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农杆菌介导转化法


农杆菌介导转化法

转基因植物

一、植物转基因技术
? 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。 它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、 媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得

到整合和表达,并通过对转化植株的鉴定选择,
从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类

r />所需要的新品种或新物种。

目的基因的分离和克隆 克隆基因的鉴定与分析

待改良植物的预处理 受体细胞系统建立

目的基因载体构建
植物细胞的遗传转化 目的基因在受体细胞的整合与表达 转化细胞克隆的筛选 转基因植株的获得与分子鉴定

田间性状鉴定
育成转基因植物新品种

二、植物基因转化方法
(一)外源基因的间接转化法(载体介导法) 农杆菌介导法(双、单子叶植物) (二)外源基因的直接转化法 物理法诱导DNA直接转化: 基因枪法(单子叶植物 )、显微注射 化学诱导DNA直接转化: PEG(原生质体) (三)花粉管通道法介导基因转化(种质系统介导法)

植物基因转化方法的选择原则
1. 对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌介导转化,因 为农杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转 化系统,而且转化效率高,转化植株的遗传稳定性最 好。
2. 原生质体培养容易的植物应该选择直接转化法(PEG 法),因为其优点是既能获得高的转化率,又能克服 转基因植株嵌合体的难题。

3. 多胚珠植物可试用花粉管通道法(属种质系统介导), 因为涂抹在柱头上的外源DNA可以随着许多花粉管 进入子房,分别导入各卵细胞中,提高转化率。 4. 子房中有较大单胚珠的植物如核果类植物,宜试用微 注射法(属种质系统介导),因为将外源DNA直接 注入卵细胞的可能性较大。

5. 转化难度大的植物,即对农杆菌转化不敏感,原生质 体培养困难的植物,应采用基因枪法。

三、农杆菌介导转化法
(一)概述
迄今为止,应用于植物遗传转化的农杆菌主要有两
种:根癌农杆菌和发根农杆菌,属根瘤菌科,具鞭

毛,为革兰氏阴性。根癌农杆菌感染双子叶植物时,
可在被感染的伤口形成冠瘿瘤,诱导有关的质粒为Ti

质粒 。发根农杆菌感染植物时,可使植物在感染部
位产生众多的发状根,与此有关的是Ri质粒。

◆ 迄今为止,获得的200余种转基因植物中, 80%以上是利用根癌农杆菌转化系统产生 的,是目前研究最多、理论机理最清楚、 技术方法最成熟的基因转化途径。 ◆ 通过Ti质粒将 T-DNA导入植物基因组从 而转化植物细胞是自然界存在的一种天然 遗传工程。 ◆ 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转 移的常用方法。

它是利用根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌的Ri 质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成 肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并 插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的 遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非 必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获 得稳定的表达。

T-DNA区含选择标记基因+报告基因

报告基因 选择标记基因

遗传转化预备实验使用载体的T-DNA区
选择标记基因(npt-Ⅱ,hpt)确定选择用抗生素类型,报告基
因(gfp,gus)可以通过快速鉴定,迅速确定材料是否能够表达外源报 告基因,及其统计转化效率,获得最佳诱导因素的梯度,从而优化 目的基因的转化条件,之后进行目的基因转化。 gus基因的表达产物可以与化学试剂发生蓝色反应;gfp基因产物 直接在蓝光下或紫外光下发出绿色荧光。

(二)根癌农杆菌转化的策略

具体操作

挑单克隆 纯化农杆菌

液体振荡培养 28℃,180~200 rpm

收集细胞,去 除细菌培养基 的高盐浓度, 及抗生素

用液体MS 培养基重悬 细胞(减少 细菌培养基 对植物体伤 害)

将预培养 的外植体 放入菌液 中浸染

100rpm,30 min(侵 染时间待 定)

取出外植体 在无菌滤纸 上吸干菌液

共培养(共培 养时间、温 度待定)

转入选择培养基 进行选择培养

在含有选择压力 的培养基上诱导 细胞分化,形成 转化芽

诱导芽生长

生根培养,形 成转化植株 分子检测 形态检测…

(三)转基因植物的检测鉴定方法
1. 2. 3. 4. 5. 6. 报告基因的表达检测(瞬间表达) 转基因植物的PCR检测(初步鉴定) 外源基因整合的Southern杂交鉴定 外源基因转录的Northern杂交检测 外源基因表达蛋白的Western杂交检测 生物学鉴定

GFP

基 因 的 检 测

梧桐科,可可树

生物学鉴定
1. 表型鉴定 2. 稳定性鉴定 3. 最终鉴定 ? ? ? ? ? 抗病 抗虫 抗除草剂 花色改变 品质改良

表型鉴定
转双抗虫基因741 杨研究
有3个高抗株系可 导致舞毒蛾和杨扇 舟蛾等幼虫死亡率 达85%以上,对世 界检疫对象美国白 蛾具有100%的致 死率,并且还能抑 制存活昆虫幼虫的 发育。 表达Bt杀虫蛋白的转 基因植物

2008年11月1日闭幕 的东京国际花卉博览 会上,全球首批真正 的蓝玫瑰首次在公众 面前亮相。蓝玫瑰由 日本三得利公司澳大 利亚分支机构研究培 育。完成蓝玫瑰在自 然环境中的生长实验 和研究后,三得利公 司计划明年秋季把蓝 玫瑰推向市场,预计 市场规模可达数百亿 日元。


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