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小麦胚凝集素的分离与纯化工艺


2011年第3期

现代面粉工业Modern

Flour Milling Industry

深度加工及综合利用

小麦胚凝集素的分离与纯化工艺
于小禾1黄卉卉2孙嘉文2吴定2
1.南京市粮油质量检测所南京21001 1 2.南京财经大学食品科学与工程学院南京210003

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摘要麦胚凝集素(WGA)是麦胚中一种具有生物学活性的蛋白质,将它从小麦麦胚中提取出来,能提高面粉生 产企业经济效益。利用壳聚糖作为吸附剂.建立了从小麦胚中提取、分离和纯化麦胚凝集素的尼龙布袋法生产工 艺;利用SDS凝胶电泳对纯化麦胚凝集素进行鉴定。结果显示,采用40%--45%的饱和硫酸铵制备粗WGA样品;粗 品麦胚凝集素溶液与布袋中壳聚糖的使用比例在3:1—1:1;壳聚糖吸附麦胚凝集素的时间为20h,电泳显示可获得 较纯化的麦胚凝集素样品。纯化的麦胚凝集素相对分子量为20412。 关键词麦胚凝集素壳聚糖分离与纯化 中图分类号:TS
210.9

文献标识码:A

文章编号:1674—5280(2011)03—0043—03

麦胚凝集素(wheat

Germ

Agglutinin,WGA)是可

WGA的手段。 1材料与方法 1)材料 麦胚:南京市海佳面粉有限公司; 壳聚糖:南京财经大学生物工程实验室制备; 新鲜羊血红细胞:江苏省疾病控制中心; 低分子量标准蛋白:中国科学院上海生物化学 研究所,分子量范围:17,500~67,000匹t条带; 2)试剂 考马斯亮蓝R一250,上海化学试剂站分装; 醋酸溶液:0.1 mol/L,分析纯; NaHCO,溶液:0.05 mol/L,分析纯; 盐酸溶液:0.02 mol/L,分析纯; KOH溶液:l mol/L,分析纯; 饱和度硫酸铵(30%~75%); Tris—HCI缓冲液:3 mol/L,pH7.8.分析纯; 尿素溶液:0.05 mol/L,pH7.8,用3 mol/L HCl缓冲液配制; 聚乙二醇:分析纯; 甲酸溶液:0.05 mol/L,分析纯。
Tris—

以专一地、可逆地与糖类结合的蛋白质0-4]。WGA是 能稳定地与存在于它的溶液中或细胞上的互补物结 合,且能被简单的解离,可作为分离、纯化和鉴定生 物分子的有效试剂。 小麦胚芽凝集素与脂肪细胞反应,有类似胰岛 素的作用,能激活葡萄糖氧化酶,降低人体血液中血 糖含量。在适当的条件下,WGA可显著地促进人血B 淋巴细胞体外合成和分泌免疫球蛋白(Ig),这种促进 作用的特点是:①局限于2~10 I^g/mL的剂量范围; ②被N一乙酰葡萄糖胺这种单糖去除,但是不被多种 其它单糖去除;③在早先加入WGA后12 d的培养 过程中,只在最初的72 h内有效;④在T细胞和B 细胞存在的情况下可检测到,但在仅有B细胞存在 的情况下不能检测到;⑤本质上多同型。不同剂量 的WGA可对人体B细胞的代谢产生促进和抑制两种 相反的作用[1-s3。WGA可诱导人外周血淋巴细胞的 DNA合成和细胞萎缩,但不能促进有丝分裂【-_习。 壳聚糖是由N一乙酞氨基葡萄糖为结构单元组 成的生物多糖。根据壳聚糖和WGA的性质,可以利用 壳聚糖亲和层析作为一种从粗WGA中分离纯化
收稿日期:201l-03—21

作者简介:于小禾(1966_),女,大学本科,工程师,研究方向粮油品质监控。

万方数据

深度加工及综合利用 3)仪器设备

现代面粉工业

2011年第3期

LDL-10实验冷冻干燥机:北京博医康实验仪器 有限公司;
UV一1

微量注射器加样液t0斗l至凝胶梳孔内;低分子量标 准蛋白质照说明书使用:蓝色溴酚蓝条带迁移至距 离凝胶板下端1 cm时,停止电泳,染色与脱色后测定 迁移率。以标准蛋白质相对分子量的对数对迁移率 作图,制备蛋白质分子量与迁移率关系的标准曲线。 ⑥壳聚糖用量对麦胚凝集素提取率的影响 麦胚凝集素溶液与尼龙袋中壳聚糖的使用比例 分别为10:l一1:1,测定麦胚凝集素提取相对率。 ⑦壳聚糖提取时间对麦胚凝集素提取率的 影响 将壳聚糖吸附麦胚凝集素时间分别控制在10~
24

102紫外可见分光光度计:上海天美实验

仪器有限公司; HH一4型电热恒温水浴锅:国华电器有限公司; DYY一8C型电泳仪:北京市六一仪器厂; CHS—S型数显气浴恒温振荡器:常州国华电器 有限公司。 4)麦胚壳聚糖分离纯化 ①酸水解壳聚糖处理 参考文献[41,并对其方法进行改良。
30

h,然后测定麦胚凝集素相对提取率。

g片状壳聚糖烘干后,磨成细粉用0.1 mol/L醋
mol/L

酸溶液浸泡,不断搅拌60 min后离心倾出液体,用蒸 馏水洗涤至中性。用0.05 NaHCO,溶液进行处
m01/L

2结果与讨论 1)饱和度硫酸铵浓度对凝集素活力影响 实验显示,在40%~45%饱和度硫酸铵浓度时, 用显微镜观察发现上清液中凝集素活力低,但WGA 粗品溶液中凝集素活力高;同时观察发现WGA粗品 溶液中凝集时间相对最快。实验发现,低于40%或 高于50%饱和度硫酸铵浓度时,制备的WGA粗品溶 液中凝集时间低于40%~45%饱和度硫酸铵制备的 凝集素(表1)。
表1饱和度硫酸铵浓度对凝集素活力影响

理。把上述处理好的壳聚糖放入约200 ml 0.02

盐酸溶液的烧杯中用恒温水浴加热至95℃。在不断搅 拌下恒温2 h盥酸溶液的浓度、加热温度、恒温时间均
应严格控制,以防止壳聚糖全部水解)。用1 mol/L
KOH

溶液调壳聚糖溶液的pH值为中性.离心倾出液体。蒸 馏水洗涤5遍后即可。 ②麦胚凝集素粗品分离 适量麦胚经30%~75%饱和度硫酸铵沉淀得 WGA粗品溶液。将该粗品进行冷冻干燥。 ③麦胚凝集素纯化
用0.05 mol/L尿素溶液(pH 7.8)溶解麦胚凝集

素粗品,在该液中放入一定量部分水解壳聚糖的尼 龙袋,振荡吸附一定时间,重复上述过程,最后溶液 洗涤两次,将尼龙袋放人聚乙二醇中进行浓缩。用
0.50

注:+++凝集程度98%~100%;++凝集程度75%~80%;+凝集程 度10%一15%。

mol/L甲酸溶液分三次提取尼龙袋内壳聚糖吸

2)壳聚糖用量对麦胚凝集素提取率的影响 结果显示,随着尼龙袋中壳聚糖使用增加,袋 外液体中凝集素活力不断降低,当粗品麦胚凝集 素溶液与尼龙袋中壳聚糖的使用比例在3:1~1:1 范围内,尼龙袋中壳聚糖吸附凝集素能力达到最 大值(表2)。
表2不同壳聚糖用量的麦胚凝集素相对得率
麦胚凝集素溶液与尼龙袋中壳聚糖的使用比例 指标

附的成分。提取液置透吸袋中用Tris—HCI缓冲液透 析、浓缩、冷冻干燥得纯品。上述操作应在4℃条件 下进行。 ④WGA凝集活性的测定 干燥的纯品麦胚滤集素用缓冲液溶解.用双倍

系列稀释法对新鲜羊血红细胞测定凝集涪陛161。
⑤SDS—PADE测定WGA纯度及相对分子质量 采用垂直板型SDS—PAGE不连续系统凝胶电 泳测定纯化后WGA的纯度和分子量。分离胶浓度 为12%,浓缩胶浓度为3%;供试WGA用2倍还原缓 冲液溶解0.50 mg/mL,沸水浴5 min后冷却至室温,用

相对得率

7.5

21.9

38.2

66.3

88.7

97.9

100

98.9

万方数据

20t1年第3瑚

十m}等m表*自¥}∞"离54mIz

深度加工夏综合利用

3l壳聚糖吸附麦胚凝集素时间 宴验显示.随着吸附时间的延长,壳聚糖吸附麦 胚凝集素得率不断增加,当吸附时间大于20 h后.壳 聚糖吸附麦胚凝集素得率的差异不显著(表3)。
采3不同吸附时间收获麦胚凝集素相对得章 壳g糖q附麦%%垫察时Ⅻh 指标 目"*率

为20412。

51酸水解壳聚糖的优点
根据WGA能专一地、可逆地与复合糖类中的非 还原端糖基,如N一乙酰氩基葡萄糖或寡糖.如壳二 糖、壳i糖结合的性质.可将大分子量的壳聚糖进行 部分水解。这些部分水解的壳聚糖较之等重量大分 子的壳聚糖增加了可供wG^结合的糖基.从而增加 r壳聚糖分子中结合WGA的部位,即壳聚糖作为 WGA专一信息载体的能力大大增强,使得部分水解 法处理的壳聚糖l'J'WGA的吸附颦明垃高于普通法

4)麦胚凝集索纯度及相对分子世 经过凝胶电泳显小本实验提取、纯化的盘胚凝 集索只有一条泳带,说明本文验制备的麦胚凝集素 有较高纯度(图1).

处理的壳聚糖因此得牢较高. 用醢水解壳聚糖时,盐酸溶液的浓度、加热 温度、恒温时间均威严格控制.以防止壳聚糖全
部水解。

采州40%一45%的硫酸铵制备粗WGA样品.经 过冷冻十燥后的粗品麦胚凝集紊溶液与布袋中壳 聚糖的使片j比例在3:l~1:1.壳聚糖吸附WGA的时 间为20 h.好过fb泳显示可获得较纯化的WGA样品。 纯化的WGA相对分子量为20412。 参考文献
I、3讣离纯化uGA,2标准蛋门 囤1纯化WGA及标准蛋自电泳图

…IIAN“K舯an.ZHUIJ“,ⅧH,Qu
U】ChincM:¨um““Biochemical
67—69

hiqln

Isolallon and

puddfieation offbeat目丌11 agglutlnin and analysis“18 pmperties

根据低分于量标准蛋白电津相对迁移率.绘制 标准曲线(蚓2)
4’

P}l岍…叫}“,2005,26(2).

【2】邓湘蔷,李新荣.高景燕麦E凝集素的分离纯化厦





8 7 6

其在亲和屡析十的作用【J】末南大学学报(§学版)2003,22
(3):157一160

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[4】荣先目,簿淑凤,孛嘉霖处理后壳聚楮对麦B凝集
紊得率的影响U1镕州E学院学报,1999 22(6):547~5,18

[51黑定.Ⅻ常盘.刘*聘小麦舾芽中绿健功能田子功
能々提取m赍&科学,2005.26(9):615—618 4
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1991

16j棘宣∞兜疫检测盎求【M]第2版北京:科学&版社.

图2标准曲线
2007

17]f棘*{物化学宴验技术IM】北京科学&膜牡

分离纯化的WGA的迁移率由0 901.番标准 曲线得m埘数值为4 31.所L:(WGA的相对分子量

18】邺一守.橱秀珍免疫自胞化学及其在生物学和E学
上脚应用『M1{衰:南京大学m版社.1990

万方数据

小麦胚凝集素的分离与纯化工艺
作者: 作者单位: 刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 于小禾, 黄卉卉, 孙嘉文, 吴定 于小禾(南京市粮油质量检测所,南京,210011), 黄卉卉,孙嘉文,吴定(南京财经大学食品科 学与工程学院,南京,210003) 现代面粉工业 MODERN FLOUR MILLING INDUSTRY 2011,25(3)

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