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人教版教学课件[名校联盟]山东省沂水一中高二生物《12 基因工程的基本操作程序》课件(选修三)


温故知新: 1、基因工程至少需要哪三种工具? 2、这三种工具分别起什么作用?

1.2 基因工程的基本操作程序

问题1

基因工程的基本操作程序主要 包括哪几个步骤?

1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建

3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定

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一:目的基因的获取
什么是目的基因
编码蛋白质的基 1.目的基因主要是指___________________ 因 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,还有植 物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子贮 藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因、干扰 素基因等。

2、也可以是具有调控作用的因子

获取目的基因的常用方法有哪些?
1、从基因文库获取目的基因 未知序列
2、利用PCR技术扩增目的基因

已知序列
3、人工合成目的基因

(一)从基因文库中获取目的基因
1.基因文库概念
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断, 导入到受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含 有这种生物的不同基因,称为基因文库

2.基因文库类型
基因组文库 (包含一种生物的所有基因) 部分基因文库 (包含一种生物的一部分基因)

基因组 文库与 部分基 因文库 的关系

怎样从基因文库中得到 我们所需的目的基因呢?
根据基因的核苷酸序列、基因的 功能、基因在染色体上的位置、基因 的转录产物mRNA、基因的表达产物 蛋白质等特性来获取目的基因。

4.cDNA文库的构建
提取某种生物的某器官 或特定发育时期的mRNA
反(逆)转录酶

反转录法: 以目的基因转录成 的信使RNA为模板,反转 录成互补的单链DNA,然 后在酶的作用下合成双 链DNA,从而获得所需的 基因。

单链DNA
DNA 聚合酶

双链cDNA片段
与载体 连接

重组载体
导入受体菌 中储存

cDNA文库

cDNA合成过程是:
第一步,反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA 互补的DNA单链,形成RNA-DNA杂交分子。

第二步,核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链 降解,使之变成单链的DNA。

第三步,以单链DNA为模板,在DNA聚合酶的作用 下合成另一条互补的DNA链,形成双链DNA分子。

问题2

为什么用生物发育某个时期的mRNA反转 录得的DNA只有这种生物的部分基因?
某个时期的发育是基因选择性表达的结果

总结
两种基因文库的主要区别如下表(课本P10) 文库类型 文库大小
基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间的基因交流

cDNA文库 小
无 无 部分基因 可以

基因组文库 大
有 有 全部基因 部分基因可以

(二)利用PCR技术扩增目的基因
多聚酶链式反应 1、概念:PCR全称为________________,是一项在生 特定DNA片段 体外 物____复制_____________的核酸合成技术 DNA复制 2、原理:__________ (目的基因) 模板 原料(脱氧核苷酸) DNA聚合酶(耐高温) 引物(一小段单链DNA) 温度控制

3、条件:

4、操作前提:一段已知目的基因的核苷酸序列, 以便合成引物。

5、扩增形式: 指数形式(2n)

6、结果
7、过程:

在短时间内大量扩增目的基因



a、变性(90℃-95℃):双链DNA模板在热作 单链DNA 氢键 用下,_____断裂,形成___________ b、复性(55℃-60℃):系统温度降低,引物与 双链 DNA模板结合,形成局部________。 c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,从 引物开始进行碱基互补配对,合成与 DNA链 模板互补的________。

(二)利用PCR技术扩增目的基因动画演示

(三)通过DNA合成仪直接合成目的基因
前提:基因比较小、核苷酸序列已知
蛋白质 推测 mRNA 推测 基因DNA 合成 核苷酸 的核苷酸 的氨基 序列 序列 酸顺序 目的 基因

DNA合成仪

问题4

获取目的基因的三种方法应用

1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列,而 PCR技术扩增 且基因比较大,可采用____________ 2、如果知道目的基因的序列,而且基因比较 化学方法人工合成 小,可采用________________ 3、如果不知道目的基因的核苷酸序列,可采 从基因文库获取的方法 用_________________

二:基因表达载体的构建——基因工程的核心

1 2

目的: 使目的基因在受体细胞中稳定存在,并 且可以遗传给下一代,同时使目的基因 能够表达和发挥作用。 组成: 目的基因+启动子+终止子 +标记基因等

启动子:位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断,RNA聚 合酶识别和结合的部位 终止子:位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断,能终 止mRNA的转录 标记基因:鉴别受体细胞中 是否含有目的基因,从而将 有目的基因的细胞筛选出来

3.基因表达载体的构建过程
质粒 DNA分子 同一种 限制酶处理

一个切口 两个黏性末端

两个切口 四个黏性末端 DNA连接酶

重组DNA分子(重组质粒)

跟踪训练

(2012年江苏无锡高二检测)如图为基

因表达载体的模式图,下列有关基因工程中载体

的说法错误的是( B ) A.基因工程的核心步骤是基因表达 载体构建 B.任何基因表达载体的构建都是一 样的,没有差别 C.图中启动子位于基因的首端,是 RNA聚合酶识别和结合的部位 D.抗生素抗性基因的作用是作为标 记基因,用于鉴别受体细胞中是 否导入了目的基因

三、将目的基因导入受体细胞

1 2 3

转化:
目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞 内维持稳定和表达的过程。

常用的受体细胞:
大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌 和动植物细胞等。

目的基因导入受体细胞的原理:
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。

4、目的基因导入受体细胞的方法
生物种类 植物细胞 动物细 胞 微生物细胞

农杆菌转化法 显微注 基因枪法 常用方法 射法 花粉通道法

Ca2+处理法

受体细胞 一般是体细胞 受精卵 一般原核细胞 为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞? 全能性受限制

(1)农杆菌转化法 ①农杆菌特点:易感染双子叶植物和裸子植

物,对大多数单子叶植物没有感染能力。
②原理:Ti质粒上的T---DNA可以转移到受

体细胞,并整合到受体细胞染色体的DNA上。

③过程: 三、目的基因导入受体细胞

构建基因表达载体

转入

农杆菌

导入

植物细胞

稳定维持和表达

(2)基因枪法:目的基因导入单子叶植物细胞 ①操作方法:利用压缩气体产生的动力 ,将 包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体 细胞中,使目的基因与其整合并表达的方法。 ② 钨粉粒子和金粉粒子,粒子的直径一般在 0.6~4um 。
③适用:单子叶植物

(3)花粉管通道法:将目的基因导入植物细胞 ①操作方法:在植物花受粉后,花粉形成花 粉管还末愈合前期,剪去柱头,然后,滴入 DNA(含的基因)使目的基因借助花粉管通 道进入受体细胞 ② 特点:十分简便经济。 ③例:转基因抗虫棉(我国)

(4)、将目的基因导入动物细胞 方法:显微注射法 目的基因表达载体提纯 显微注射 受精卵 取卵(受精卵) 新性状动物

(5)、将目的基因导入微生物细胞 ①微生物作受体细胞原因: 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少

②常用菌:大肠杆菌
③常用法:Ca2+处理获得感受态细胞

(改变细胞壁的通透性)
④过程:
Ca2+处理 大肠杆菌 感受态 细胞 表达载体 与感受态 细胞混合

感受态细胞 吸收DNA

问题3
从细胞器的功能上分析,若通过基因工程生产人
的糖蛋白,可以用大肠杆菌吗?

【提示】

不可以,糖蛋白上的糖链是在内质网

和高尔基体上加工完成的,而内质网和高尔基体

存在于真核细胞中,大肠杆菌是原核生物,细胞
中不含有这两种细胞器。

问题4
导入过程完成后,全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗?
真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少,且有 的会摄入载体-载体,目的基因-目的基因类型

问题5
目的基因进入受体细胞后,是否都能稳定 维持和表达?
不一定,需要检测

练习
采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基 因的做法正确的是 ( C ) ①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋 白的DNA序列,注射到棉受精卵中③将编码毒素 蛋白的DNA序列,与质粒重组,导人细菌,用该 细菌感染棉的体细胞,再进行组织培养④将编码 毒素蛋白的DNA序列,与细菌质粒重组,注射到 棉的子房并进入受精卵 A、①② B、②③ C、③④ D、①④

四、目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因

分子 水平

方法—— DNA分子杂交 ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质

方法—— 抗原抗体杂交

个体水平: 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等

(1)检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因 方法—— DNA分子杂交技术 基因探针:放射性同位素等标记的含有目的基 因DNA片段
探针 转基因生 物的DNA
15N 15N 14N 14N

变性 变性

(2)检测目的基因是否转录出了mRNA

方法—— 分子杂交技术

探针

15N 15N

变性

转基因生物 的mRNA

14N 14N

(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法——抗原-抗体杂交
Bt毒素蛋白

抗体
苏云金杆菌

组 织 培 养
脱 分 化

将Bt毒蛋白注 射小鼠体内

从小鼠血管抽出 血液分离出抗 Bt毒素的抗体

提 取

蛋白质

出现 杂交带

(4)除上述分子检测外,有时还需进行 个体生物学水平的鉴定:如抗性特性


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