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河北省海水池塘底质生物修复菌的分离筛选


《河北渔业》 2008 年第 11 期 ( 总第 179 期)                    ○ 环境与资源

河北省海水池塘底质生物修复菌的分离筛选
肖国华   赵振良   高晓田   杨金晓   赵春龙
( 河北省水产研究所 , 河北 秦皇岛 066600)

摘    要 为了修复对虾养殖池塘的养殖环境 ,

从昌黎 、 乐亭 、 黄骅等 3 地的对虾池塘中取底泥 , 共分离出
215 种细菌 ,通过其对对虾饵料和蛤蜊肉降解能力的测定 , 筛选出 9 株虾池有机污染降解菌 。这些菌株能以

对虾饵料作为生长的唯一碳源和氮源 ,并且对对虾的配合饵料和蛤蜊肉具有较强的降解能力 。通过 7 d 的培 养 ,有 4 株细菌对对虾的饵料的 COD 去除率约 70 % ,对蛤蜊肉的 COD 去除率超过 50 % ,其他 5 株细菌对对 虾饵料及蛤蜊肉的 COD 去除率也在 30 %以上 。结果表明 , 这些细菌能快速消除对虾池塘的有机污染 ,具有 修复虾池环境的潜力 。 关键词   有机质降解菌   生物修复   菌种筛选   虾池

   年代对虾工厂化育苗的成功 ,使我国的对 80 虾养殖业蓬勃发展 , 产量迅速跃居世界第一 。但 是随着对虾养殖业的发展 , 疾病的发生严重影响 了产业的发展 , 尤其从 90 年代开始 , 我国爆发了 严重的对虾流行病 , 导致我国的对虾产业迅速下 滑 。究其根本原因 , 疾病的发生与日益严重的有 机污染 ,败坏的水质和底质分不开[ 1 ] ; 袁有宪 [ 2 ] 等 研究表明 ,有机物与总氮污染是制约养殖业发展 的关键因素 。因此 , 研究对虾养殖环境中的有机 污染物的快速降解方法 、 修复和改善被破坏的养 殖环境 ,对保持对虾养殖业的可持续发展具有重 要的意义 。 生物修复技术[ 3 ] (Bioremediatio n) ,即通过微 生物降解有机物而消除污染和净化环境的过程 , 这种新兴的环境改善技术日益得到重视和应用 。 有机物的微生物降解技术是其基本组成部分 , 由 于细菌的生命周期短 ,繁殖速度快 ,因此降解有机 物的速度要比其他生物快的多 [ 4 - 5 ] 。在养殖实践 中 , 对虾养殖池面积很大 , 池底有机污染难以清 除 ,对其进行的生物修复多为原位生物修复 [ 6 ] ,即 不对污染物进行搬移和输送 , 通过增菌 、 筛选 、 驯 化的方法 ,将菌种投放到被污染的环境中进行的 生物修复成为原位生物修复 。 本研究采集了河北昌黎 、 、 乐亭 黄骅等 3 个主 要养虾地区多年养殖池塘的底泥 , 通过富集 、 驯 化 ,分离筛选出了多株适应虾池环境的有机污染 降解菌 ,以期通过这些能适应本环境的土著菌 ,改

善我省的虾池环境 ,促进对虾养殖业的健康发展 。

1  材料与方法
1. 1   培养基 1. 1. 1   分离培养基   采用 P Y - SW 配方 [ 7 ] : 蛋

白胨 10 g ,酵母膏 0. 5 g ,葡萄糖 0. 5 g ,可溶性淀 粉 0. 5 g , FeSO4 ?7 H2 O 0. 01 g , Na2 H PO4
0. 01 g ,琼脂 20 g ,海水 1 000 mL ,p H 值 7. 5 。 1. 1. 2   活化及扩大菌种培养基   采用 2216 E 海

水培养基
1. 1. 3  选择性培养基  对虾饵料培养基 : 20 g

对虾饵料 ,1 000 mL 陈海水 , 浸泡过夜 , 滤去残 渣 ,补充 200 mL 蒸馏水 , 酵母膏 0. 5 g ,p H 值调 节至 7. 6 ,121 ℃ 高压蒸汽灭菌 20 min ,固体培养 基则加琼脂 。蛤蜊汤培养基 : 将蛤蜊去壳 ,捣碎 , 取 20 g 肉糜 ,加陈海水 1 000 mL ,煮沸 ,过滤 ,补 充蒸馏水至 1 000 mL ,调节 p H 值至 7. 6 ,121 ℃ 高压蒸汽灭菌 20 min 。
1. 2   菌种的富集与分离

用无菌的器皿挖取底泥于灭菌的塑料袋内带 回实验室 ,将底泥置于塑料槽内 ,然后加入对虾饵 料及蛤蜊肉 , 上覆海水 , 培养一周后 , 再加入对虾 饵料 。富集 4 周以后 , 取出底泥 , 适当稀释 , 涂布 于 P Y - SW 培养基上 ,28 ℃ 培养 48 h ,连续划线 分离 ,将纯化的菌落采用液体保种和试管保种于
4 ℃ 冰箱中 。

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《河北渔业》 2008 年第 11 期 ( 总第 179 期)                    ○ 环境与资源
1. 3   有机物降解菌的筛选 1. 3. 1   试验菌株在选择性培养基上生长情况  

将保种的细菌用 2216 E 海水培养基分批活化 , 挑 取单菌落划线于固体饵料培养基上 ,28 ℃ 下培养 48 h 后 ,观察生长情况 。 1. 3. 2   试验菌株对对虾饵料及蛤蜊肉汤的降解 能力的测定   选择 48 h 在饵料固体培养基上明 显生长的菌株 ,取菌悬液 ,分别接种于液体的饵料 培养基和蛤蜊肉汤培养基上 , 接种体积约 0. 1 % , 培养液中细菌最终密度为 0. 01 个麦氏浊度 ,28 ℃ 培养 , 每隔 24 h 取样品一次 , 5 000 r/ min 离 心 ,碱性高锰酸钾法测定上清 COD , 连续测定 7 d。 1. 4   菌悬液制备方法 试验菌株菌悬液的制备采用以下方法 , 将保 存的菌株用 2216 E 海水培养基活化 48 h ,接种环 挑取单菌落于麦氏比浊管的灭菌生理盐水中 , 振 荡混匀 ,用比浊仪测定菌悬液的麦氏浊度 。

养、 驯化 , 共分离出 215 株细菌 , 其中昌黎分离出 73 株细菌 ( C 系列菌株 ) , 乐亭分离出 106 株细菌 ( L 系列菌株) ,黄骅分离出 36 株 ( H 系列菌株) 。
2. 2   有机质降解菌的初筛

分离的出的 215 株细菌 , 经过在饵料培养基 上 48 h 培养 ,发现有 65 株细菌有明显的生长迹 象 ,其中 32 株细菌生长较快 ,形成的菌落较大 ,说 明这些细菌能利用对虾饵料作为唯一的碳源和氮 源作为其生长所必需的营养 。 2. 3   试验菌株对对虾饵料和蛤蜊肉汤的降解能 力 在初步筛选中 ,有 32 株细菌在选择性培养基 上生长快 , 形成的菌落较大 。在初筛的基础上 , 进一步考察这 32 株细菌对对虾饵料和蛤蜊肉汤 的降解能力 ,其中 11 株细菌对对虾饵料和蛤蜊肉 汤具有较强的分解能力 ,结果见表 1 。通过 7 d 的 培养 ,有 4 株细菌对对虾的饵料 COD 的去除率约 70 % ,对蛤蜊肉 COD 的去除率超过 50 % , 其他 5 株细菌对对虾饵料及蛤蜊肉 COD 的去除率皆超 过 30 % 。

2  结果
2. 1   菌种的富集和分离

乐亭 、 、 昌黎 黄骅三地的虾池底泥经过富集培
表1  试验菌株对对虾饵料的降解 菌株 代号
H31 L51 L11 C32 L12 C30 H52 C21 L21 H51 L82 24 h 3. 2 ± 45 0. 5. 2 ± 61 1. 5. 6 ± 24 1. 25. 6 ± 43 2. 0 18. 5 ± 75 3. 26. 9 ± 69 5. 23. 9 ± 11 3. 28. 6 ± 90 2. 19. 2 ± 53 1. 28. 0 ± 84 1. 48 h 3. 2 ± 45 4. 15. 4 ± 61 3. 13. 9 ± 96 3. 27. 9 ± 25 3. 0 21. 1 ± 42 7. 41. 2 ± 63 1. 47. 8 ± 13 3. 30. 6 ± 80 5. 29. 2 ± 87 5. 37. 5 ± 11 3. 72 h 9. 4 ± 71 0. 33. 3 ± 52 4. 16. 7 ± 38 2. 27. 9 ± 25 3. 3. 2 ± 26 0. 31. 6 ± 41 7. 46. 2 ± 34 2. 47. 8 ± 98 6. 34. 7 ± 71 5. 29. 2 ± 87 5. 41. 9 ± 04 3. COD 去除率/ % 96 h 34. 4 ± 38 4. 41. 1 ± 61 3. 32. 8 ± 71 0. 32. 6 ± 32 3. 3. 3 ± 47 0. 47. 4 ± 34 7. 65. 4 ± 43 5. 63. 1 ± 04 3. 34. 7 ± 68 3. 50. 0 ± 67 5. 48. 3 ± 83 0. 120 h 34. 4 ± 38 4. 43. 6 ± 46 5. 36. 1 ± 96 3. 32. 6 ± 32 3. 3. 8 ± 21 1. 47. 4 ± 34 7. 71. 2 ± 76 2. 63. 1 ± 04 3. 46. 9 ± 37 1. 50. 0 ± 84 2. 59. 1 ± 04 3. 144 h 34. 4 ± 38 4. 46. 2 ± 61 3. 41. 7 ± 89 3. 32. 6 ± 32 3. 19. 4 ± 60 4. 52. 7 ± 42 7. 76. 9 ± 35 6. 69. 6 ± 15 6. 53. 1 ± 90 2. 58. 3 ± 59 3. 63. 4 ± 04 3. 168 h 34. 4 ± 38 4. 46. 2 ± 61 3. 44. 4 ± 54 3. 32. 6 ± 32 3. 19. 4 ± 60 4. 73. 7 ± 42 7. 76. 9 ± 356 69. 6 ± 15 6. 57. 2 ± 90 2. 60. 5 ± 84 8. 74. 1 ± 24 6.

3  讨论
生物修复作用是自然界中普遍存在的现象 , — 44 —

但是这个过程对环境的修复要慢的多 。人工养殖 条件下 , 养殖密度大 , 投饵量高 , 往往在池底形成 大量的残耳 ,而依靠水体的自我修复作用 ,短期内

《河北渔业》 2008 年第 11 期 ( 总第 179 期)                    ○ 环境与资源 很难消除有机污染 。这些有机物会在池底腐败 , 形成有毒物质 ,恶化水质环境 ,既影响鱼虾的健康 生长 ,又容易滋生病原 。在水体自净能力不足的 时候 ,通过投放大量生物修复菌能快速降解水体
菌株 代号
H31 L51 L11 C32 L12 C30 H52 C21 L21 H51 L82 24 h 6. 7 ± 21 1. 18. 4 ± 48 2. 25. 4 ± 78 4. 27. 8 ± 53 3. 3. 8 ± 31 0. 19. 2 ± 48 2. 22. 4 ± 69 3. 20. 1 ± 43 4. 20. 6 ± 19 3. 17. 0 ± 47 4. 39. 4 ± 11 3. 48 h 16. 7 ± 35 3. 32. 6 ± 78 4. 29. 8 ± 17 5. 29. 2 ± 67 3. 11. 5 ± 78 3. 29. 2 ± 83 4. 28. 7 ± 94 0. 30. 6 ± 81 3. 37. 5 ± 91 2. 37. 4 ± 92 1. 40. 6 ± 14 2. 72 h 15. 0 ± 47 0. 24. 5 ± 26 3. 35. 2 ± 83 4. 30. 6 ± 14 3. 17. 3 ± 64 0. 29. 2 ± 68 2. 34. 1 ± 58 5. 37. 5 ± 49 3. 37. 5 ± 82 7. 37. 4 ± 82 4. 40. 6 ± 14 2.

碳源 、 氮源污染物 ,改良水质环境 。生物修复技术 是从根本上解决环境污染的方法 , 也是未来健康 养殖的方向之一 。

表2  试验菌株对蛤蜊肉的降解 ( %)
COD 去除率/ % 96 h 16. 7 ± 25 0. 30. 6 ± 49 3. 35. 8 ± 19 5. 30. 6 ± 37 2. 17. 3 ± 64 0. 46. 2 ± 13 6. 34. 1 ± 48 3. 47. 9 ± 84 3. 41. 2 ± 17 3. 42. 2 ± 73 3. 50. 0 ± 18 6. 120 h 19. 3 ± 37 1. 36. 7 ± 78 3. 35. 8 ± 34 7. 38. 3 ± 49 1. 25. 0 ± 63 1. 53. 8 ± 36 7. 45. 7 ± 89 3. 51. 4 ± 93 1. 44. 8 ± 71 2. 59. 2 ± 27 6. 56. 3 ± 14 4. 144 h 20. 0 ± 39 1. 36. 7 ± 56 3. 35. 8 ± 52 4. 41. 7 ± 89 5. 25. 0 ± 63 1. 56. 2 ± 76 3. 49. 6 ± 41 5. 51. 4 ± 44 6. 48. 5 ± 92 2. 62. 6 ± 57 5. 56. 3 ± 14 4. 168 h 21. 7 ± 31 2. 36. 7 ± 15 4. 37. 2 ± 15 6. 41. 7 ± 73 0. 25. 0 ± 19 2. 65. 4 ± 71 5. 53. 5 ± 91 3. 56. 9 ± 38 7. 48. 5 ± 17 4. 68. 0 ± 15 7. 58. 1 ± 58 3.

   自然状态下 ,多种细菌共生在一起 ,依靠单纯 的分离 , 很难获得所需菌株 , 对样品进行富集 、 驯 化可以提高分离效率 。富集 、 驯化条件是优势菌 筛选的关键因素 , 定时定量投加低浓度的目标化 合物是较好的驯化方式
[8 - 9 ]

据 ,而 COD 是反应水体中有机物变化的重要指 标 ,故采用 COD 的去除率作为第二步筛选的指 标 。第二步筛选中 ,有 11 株菌对对虾饵料和蛤蜊 汤具有较强的降解能力 , 其中有 4 株细菌对有机 物的分解能力最强 , 经 7 d 培养对对虾的饵料的 去除 率 在 70 % 左 右 , 对 蛤 蜊 肉 的 去 除 率 超 过
50 % ; 还有 5 株菌对对虾饵料和蛤蜊肉汤的去除

, 本研究通过定时定

量的添加对虾饲料和蛤蜊肉 , 营造了一个有机污 染的环境 ,抑制其他细菌的增值 ,使有机物降解菌 大量繁殖 ,使其成为优势菌 ,极大的增加了分离效 率。 本实验筛选指标及筛选方法的主要依据是 : 一种特定有机化合物降解菌的筛选通常该物质的 减少量为标准 [ 10 - 11 ] 。北方的对虾养殖池塘 ,大多 是土池 , 以投喂合成料为主 , 后期辅助投喂蛤蜊 、 泥螺等 ,池底的有机污染以残耳为主 ,所以本文初 次筛选以能否分解对虾的配合饵料为标准进行 , 初筛分离得到的 65 株细菌能在固体对虾饵料培 养基上明显的生长 , 说明这些菌株能利用对虾饵 料作为唯一的碳源和氮源进行生长 , 第二步筛选 主要考察这些菌株对对虾饵料及蛤蜊肉汤的降解 能力 ,本文以筛选消除虾池有机污染菌株为目标 , 对水中有机物消除能力的强弱作为筛选细菌的依

率超过 30 % ,达到了实验设计时的要求 , 因此最 后将这 9 株细菌作为目标菌 。在本文中 , 试验菌 株培养 7 d , COD 去除率达到最大 , 一些菌株的
COD 去除率达到 70 % 。而李秋芬 [ 12 ] 论文中 , 细

菌仅培养 3 d , COD 的去除率就达到 70 %左右 。 差异存在的原因 , 可能于接种密度和接种体积有 较大关系 ,接种密度较大 ,有些细菌的生长延滞期 会缩短 [ 13 ] ,营养液中的细菌密度很快达到最高 , 对液体中营养物质利用显然也要快的多 ; 相反 ,接 种密度小 ,则营养物质消耗慢 。本实验中可能由 于细菌接种密度较小 , 使细菌在 7 d 的培养当中 始终处于生长期 ,故培养 7 d 后有些菌株的 COD 去除率才达到 70 % 。 本文筛选的有机物降解菌 , 对对虾饵料和蛤 — 45 —

《河北渔业》 2008 年第 11 期 ( 总第 179 期)                    ○ 环境与资源 蜊肉有快速降解作用 ,具有修复虾池环境的潜力 。 这些菌株的生长环境条件试验及对虾安全试验尚 未进行 , 后续试验仍在进行中 。 生物修复技术在 我国水产业获得了一些进展 , 一些商品化的微生 态制剂已经获得了实际的应用 , 亦取得了一定的 效果 。现有的商品化的微生态制剂也有不足之 处 ,如要每隔一段时间就需在虾池中进行重新投 放 ,这些菌株不能长久的存在 。本试验筛选了一 些能快速降解虾池有机污染土著的生物修复菌 株 ,希望这些菌株在投入到虾池中 ,能持续的发挥 其生物修复作用 ,既能改良水质 ,又能减小养殖者 的经济投入 ,这些菌株在池塘中的修复作用需要 进一步验证 。 参 考 文 献
Challenges [ J ] . Environ Sct techonl , 1991 , 25 ( 10 ) : 1663 1672 [ 5 ] To mas A E. The basics of bioremediation [J ] . pullution Engi2 neering ,1992 ,26 (6) :46 - 47 [ 6 ] Zhang J Y ,Li J , Xia WL ,Deng NS. Bioremedation researches. chin J appl Environ Biol . 1996 ,2 (2) :193 - 199 [ 7 ] Samuelsson MO Kirchman DL Degradation of adiorbed proten by attached bacteria in relationship to suiface bydrop hobicit y. Appl Environ Microbiol ,1990. 56 (12) :3643 - 3648 [ 8 ]John HL et al Biodegradation of bisp henol A and ot her bisp he2 crobiol ,1992 ,58 (6) :1823 - 1831 [ 9 ] Pritchard. U se of inocnlation in bioremediation Curr opin bio2 technol . 1992 (3) :232 - 243 [ 10 ]Belly R T et al . Degradation of et hylene diamine tet ra aetic acid by microbiol pop ulations f ro m an aerated lagoon Appl microbial ,1975. 29 (6) :787 - 794 [ 11 ] Shields MS ,Reagin MJ . Selection of a Pseudo monas cepacio [ 1 ]Li Q F , Yuan YX. Outloo k for bioremediatiom researches on marine aquacult ure environment [J ] Fish Sci China , 2000 , 7 (2) :90 - 92 [ 2 ] 袁有宪 ,李秋芬 , 邹玉霞 , 等 . 海水养殖环境生物修复技术 . 99 st rain constit utive for degradation of t richloroet hylene appl Environ Microbiol ,1993 ,58 (3) :3977 - 3983 [ 12 ] 李秋芬 ,曲克明 , 辛福言 , 等 . 虾池环境生物修复作用菌的分 [ 13 ] 周德庆 . 微生物学教程 [ M ] . 北京 : 高等教育出版社 ,2002 nols by a gram - negative aerobic bacterium Apll Environ Mi2

离与筛选 . 应用与环境生物学报 ,2001 ,7 (3) :281 - 285

海洋高新技术发展研讨会论文集 ,2000. 448 - 454
[ 3 ] 吴启堂 . 环境生物修复技术 [ M ] . 北京 : 化学工业出版社 ,2007 [ 4 ] Madsen EL . Deternuming in sit u biodegradation Fact s and

Bacteria f or Bioremediation of marine Pond bottom in Hebei Province :Isolation and Selection
( Fisheries Research Instit ute of Hebei Province , Hebei Qinhuagdao 066000)

Xiao Guo hua  Zhao Zhenliang  Gao Xiaotian  Yang jinxiao  Zhao chunlo ng

Abstract  For bioremediatio n of shimp cult ure enviro nment , 215 bacteria st rains was islolated uring t heir abilit y to degrade shimp feed , 9 f unctio nal bacteria were o btained , which co uld utilize

f ro m mud of shimp po nds in Changli co unt y and Laoting co unt y and Huanghua co unt y. Tho ugh meas2 shimp feed as t he sole so urce of carbo n and nit rogen , t he capatable of degrading artificial shimp feed and clam meat is bet ter. Afer cult uring seven days ,t he COD removing rate of fo ur bacteria st rains is aro und 70 % for artifical shimp feed ,and t he COD removing rate is over 50 % for clam meat . The COD removing rate of t he ot her t here bacteria st rains is over 30 %. The result s show t hat t he nine f unctio nal bacteria st rains selected f ro m shimp po nds can rapidly eliminate organic pollutant s in sediment of shimp po nds , po ssessing potedtialit y in bioremediatio n of shiimp cult ure enviro nment . Key words   Degradatio n of organic mat ter   Bjioremedlatio n   Bacteria Screening  Shrimp Po nds
( 收稿日期 :2008 - 08 - 05)

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