution system 经处理 由 LnK=0.9755 得 K=2.6525 n=1.1678 t1/2=36s 最可几分布 tm=38s

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Table. 2 The results of experiment N K 1.2558 0.5318

Emulsifier tm (min) soy protein– 2.1 glucomannan conjugates soy protein– 1.4446 1.1334 1.9 glucomannan conjugates with NaCl Tween-60 1.1678 2.6525 0.63 n 值相同 则 K 值小 界面膜强度大 这三者 n 值相似 蛋白质 多糖复合物的 K 值最小 可认 为其界面膜强度最好 而 Tween–60 的最差 蛋白质 多糖复合物的含盐溶液介于二者之间 且由半衰 期 t1/2 和最可几分布 tm 也可看到, 蛋白质 多糖复合物的半衰期 t1/2 和最可几分布 tm 约为 Tween–60 的 4 倍 可见蛋白质 多糖复合物的界面膜强度远好于 Tween–60 大分子吸附后在界面上形成了相当刚性 的膜[12] 蛋白质 多糖复合物的含盐溶液的界面膜强度也好于 Tween–60 而加入电解质会降低体系的 相转变温度 PIT [13] 从而可知以蛋白质 多糖复合物为乳化剂形成的乳状液的稳定性和界面膜的强 度对电解质溶液有很好的耐受性

4 研 究 的 意 义 和 目 的
高分子两亲分子是一类新型的表面活性物质 天然高分子两亲分子更具有独特的优越性 可以利用 天然的原料 合成无毒 有营养 具特异性能的崭新物质 可以作为配制药品的乳化剂 对于口服的 或静脉注射的都可以是安全的 而目前常用的人工合成的两亲分子 不具备生理活性 即使是无毒的 也会加重人体脏器的负担 而天然高分子两亲分子对于患者还兼有补充营养的功效 一举两得 蛋白 质分子可以有多种选择 共价键合上的多糖分子可以是高聚糖 也可以是经部分水解后得到的低聚糖 有报道 低聚糖对人体具有生理活性 由此我们可以得到疏水基 蛋白质部分 和亲水基 多糖部分 大小不同的两亲分子 通过调整它们的大小 可以得到表面活性不同的两亲分子 尤其是多糖所具有 的增稠性和凝胶作用 对于其作为乳化剂就更有意义 有报道 某些低聚糖 或低聚糖的磺酸盐 有 抗肿瘤[14] 或抗艾滋病毒活性[15] 这是国际上这方面研究的最前沿的成果 在国外 目前这方面的研究 有向医药方面倾斜的趋势 Youtao[16]等人将溶菌酶与壳聚糖进行共价复合反应 提高了溶菌酶的表面 活性 使原先只对革兰氏阳性菌有效的溶菌酶对外膜主要成分为脂多糖的革兰氏阴性菌也有溶菌活性 作为药物乳化剂 既有乳化作用 又有抗病作用 还有营养功能 不仅可以增加一种新型两亲分子 对于药物 医疗方面也很有意义 如果往一个蛋白质分子上共价键接上两个多糖分子,就得到了Gemini 分子,它们具有特别的表面活性

5 研究内容的关键及创新之处
蛋白质与多糖的共价键合反应条件很苛刻 在这种反应条件的要求下 为使蛋白质分子上的 –氨 基和多糖分子充分接触 通过分别将其溶解在水中或缓冲溶液中为均匀溶液 充分扩散 均匀分布 继而冷冻干燥 在冻干的过程中 蛋白质分子和多糖分子的空间位置不变 仍保持充分接触状态 因 为蛋白质分子是卷曲状的 由于其疏水链的疏水相互作用 其赖氨酸的 –氨基是包埋在内部 很少外 露的 通过非高温加热 使蛋白质分子慢慢疏展开来 使其 –氨基充分外露 与多糖分子末端还原性 羰基发生羟氨反应 生成稳定性很高的共价键 从而获得以蛋白质部分为疏水基 多糖部分为亲水基 的新型高分子两亲分子 由于多羟基的多糖部分为亲水基 亲水性很好 就大大提高了修饰改性后的 蛋白质的表面活性 且多糖的增稠性对于提高界面膜的强度 增强该蛋白质-多糖复合物作为乳化剂时 乳状液的稳定性也是很有意义的 蛋白质的修饰改性由来已久 但着眼于赖氨酸的 –氨基上的修饰改性较少 尤其使之糖基化则几 乎没有 糖蛋白是目前研究的热点 本实验着力于合成一种新型的天然高分子两亲分子 并研究该蛋

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白质–多糖复合物的乳化性能及在药物乳化方面的前景 参考文献 [1] 赵国玺等 表面活性剂作用原理 中国轻工业出版社 2003年 54 [2] 梁治齐等 功能性乳化剂与乳状液 中国轻工业出版社 2000年 324. [3] 北原文雄等 表面活性剂 1979年 45 49. [4] 徐积功 有机化学基础 高等教育出版社 356. [5] LUBERT STRYER 生物化学 北京大学出版社 1990年 23. [6] 杨建雄 生物化学与分子生物学实验技术教程 科学出版社 2002 137. [7] 李如亮 生物化学实验 武汉大学出版社 1998年 57. [8] 杨建雄 生物化学与分子生物学实验技术教程 科学出版社 2002 142. [9] 陈毓荃 生物化学实验方法和技术 科学出版社 2002年 48 [10] 陆九芳等 分离过程化学 清华大学出版社 1993年 304 [11] PAUL BECHER ENCYCLOPEDIA OF EMULSION TECHNOLOGY VOLUME1 Basic Theory (1983) 185. [12] 梁文平 乳状液科学与技术基础 科学出版社 2001年 120. [13] 梁文平 乳状液科学与技术基础 科学出版社 2001年 59. [14] 蒋挺大 壳聚糖 化学工业出版社 2001年 215. [15] 张树政 糖生物学与糖生物工程 清华大学出版社 2002年 173 [16] Youtao Song,EL fadil E. Babiker,et al. Emulsifying properties and bactericidal action of chitosanlysozyme conjugates. Food Research International 35 (2002) 459-466

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