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分子荧光分光光度法实验技术


分子荧光分光光度计
化学化工学院 荆俊杰
2013-10-8

分子发光分析法
分子发光分析包括: 荧光分析(fluorescence analysis) 磷光分析(phosphorescence analysis) 化学发光分析(chemiluminescence analysis) 该类分析方法与吸收分光光度法有密切关 系。
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分子发光分析法
若分子吸收了光能而被激发支较高 能态,在返回基态时,发射出与吸收光 波长相等或不等的辐射,这种现象称为 光致发光,荧光分析和磷光分析是基于 这类光致发光现象而建交起来的分析方 法。

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分子发光分析法
该类分析方法与吸收分光光度法有密 切关系。 当物质分子吸收辐射能而被激 发到较高电子能态之后,在返回基态的过 程中,要释放出部分能量。

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一、荧光分析法
物质的基态分子受一激发光源的照 射,被激发至激发态后,在返回基态时, 发射出与吸收光波长相等或较长的荧光。 若物质分子用X射线或红外光激发,则分 别产生X射线荧光或外光荧光。

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一、荧光分析法
通常所指的分子荧光是指紫外-可见光 荧光,即利用某些物质受到紫外光照射后, 发射出比吸收的紫外光波长相等或更长的 紫外荧光或可见荧光,通过测定物质分子 产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光 分析。

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二、荧光分析法的应用
荧光分析可应用于物质的定性检测及 定量分析。由于物质结构不同,所能吸收 的紫外光波长不同,在返回基态时,所发 射的荧光波长也不同,利用这个性质可以 鉴别物质。对于同种物质的稀溶液,其产 生的荧光强度与浓度呈线性关系,利用这 个性质可进行定量分析。

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二、荧光分析法的应用
荧光法主要应用在医学检验、生物医 学、药物、环境监测、食品分析等方面, 尤其对体内活性物质及药物代谢物的测定 更为重要。

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三、荧光分析法的特点
荧光法的主要特点: 1)灵敏度高,检出限为10-7-10-9g/ml,比 紫外可见分光光度法高10~1000倍。 2)荧光法的选择性强,能吸收光的物质并不 一定能产生荧光,且不同物质由于结构不同, 虽吸收同一波长,产生的荧光强度也不同。 3)它还有用样量少、操作简便等的优点。 荧光法的缺点是,由于许多物质不发射荧光, 因此使它的应用范围受到限制。
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四、荧光法的基本原理
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1)激发光谱和荧光光谱 2)激发光谱和荧光光谱的的形状及其 关系 3)物质的分子结构和荧光的关系 4)环境对荧光的影响

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1)激发光谱和荧光光谱
任何发射荧光的物质都具有两个特 征光谱,即发射光谱(excitation spectrum)和荧光光谱(fluorescence spectrum)。它们是荧光分析中定性和 定量的基础。 荧光物质的最大激发波长(λex)和 最大荧光波长(λem)是鉴别物质的根 据,也是定量测定时的最灵敏的条件。
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1)激发光谱和荧光光谱
激发光谱 : 如果将激发光的光源用单色器 分光,测定不同波长的激发光的照射下, 荧光最强处荧光强度的变化,以激发波长 (λ)为横坐标,荧光强度(IF)为纵坐标 作图,便可得到荧光物质的激发光谱。

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1)激发光谱和荧光光谱
荧光光谱 :固定激发光波长和强度,而让物 质发射的荧光通过单色器分光,以测定不 同波长的荧光强度。以荧光波长(λ)为横 坐标,荧光强度(IF)为纵坐标作 图,便 可得到荧光物质的荧光光谱。

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2)激发光谱和荧光光谱的的形状 及其关系
荧光物质的激发光谱和荧光光谱形状 相似。这是因为物质分子吸收了一定波长 的紫外光后,才能发射出荧光。吸收越多, 发射的荧光强度也越强。 一般把激发光谱看作是荧光物质的表 观吸收光谱。激发光谱和荧光光谱呈现大 致的镜像对称关系。
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3)物质的分子结构和荧光的关系
了解荧光和物质分子结构的关系,可 以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为 荧光物质或将荧光强度不大或选择性不高 的物质转化为荧光强度大及选择性高的荧 光物质,以提高分析的效果。

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3)物质的分子结构和荧光的关系
物质的分子结构与荧光的发生及荧光强 度的大小紧密相关。 分子产生荧光必须具备2个条件: (1)物质分子必须具有能吸收一定频率紫 外光的特定结构 (2)物质分子吸收了特征频率的辐射能之 后,必须具有较高的荧光效率。荧光效率大, 在相同的浓度下,荧光的发射强度也大。
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3)物质的分子结构和荧光的关系
1、具有共轭双键体系的分子。共轭程度越大, 分子的荧光效率越大。 2、具有刚性平面结构的分子。刚性的不饱和的 平面结构具有较高的荧光效率,分子刚性及共平 面性越大,荧光效率越高。 3、苯环上取代基的类型。给电子基团常使荧光 增强,吸电子基团及卤素会减弱甚至破坏荧光。

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4)环境对荧光的影响
分子所处的环境,如温度、溶剂、PH值等都 会影响分子结构和立体构像,从而影响荧光强度 。 (1)温度:一般说来,大多数荧光物质的溶液随 着温度的降低,荧光效率和荧光强度将增加;相 反,温度升高荧光效率将下降 。 (2)溶剂:同一种荧光物质溶于不同的溶剂,其 荧光光谱的位置和强度可能有明显的不同。一般 情况下,随着溶剂的极性增加,荧光强度将增强。

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4)环境对荧光的影响
( 3)溶剂PH值的影响,当荧光物质是弱酸或弱 碱时,溶剂PH值对荧光强度有较大影响。 (4)猝灭剂的影响,荧光猝灭是指荧光物质与 溶剂子或其他溶质分子相互作用,引起荧光强 度降低、消失或荧光强度与浓度不呈线性的关 系的现象。引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂 (quencher)。常见的猝灭剂有卤素离子、 重金属离子、氧分子、以及硝基化合物、重氮 化合物、羰基化合物等。
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五、荧光分光光度计的结构
发光源:采用高压氙灯。 试样池:荧光分析用的试样池需用低荧光 材料,常用石英池,形状为四面透光的 方形。 检测器:荧光的强度比较弱,因此要求检 测器有较高的灵敏度,常用光电倍增管。 单色器:采用光栅作为单色器。

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六、荧光的定量分析
1、荧光测定的线性范围一般在105~100μg/ml。当浓度较高时,吸光度 (A)〉0.05时,由于自猝灭和自吸收等 原因,荧光强度与浓度不呈线性关系,荧 光强度同浓度的线性关系将向浓度轴偏离, 发生负偏差。 2、与紫外-可见分光光度法相同,也可采用 标准曲线法和标准对照法。
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六、荧光的定量分析
3、测量条件的选择 选择线性范围:当荧光物质溶液的 吸光度A≤0.05时,荧光强度与浓度才 呈线性关系。 选择合适的激发光和荧光波长:一 般选择激发光谱中能产生最强荧光的入 射光波长作为激发光,荧光光谱选择最 强荧光的波长作为荧光测定的波长。
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七、荧光分光度计的性能
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可检测荧光、磷光及生物发光 扫描速度快,可达24000 nm/分,数据采 集速率达80次/秒 波长范围:190-1100 nm 光谱带宽:1.5、2.5、5、10和20 nm五档 切换 具有液体池和固体池,并具有自动控温设备。

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八、荧光分光度计的使用
1、开启计算机,键入用户名和密码,打开分光光 度计主机,运行Cary Eclipse软件。 2、按样品的测定要求进入相应的测定模块。 3、设定测定参数,按操作流程测试样品,测定结 果保存或打印。 4、测试完毕后,在系统指定的出口退出系统;先 关闭分光光度计主机电源,再关闭电脑,切断总 电源。 5、罩上仪器罩,打扫室内卫生,并在仪器使用登 记本上填写使用记录。

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操作软件包

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定性分析操作

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预扫描

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移除谱图

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定性扫描参数设置

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设置错误

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谱图存贮

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图谱格式-FBSW

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数据格式-CSV

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定量分析操作

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参数设置

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标准样品设置

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待测样品设置

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空白校零

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开始测定

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重新计算

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九、荧光光度计使用注意事项:
1、比色皿使用之前应清洗干净。若比色皿很脏, 清洗方法为:先将比色皿置于铬酸洗液中浸泡半 小时左右,再用蒸馏水洗净,凉干留用。 2、比色皿用完之后,应先用无水乙醇清洗,后再 用蒸馏水洗净,凉干后收于比色皿盒中。 3、定期清理仪器的比色部分,以保持仪器内部的 整洁和洁净。

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谢 谢!
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