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γ-多聚谷氨酸摇瓶补料分批发酵的研究


食 品 与 发 酵 科 技  
F odan   r e t t   c o o   b   dFem n ai Te hn lgy on

第4 5卷 ( 4期 ) V i 5 N . 第 o. ,o4 4  

y 多聚 谷氨酸摇瓶补料分批发酵 的研 究  一
党建宁 , 梁金 钟 
( 滨 商 业 大 学

食 品 工 程学 院 , 尔 滨 1 07 ) 哈尔 哈 506  
摘 要 : 文 通 过 摇 瓶 补 料 分批 发 酵 方 式 下对  本 ~多聚 谷氨 酸产 量 影 响 的 研 究 , 终 确 定 了 玉米 糖 化 液 、 白胨 和 前 体  最 蛋

物 谷 氨 酸 钠 的 最优 初 始 浓度 和 最优 补 料 方 式 , 用 味精 作 为 前体 物 。 实验 结 果 显 示 了, 食 最优 初 始 玉米 糖 化 液 浓度 为  
2   L 最优 初 始蛋 白胨 浓度 为3 g L 最 优初 始前 体 物 谷 氨 酸 钠0 g L 进 行 全 组 分补 料 使 ^ 0 ,  / ,  / 。 y 一多聚谷 氨 酸 产 量 达 到 
76.6 g L。 5  /  

关 键 词 :/ P A; 料 分批 发 酵 ; 化 发 酵 条 件  , G 补 - 优

中图分类号 :Q 2 . T 9 06  

文献标识码 :   A

文章编号 :6 4 56 2 0 )4 0 4 - 0 4 17 — 0 X(0 90 —0 2 0 0 

S u y o   a k s a i g F d Ba c   r e t to   fv- t d   n Fl s - h k n   e   t h Fe m n a in o   PGA 
DANG Ja - ig L ANG Jn z o g  in nn , I  i - h n  

( h o o odE gneig Hab   n esyo o m re H bn10 7) S o lfFo  n i r , ri U i rt  c   e n n v i fC m ec, a i 50 6  r  

A s a tFak saig f   a h f met o  scre  u n tes d   yfeig g cs,ppoe n sdu bt c:l -h kn e b t  e n t ni ar d oti h  t y b edn  u oe etn,mooo i r s d c r a i   i u l m 
g tma  n o pee e e t o  du teepr n  slso sh th   i be ntl ocnrt no  uoe l a t adcm l   r na nmeim.h xei t eut hw   a tes t l iia cnet i  f cs, u e t fm i t me r   t   ua   i   ao l g  

ppo e m n sdu   ua aerset e    0 ,’ gL adO/ osp l n cm lt fr e t o  e im eey etn , o oo im g tm t ep cv l i 2 g 3/, n gLT  upe t o pe   m na nm du  vr  l   i ys L me   ee i t
1   o r r ml t   o ro   r n a o  p o e s t e p o u t n o / P 2 b usf o 2 h h u  ff me t t n r c s ,   r d c o   f ̄ GA  t i   6 5 gL b   a k s a i g f r e t t n e i h i - at n 7 . 6 /   y f s - h k n  e a l m n i   a o
fr48 h ur. o     o s 

Ke   r s  ̄ P y wo d : / GA; d b th f r e tt n o t n m  r n a o   o d t n - e f   ac  e m n i ; pi u f me t t n c n i o   a o l e i i

d i 1.9 9 .s.6 4 5 6 . O . — 1  o: 03 66i n17 — 0 X2 9O 04 s O 4



多 聚谷 氨 酸 n- o ( ua cc )  ̄ P A 是  P l g t ai ,/ G ] y l mi d -

【l 5 q


食 品用水 凝胶[ 粘稠剂嘲 以及高强 度纤维等翻 因  7 1 、 , 。

由微 生 物合 成 的一种 细胞 外 高 分子 。 它是一 种水 溶  性 的酰胺 化合 物 , 以通 过 芽孢 杆 菌 的变 种来 生 产 , 可   它的结 构 与众不 同 , 这种 阴离 子物 质 是 由L 型谷 氨酸  或D 谷氨 酸单 体 之 间通 过 氨基 和_ 型 y 羧基 形 成肽 键  之后 生 成 的 同聚 酰 胺【   一 G 1 】 。 P A具 有增 稠 、 化 、 乳 成 
膜、 湿、 保 絮凝 、 粘合 、 毒 、 溶 、 佳 的成 膜 性 , 无 水 极 成 

而可应 用在 工业 农业 广泛 的 领域 , 用 于食 品 、 适 化妆 
品、 生物 医学 、 环境保 护等领域 。 别是近 年来 随着对  特


聚谷氨 酸的深 入研究【,一 1  聚谷氨酸 作为一 种高分  o l

子生物 制 品, 愈显 现出广 阔 的研 究价值 和应 用前  愈来
景 。由于 目前 国内外 均无 规模化 生产 的产 品销售 , 因  此探讨 聚谷氨酸 的发酵过程 具有现 实意义 。  

纤 维性 , 阻氧性 , 塑性 , 结性 , 湿性 和 可生 物 降  可 粘 保 解 等独 特 的理化 和 生物 学 特性 ,是 一 种对 人体 和环 
境 无 毒 害 的 生 物 相 溶 性 新 型 天 然 高 分 子 ,一 般 由  5 0 5 o 个 左 右 的 谷 氨 酸 单 体 组 成 ,分 子 质 量 在  o ~ 00

补 料分 批 发 酵  d bth em nai ) - a fr et o 目前 受 到  c t n
世界 范 围的广 泛关 注 。补料 分批 发酵 法是 指在 发酵  过程 中, 过 间歇 的加入 某些 培 养基 成分 , 不 同 时  通 但
取 出发酵 液 的方法 。与分批 发酵 相 比补 料分批 发 酵 

1x 0- 0 l  a- P A以及其 衍 生物 可广泛 用作  0 l 1x 0 D 。 — G y
药物缓 释 剂囝 土壤 、 、 沙地 的蓄水 保水 剂 刚、 吸水剂  高
收稿 日期 : 0 9 0 — 7 20 — 5 2  

可 以降低 发酵 液 中底物 的浓 度及 发酵 液 粘度 ,提 高  菌 体对 氧 和 营养成 分 的利 用 率,同时 又可 以解 除底 

基金项 目 : 黑龙 江省科技厅 十一 五重大科技攻关项 ( 0 G 6 7 o ) 2 6 0 8 一 o。 0   作者 简介 : 党建 宁 (9 5 )男 , 1 8 -, 宁夏人 , 士研究生, 硕 主要从事微生物学和发酵工程方 向的研究工作。  

第4 5卷 ( 第 1 2期 ) 飓 5  

党 建 宁 等 : 多 聚 谷 氨 酸 摇 瓶 补 料 分 批 发 酵 的研 究   一

4  3

物 抑制 , 产物 反馈 抑 制 和葡 萄糖 分解 阻遏 效应 , 而  从

长 良好 ,后期 补 糖 主要 维持 一 定 菌浓 强制 其 最 大 限  度地 转化 为 目的代谢 产 物 。基 于此 , 了不 同初糖  考查 浓 度 对 摇 瓶 补 料 分 批 发 酵 的 影 响 。 维 持 总 糖 浓 度 

更 有利 于 目的 产物 的 生成 ,达到 较 大 幅度 提 高产 量  的 目的。 因此 , 本文 对 不 同补 料 分批 发酵 方式 对 聚谷  氨 酸产量 的影 响进行 了研 究 。  
1 材 料 与 方 法  11 菌 种  .  

6 g , 酵2 h , 加剩 余 葡萄 糖, 酵4h 测定  4/ 在发 L 4后 补 发 8后
各 个摇 瓶 的 一 G 产 量, PA 结果 如 图l 示 。从 表 1 所 中可  以看 到, 持初 糖 浓度 在 2 g E 合 适, 维 0/ 较 L ̄ 太高 和 太低  都 不利 于发 酵产  P A。 一G  
表 1 初 糖 浓 度 对 y P 产 量 的影 响    - GA
Ta . T eif e c  fiia lc s  o c nrt no  h  il fy GA  b1 h   l n e o  t l u o ec n e tai   nteyedo  —P nu ni g o

菌株 枯 草 芽孢 杆菌 (a iu u ti B 1 5( B cl ssbis - 1 ) l l  从 
日本 纳豆 中分 离得 到) 。   哈尔 滨商业 大 学发 酵工 程 实验 室保 藏 。   1 培 养基及 培 养条 件  . 2 1 . 斜 面培养 基 : .1 2  

初糖 浓度 总糖 补料时间 初始装液量 补料量  ̄ P A的产量 发酵液粘度  /C -
|   i   /   mL / mL |   / as mP .  

蛋 白胨 1  ,牛 肉膏3 , N C5 / 0 gl a 1g1 , ,琼/ 2 g , J O/   ̄ 1
p . 7 。将现 有斜 面 菌种 活化 ,7 H72 . —4 3 ℃培养2 h  4。 1 . 种子 培养 基 : .2 2   斜 面培 养基  ̄ 2 / %葡萄糖 , 加 琼脂 。种 子 培养 : 1 不  

2 0 三 角瓶 装 液量 5 mL 温 度3 ℃ , 5 mL 0 , 7 转速 10/ i , 5 r n  m
置 于摇 床 上培 养2 h  4。
注 释 : 于 玉米 糖 化 液 是 由 玉米 经过 液 化 酶 和 糖 化 酶 处 理过  由

1 . 基 础发 酵 培养 基【 : .3 2    】

的 , 理后 玉 米糖 化 液 中还 原 糖 的 浓 度 为2 g L 发 酵后 期 保  处 4/。
持 还 原 糖 终 浓 度 为6 g L 总 装 液 量 为 5   i 补 料 总 体 积 为 4/ , 0nl,   1 mL, 种 量 为2 。用 玉 米 糖 化 液补 料 , 足 的 部 分 用 无 菌  l 接 mL 不
水补足。  

玉米 糖 化 液 中还 原 糖6 gL 4 / ,谷 氨酸 钠25 gl  .4 , e 蛋 白胨6 g , H20  5/ , S 4 . /, a l . L  . / K P 4 . L Mg O 4 L C C2 3 , 7L 0g 2g 0g
氯 化 钠 IsL 硫 酸 锰 01/ , 瓶 培 养 : 种 量 2 , O/, . L摇 s 接 %  2 0 三角 瓶 装 液量 为5 m 5 mL 0 L,转 速 10/ n 5r mi,温 度 
3 ℃, 养4 h  7 培 8。
1 . 分 析 方 法  3

21 不 同 的对补 糖方 式对 ^ P A 量 的影响  .. 2 y G 产 — 保持 玉米 糖化 液 的终浓 度 为6 gL 初 始糖 化液  4/ ,

的浓 度 为2 gL 0 。实 验考 察 了在不 同 的时 间进行 补  C
加玉 米糖 化液 和补 糖 次数 。从表 2 可看 出 , 在五 种补  糖 方式 中 , 最好 , 在发 酵 1h 2 h 3 h 以E 及 2 、4 、6 补加 糖 比 

1. p . 1 H的测定 : p . ̄ .精密 p 3  用 H6 8 4 0 H试纸 测定  1 . 残 糖测 定 : _2 3 采用 直 接滴 定法 【 l 2 】  

1 . 粘 度 的测 定 : 用数 字 式 粘度 计 测 定 ,5 .3 3 采 2 ℃时 
二号 转子 测定 。   1. .4 — C 3   P A的分 离 纯化 【1: 酵 液与 8 0 r n 14 发 3J _ 0 0/ 离  mi

其 他几 种 补糖 发酵 效果好 。可能 的原 因是 菌体 在低  浓 度糖 存在 的条 件 下 , 对菌 体 生长 的抑制 是最 小 。 糖  
菌 体能 够快 速进 入对 数 生长期 。方 式A由 于在发 酵 

心 1 mi。取上 清液 用4 体积 的无 水 乙醇冰 箱 沉淀  5 n 倍
过 夜 , 10 0 m n 在 0 0 d i下离 心 收集 沉淀 。用蒸 馏 水 反复  透 析 。透析 液冷 冻 干燥 得到 纯 品。  
2 结 果 与 讨 论 

1h 2 后补 糖, 浓 度抑 制菌 体进 入对 数生 长期 。B   高糖 、
C 式在 相 比较A 后补 料 时 间发 酵产  P A的量  方 滞 一G

增加 , 明此 时有 一部 分 的糖 已经被 利 用糖 浓度 下  说 降 , 于菌 体 的生 长 。方式 D 两次 补料 , 利 分 效果 明显 
好 于前 三种方 式 , 菌体 很快 进 入对数 生 长期 , 糖对 菌 

21 碳 源对^ P A产 量 的影响  . y G —

21 初 糖 浓度 对  P A产量 的影 响  .. 1 一G 通过 单 因素试 验 , 证 了玉 米糖 化 液 、 溶性 玉  验 可

体生 长抑 制现 象不 明显 , 是仍 存在 抑制 。 但  
22 氮 源对  P A产量 的影 响  . 一 G

米 淀粉 、 萄糖 、 糖 、 芽糖 作 为碳 源 进 行 最 适 碳  葡 蔗 麦 筛 选 发 现 玉米 糖 化 液 为B 15 一 1 最适 合 的碳 源 。玉 米  糖 化 液 的 主要 成 分 为还 原 糖 葡萄 糖,其 浓度 的不 同  对 发 酵产  P A 响很 大 。葡萄 糖 浓度 过高 会 产 生  一G 影

221 初 始氮 源浓 度对  P A 量 的影 响  .. 一G 产 通 过 单 因素试 验 , 验证 了硫 酸铵 、 氯化 铵 、 酵母  膏 、种 无 机和 有机 的氮 源进 行最 佳 氮源 的筛选 。蛋  4 白胨 为B 1 5 一 1 最适 合 的氮 源 。在发 酵工 艺上 高 的氮  源 浓度 同样 具 有对 菌体 产生 抑制 作用 本 实验考 察 了 
终 氮源 浓度 在67 / , 始氮 源浓 度不 同 , . L初 g 在发 酵2 h 4 

底 物 抑 制作 用 , 响菌 体 的 生 长, 而 影 响 发 酵产    影 进 一
P A。因此 , G 在发 酵 生产 上, 常采用 低糖 流 加工 艺来  经 减 少这 种 负面 作用 。一 般, 一定 浓 度 的初糖 使 菌体 生 

后 一次 补 加剩余 的氮 源 。对 产 ̄ P A的影 响 。表3 / G -  

4  4

食 品 与 发 酵 科 技 

2o 年】 4期 o9 -   |

注 释 :一 ” 示 不 添 加 物 质  “ 表

可 以看 出初始 氮源 浓度 在3gL - G  ,时  P A的产 量最 

222 不 同的补氮 方式对  P l产量 的影 响  .. 一G A

高 。从 图中可 以看 出在初 始 过高或 过低 的氮 源浓 度 
同样 对菌 体产 生抑 制作 用 。  
表3 初 始 氮 源 对 发 酵 产y- PGA的 影 响 
T b3 T e if e c  fn il io e  o reo  h  il  f -P a .  h   l n eo  ia  t g ns uc   nteyedo  nu it n r y GA 

保 持蛋 白胨 的终浓度 为67 , , . L 初始 蛋 白胨 的浓  g 度 为3 /。实验 考察 了在 不 同的时 间进行 补加蛋 白 gL  
胨 和补 糖蛋 白胨 次数 。从 表4 可看 出 , 五种补 糖方  在
式 中 , 最 好 , 在发 酵 1h 2 h 3 h 三次 补加 剩  以E 及 2 、4 、6 分

余 的蛋 白胨 , 种方式 比其他 几种 补蛋 白胨发 酵效  这
果 好 。可能 的原 因是 菌体在 低浓 度蛋 白胨存在 的条 

件 下 , 白胨对菌 体生 长 的抑 制是 最小 。菌体 能够  蛋
快 速 进入对 数生 长期 。  
23 前 体物谷 氨 酸钠 对  P A产量 的影响  . 一 G
表4 不 同的 补 氮 方式 对 补 料 分 批 发 酵 的 影 响发 酵 
T b4 a . Th   f e c  f iee tnt g ns p l n  to   nfdb thfr nain ei l n eo  f r n io e  u peme t nu d r meh do  e  ac  eme tt   o

231 初 始前 体物 谷 氨酸钠 浓 度对 ̄ P A产量 的影  .. / G -
响 

浓度 太大起 到 了抑制 作用 。本 实验 考察 的 主要 内容 
是在 不 同初始 前 体 物浓 度 在 发酵 2 h 完 全 补料 对  4后

多数 文献 认 为^ P A是 由微 生物通 过 谷 氨酸 聚  y G — 合酶 合成 的 , 氨酸 是其 合成 的前 体物 质 。 谷 由此考察  基 础 发酵培 养基 中不 同浓度 的谷氨 酸钠 对 菌株 合成 


发酵 产  P A的影 响 。从 图5 以看 出初 始浓度 为0 一G 可   发 酵 产2 h 次 完 全补 料 ,发 酵产 ^ P A的 产量 最  4一 y G — 高 。随着初 始 浓度 的提 高发 酵产- P A的量 在不 断  y G — 的降 低 ,可能 的原 因是 由于 高金 属离 子浓 度对 菌体  的生 长产 生 了抑制作 用 。   23 不 同 的前体物 谷氨 酸钠 浓度对 补糖 方式 对    .. 2 一
P A产量 的影 响  G

P A的影 响 。在基 本 发 酵培 养基 中添 加 谷氨 酸钠  G

对  P A的合成 是 完全 必要 的 ,在 没有 添 加谷 氨酸  一G 钠 的培 养基 中 , P A含量 为0; 添加 谷 氨 酸对     一 G 而 一 P A的合 成 具 有 明 显 的 促 进 作 用 ,添 加 量 越 多 一 G   P A 成 越 多 ,最终 添 加 到25 gL 一 G 产 量最  G 合 .4 /时  P A

保持 初始 前体 物浓 度为0 总浓度 为25 gL 实验  . e。 4 考察 了在 不 同的补料 方式 对产  P A的影 响。由表 6 一G  

高。 继续 增加 产量 降低 , 氨酸 钠量 对菌 体 和^ P A 谷 y G  —

第4 5寒 ( 带 12霸 ) 慧 5  

党 建 宁等 :一 聚谷 氨酸 摇 瓶 补 料 分 批 发 酵 的 研 究   多

4  5

表 5 初 始前 体 物 谷氨 酸 钠 浓 度 对 y P A产 量 的 影 响  —G
T b5 h   f e c  fn il rc r r o i gu maec n e t t n a.  T e i l n eo  R   e us   du l a t o c nr i   nu i ap o s m  t   ao

为0 。其 它组 分 按 照基 础 发 酵 培养 基 配 方 。于 发 酵  1h 2 h 3 h 进 行全 组分 补 料 , 2 、4 、 6 后 每次 补料 体积 分 别  是36 rL . I 。结果 如 图7 7l 所示 。由图1 得, 分批 补  可 采用 料方 式 可 使  P A 量大 幅度 提 高 ,分批 补 料 发 酵  —G 产 方式 的 一 G P A产量 7 . gL较分 批 发 酵 方式 的鸟 苷  65 / , 6
产量5 .l/ ̄ 高 了4 . 质 量分 数 )  3 gL S 31 %( 。
3 小结 

黧 h   L   萎。 度   m  曩 发    ,初 m g    问L f L   产
0   25   .4 2  4 4  5 5   7 .2 01   24 . 5 68  

通 过 试验确 定 了 , -   产^ P A B 1 5 y G 最适 合 的初始  1 —
玉米糖 化 液浓度 在2 g 。最 适合 的初 始 氮源浓 度在  0/ L 可 知方式 E 果 最 明显 ,及在 发 酵 1h 2 h 3 h 三  效 2 、4 、6 分

3 g 。最适 合 的前体 物 谷氨 酸钠 浓度 为O O, l 。整个 发酵 
过 程 分 三 个 部 分 及在 1 h 2 h 3 h 进 行 补糖 、 氮  2 、4 、6 , 补

次进 行 补料 。我 们分 析 其原 因可能 是 在酵 初期 保 持 
低 的离 子浓度 有 助 于菌 体 的生 长 ,当 菌体进 入 对数 

源 、补 加前 体物 的发 酵效 果 最好 。在 较 低玉 米糖 化 

生长 期 的时候 分 阶段 补加 菌 体所 需要 的足够 的前体  物谷 氨酸 对产  P A由重要 的影 响作 用 。方式A、 、 一G B  C在发 酵 的不 同时 间 补加 全部 的 谷氨 酸钠 , 式C ; 方 效 

液、 氮源 、 前体物浓度条件下进行全组分补料。整个 
发 酵过 程分 三 个部 分及 在 1 h 2 h 3 h  ̄ P A的产  2 、4 、 6 ,- G /

量 达 到 7 .6/,较 分 批 发 酵 方 式 的 一 G 65 g L P A产 量 
5 .1/提 高 了4 .%( 35 gL 31 质量 分数 )  。
参 考文 献 :  
[】 Si   V n Y T?h   rd c o f oy - lt i 1 hhIL  a     T ePou tn o  l  Gua c i P m  

果 最 明显 ,说 明在 菌体 进 入对 数 生 长期 后在 补 加前 
体物 效果 更好 。   24 全 组分 补料 方 式对  P A产 量的 影响  . 一G 根 据 上述 结 果 ,同时考 虑  P A生 产 过程 中长  一G

A i) rm Mi orai  n  t V r u  p l ao s . c f   c og s a dI  ai sA p ctn 田   d o r n m s o ii
Boeo reT c n lg , 0 1 7 : 0 - 2   ir s u   e h oo y 2 0 , 9 2 7 2 5 e

菌 期及 产  P A所 需 营养 物质 的 不 同 以及 考 虑培 养  一G 基 中合理 的碳 氮 比,经 多 次试 验 研究 确 定 了最 佳 的 
流 加方 式 。 方式 为 : 该 初始 玉 米糖 化液 浓度 为2 g , 0/   L

[  Km    ,Km   L G aa     ? otl d rl s  2 ] i K S i T I  rhm N B C n ie  e ae rl e
b fbo fpo rg  a e   nte bo e rd bep l  ~ ea iro r u sb s d o  h   id ga a l  oy d  

初 始 蛋 白胨 浓 度 为3/, 始 前 体物 谷 氨 酸钠 浓 度  gt ,初

s t i  c )irshrs 册 ?oy rJun l 9 9 1 l a c ai m c p ee um d e P l  ora 19 , : me , 3 
8 3 81   1- 6

[】 C o   ’ uik  Pe aao  odt n  ds eig 3   h i J K noaM. rp rt ncn iosa  w ln  H i i n l
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pc t e n  t atu o fcc 叨 ? l   acrR s ala ladi  i ix sn t re i y m a Ci C e  e, n n   2 0 ,6 : 89 28 4 0 01 )  2 -  3  2
分 批 发 酵  补 料 分 批 发 酵 

0 
r  t

l  

【 C i H J ag RK no aM ? rprt nc niosad 5 ] ho  ,n   ,u i   Pe aa o  odt n  n    Y k i i
s eigeu ir  f yrgl rp rd w ln   ibi o hdoe p a   l ql a  e e ( 转 第5 页 ) 下 1  

图1 不 同 发 酵 方 式 的 比 较  F . h  o ai no dfrn fr nai 啊  T .1 ecmpr o f i e teme t o s f o t nmehd to  

表 6 不 同的 补 前 体 物 谷 氨 酸 钠 方 式 对 补 料 分 批 发 酵 的 影 响 
T .  T eIf ene o  rc ro u pe b a 6 h   l c   f e us r p lmen  to   nfd b thfr nai   nu p s tmeh d o  e  ac  eme tt on


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【摘要】 本文在茯苓摇瓶液体发酵条件 研究 的基础上,进一步探讨了茯苓的摇瓶补 料培养液体发酵和发酵罐补料液体发酵的发酵工艺。 新发酵工艺缩短了茯苓液体发酵的...
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