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发酵过程优化与控制(第五章、丙酮酸发酵)


主要内容: 主要内容: 一、丙酮酸发酵概述 二、营养条件对光滑球拟酵母WSH-IP12生产丙酮酸的 营养条件对光滑球拟酵母WSH-IP12生产丙酮酸的 WSH 影响 三、维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 四、丙酮酸分批发酵的供氧控制模型

第一节 丙酮酸发酵概述 一、发酵生产丙酮酸方法 包括两类方法:直接发酵法, 包括两类方法:直接发酵法,即微生物在生长过

程中 直接利用碳源积累丙酮酸;休止细胞法, 直接利用碳源积累丙酮酸;休止细胞法,即微生物细胞先 生长,再转化底物为丙酮酸。 生长,再转化底物为丙酮酸。 两种方法的区别:前者是利用微生物细胞的一系列酶 两种方法的区别: 完成由底物(如葡萄糖)生成丙酮酸的转化过程; 完成由底物(如葡萄糖)生成丙酮酸的转化过程;后者是 利用微生物中某一具有特定功能的酶完成由底物(如乳酸) 利用微生物中某一具有特定功能的酶完成由底物(如乳酸) 向丙酮酸的转化。 向丙酮酸的转化。 具体包括如下4种方法: 具体包括如下4种方法:

1、酵母直接发酵生产丙酮酸 、 常用的酵母有球拟酵母、嗜盐酵母、假丝酵母、得巴利酵 常用的酵母有球拟酵母、嗜盐酵母、假丝酵母、 母等,其中球拟酵母属菌株,特别是烟酸、硫胺素、 母等,其中球拟酵母属菌株,特别是烟酸、硫胺素、吡哆醇和 生物素4种维生素的营养缺陷型 生物素 种维生素的营养缺陷型T.glabrata IFO 0005是发酵法生 种维生素的营养缺陷型 是发酵法生 产丙酮酸的首选菌株。 产丙酮酸的首选菌株。
葡萄糖 乙醇 Ⅰ 硫胺素 Ⅰ:丙酮酸脱羧酶(PDC) Ⅱ:转氨酶(PT) Ⅲ:丙酮酸羧化酶(PC) Ⅳ:丙酮酸脱氢酶系(PDH) 丙酮酸 Ⅳ 乙酰辅酶A 乙酰辅酶 柠檬酸 TCA循环 循环 图5-1 光滑球拟酵母中丙酮酸代谢途径 Ⅲ 草酰乙酸 Ⅱ 吡哆醇 氨基酸 硫胺素 烟酸 生物素

嗜盐酵母能在含盐量高达80g/L的葡萄糖培养基中积 嗜盐酵母能在含盐量高达80g/L的葡萄糖培养基中积 80g/L 累丙酮酸,产率很低。但能以无机铵盐为唯一氮源。 累丙酮酸,产率很低。但能以无机铵盐为唯一氮源。 2、细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸 酵母菌积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物, 酵母菌积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物,而细菌 积累丙酮酸时所能利用的底物种类更多一些,如葡萄糖、 积累丙酮酸时所能利用的底物种类更多一些,如葡萄糖、 葡萄糖酸、丙二醇、丙酸等。由于产量低, 葡萄糖酸、丙二醇、丙酸等。由于产量低,目前还处于 实验室研究阶段。 实验室研究阶段。 细菌发酵生产丙酮酸时由于培养基的pH在7.0甚至更 细菌发酵生产丙酮酸时由于培养基的pH在7.0甚至更 pH 高的特点,有利于构建一个发酵法生产丙酮酸高的特点,有利于构建一个发酵法生产丙酮酸-酶法合成 色氨酸的耦合系统。 色氨酸的耦合系统。

3、休止细胞法生产丙酮酸: 培养时间可以显著缩短,但 、休止细胞法生产丙酮酸: 培养时间可以显著缩短, 操作比较烦琐,需要先培养细胞,再分离细胞,洗涤, 操作比较烦琐,需要先培养细胞,再分离细胞,洗涤,最后才 用于合成丙酮酸。 用于合成丙酮酸。 4、完整细胞/酶法生产丙酮酸: 还未见工业化成功的报道。 、完整细胞 酶法生产丙酮酸 还未见工业化成功的报道。 酶法生产丙酮酸: 二、发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题 通过分析文献报道,发现存在如下问题: 通过分析文献报道,发现存在如下问题: 1、大多数T.glabrata菌株均以聚蛋白胨或蛋白胨为氮源。 、大多数 菌株均以聚蛋白胨或蛋白胨为氮源。 菌株均以聚蛋白胨或蛋白胨为氮源 T.glabrata IFO 0005在只有聚蛋白胨而不添加维生素的种子培养 在只有聚蛋白胨而不添加维生素的种子培养 基上照样生长良好的实验结果表明聚蛋白胨中所含有的维生素 足以满足多重维生素营养缺陷型菌株的生长。 足以满足多重维生素营养缺陷型菌株的生长。在这种情况下分 析该菌株所不能合成的维生素在代谢途径中的作用显然无法得 出明确的结论,也不可能使丙酮酸产率达到很高的水平。 出明确的结论,也不可能使丙酮酸产率达到很高的水平。

2、由于培养基中四种维生素的水平直接影响PDC 、由于培养基中四种维生素的水平直接影响 )、PC( (丙酮酸脱羧酶)、 丙酮酸脱羧酶)、PHD(丙酮酸脱氢酶系)、 (丙 )、 (丙酮酸脱氢酶系)、 酮酸羧化酶) 酮酸羧化酶)和PT(转氨酶)的活性,仅仅通过单因素 (转氨酶)的活性, 实验很难分析出烟酸、硫胺素、 实验很难分析出烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素各自在丙 酮酸过量合成中的作用,也就谈不上合理优化策略的确定。 酮酸过量合成中的作用,也就谈不上合理优化策略的确定。 3、已有报道认为较高的溶氧有利于丙酮酸的积累, 、已有报道认为较高的溶氧有利于丙酮酸的积累, 但溶氧要高到什么程度, 但溶氧要高到什么程度,应当怎样控制等具体问题并没有 定论。此外,如果把生物素作为主要因素, 定论。此外,如果把生物素作为主要因素,溶氧作为次要 因素, 因素,这两种因素组合起来会对丙酮酸发酵过程产生什么 影响也未有报道。 影响也未有报道。

4、培养基优化是高产丙酮酸的基础。关于营养条件特别 、培养基优化是高产丙酮酸的基础。 种最主要的营养元素( 、 、 )的影响未有详尽报道。 是3种最主要的营养元素(C、H、P)的影响未有详尽报道。 种最主要的营养元素 如葡萄糖对菌体生长和产酸是否存在抑制? 如葡萄糖对菌体生长和产酸是否存在抑制?是否有可能先培 养细胞,待氮源耗尽后,细胞再转向大量积累丙酮酸? 养细胞,待氮源耗尽后,细胞再转向大量积累丙酮酸?无机 磷是EMP途径的必须元素,在丙酮酸生产中又起到什么样的 途径的必须元素, 磷是 途径的必须元素 作用? 作用? 从过程优化的观点出发, 从过程优化的观点出发,对丙酮酸这样一个特殊的代谢 中间体, 中间体,其优化方法应当是在透彻分析球拟酵母发酵生产丙 酮酸的生理学本质的基础上, 酮酸的生理学本质的基础上,采取一系列控制策略实现丙酮 酸的过量合成。 酸的过量合成。

第二节、营养条件对 第二节、营养条件对WSH-IP12生产丙酮酸的影响 生产丙酮酸的影响 具有代表性的丙酮酸高产菌株有两种: 具有代表性的丙酮酸高产菌株有两种:一种是带有多种 遗传标记的Torulopsis glabrata,另一种是能量代谢被削弱的 遗传标记的 Escherichia coli。 本节介绍营养条件对 T. glabrata WSH-IP12 。 发酵生产丙酮酸的影响。 发酵生产丙酮酸的影响。 一、酵母粉浓度对丙酮酸发酵的影响 酵母粉是一种常用的氮源和生长因子的来源, 酵母粉是一种常用的氮源和生长因子的来源,但“随着 发酵培养基中酵母粉浓度的增大, 发酵培养基中酵母粉浓度的增大,细胞干重不断增大而丙酮 酸产量却迅速降低” 酸产量却迅速降低”实验结果表明酵母粉不适合研究菌株发 酵生产丙酮酸( 酵生产丙酮酸(图5-2)。 )。

二、蛋白胨浓度对丙酮酸发酵的影响 实验结果(图5-3)表明:初始葡萄糖浓度为80g/L,当培养 实验结果( )表明:初始葡萄糖浓度为 , 基中蛋白胨浓度为15g/L时,丙酮酸产量较高,低于15g/L时,葡 时 丙酮酸产量较高,低于 基中蛋白胨浓度为 时 萄糖消耗速度较慢,细胞干重和丙酮酸产量也较低; 萄糖消耗速度较慢,细胞干重和丙酮酸产量也较低;而高于 15g/L时,丙酮酸产量明显下降。 时 丙酮酸产量明显下降。 三、豆饼水解液和无机氮源对丙酮酸发酵的影响 1、豆饼水解液对丙酮酸发酵的影响 、 实验结果( 实验结果(图5-4)表明:豆饼水解液浓度为 )表明:豆饼水解液浓度为5g/L时,发酵 时 液中丙酮酸产量较高,但低于蛋白胨。不过, 液中丙酮酸产量较高,但低于蛋白胨。不过,由于豆饼水解液来 源广、价格低,因而仍是一种有潜力的氮源。 源广、价格低,因而仍是一种有潜力的氮源。 2、无机氮源对丙酮酸发酵的影响 、 实验结果( 实验结果(表5-6)表明:产量不及蛋白胨和豆饼水解液。 )表明:产量不及蛋白胨和豆饼水解液。

四、分批培养中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵 的影响 1、供氧方式对丙酮酸发酵的影响 、 供氧方式对丙酮酸产率和产量有影响, 供氧方式对丙酮酸产率和产量有影响,相对较高的溶 氧有利于实验菌株发酵生产丙酮酸。 氧有利于实验菌株发酵生产丙酮酸。 2、培养基碳氮比的影响 、 小型发酵罐的实验结果表明:葡萄糖和蛋白胨的浓度按 小型发酵罐的实验结果表明 葡萄糖和蛋白胨的浓度按 的原则同时提高, 碳:氮=25:1的原则同时提高,丙酮酸的生产会得到促进; 氮 : 的原则同时提高 丙酮酸的生产会得到促进; 若蛋白胨浓度保持不变, 若蛋白胨浓度保持不变,在此基础上再提高葡萄糖浓度 增大),发酵后期( (即C:N增大),发酵后期(40h后)细胞生长速度和葡萄 增大),发酵后期 后 糖消耗速度明显下降,丙酮酸产率也显著降低。 糖消耗速度明显下降,丙酮酸产率也显著降低。

五、葡萄糖流加培养中氮的供给对丙酮酸发酵的影 响 摇瓶实验结果表明:流加培养能提高丙酮酸的生产 摇瓶实验结果表明: 水平。进一步的小型发酵罐流加培养实验结果表明: 水平。进一步的小型发酵罐流加培养实验结果表明:在 葡萄糖流加培养中, 葡萄糖流加培养中,为了获得高的丙酮酸产率和生产强 氮的有效供给(以维持适当的碳氮比)非常重要。 度,氮的有效供给(以维持适当的碳氮比)非常重要。 为了进一步提高丙酮酸的产量和产率, 为了进一步提高丙酮酸的产量和产率,用氨水代替 氮源并代替KOH控制发酵过程的 (相当于连续提供 控制发酵过程的pH( 氮源并代替 控制发酵过程的 氮源)进行流加培养实验, 氮源)进行流加培养实验,结果整个发酵过程中细胞均 表现出很强的丙酮酸合成能力。 表现出很强的丙酮酸合成能力。

第三节、 第三节、维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 以一株能以NH4Cl为唯一氮源生长和大量产酸的突变株 以一株能以 为唯一氮源生长和大量产酸的突变株 T.glabrata WSH-IP303为研究用菌株,进行维生素对丙酮酸积 为研究用菌株, 为研究用菌株 累影响的研究。 累影响的研究。 一、 T.glabrata WSH-IP303对氮源的同化能力 对氮源的同化能力 该菌株仍然为烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素4种维生素 该菌株仍然为烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素 种维生素 的营养缺陷型,但能在以NH4Cl、硫酸铵、磷酸氢二铵和尿素 的营养缺陷型,但能在以 、硫酸铵、 等为唯一氮源的培养基中非常好地生长, 等为唯一氮源的培养基中非常好地生长,随着无机氮浓度的 增加,菌株的生长略受抑制,但不是非常明显, 增加,菌株的生长略受抑制,但不是非常明显,蛋白胨不是 该菌株生产丙酮酸的最佳氮源。 该菌株生产丙酮酸的最佳氮源。 维生素对WSH-IP303过量合成丙酮酸的影响 二、维生素对 过量合成丙酮酸的影响 由于WSH-IP303能够以氯化铵为唯一氮源大量积累丙酮 由于 能够以氯化铵为唯一氮源大量积累丙酮 因而可在全合成培养基中对维生素的影响进行深入分析。 酸,因而可在全合成培养基中对维生素的影响进行深入分析。

单因素实验的结果表明: 培养基中若缺乏烟酸、硫胺素、 单因素实验的结果表明:①培养基中若缺乏烟酸、硫胺素、 吡哆醇和生物素中的任何一种,细胞生长均很弱, 吡哆醇和生物素中的任何一种,细胞生长均很弱,丙酮酸产量 也很低; 细胞生长不需要核黄素, 也很低;②细胞生长不需要核黄素,但添加适量的核黄素对丙 酮酸的生产有一定的促进作用; 细胞积累丙酮酸时, 酮酸的生产有一定的促进作用;③细胞积累丙酮酸时,对不同 维生素浓度变化的敏感程度不同。 维生素浓度变化的敏感程度不同。 正交实验的结果表明: 硫胺素是影响细胞生长、 正交实验的结果表明:①硫胺素是影响细胞生长、葡萄糖 消耗及丙酮酸合成的最重要因素; 增大吡哆醇、 消耗及丙酮酸合成的最重要因素;②增大吡哆醇、生物素和核 黄素的浓度,对细胞生长和葡萄糖消耗没有显著影响, 黄素的浓度,对细胞生长和葡萄糖消耗没有显著影响,但对丙 酮酸合成有一定的促进作用; 酮酸合成有一定的促进作用;③增大烟酸浓度可促进葡萄糖的 消耗,但不利于丙酮酸的合成。 消耗,但不利于丙酮酸的合成。 考虑到烟酸浓度增加有利于葡萄糖消耗而不利于丙酮酸的 积累,因此,在保持吡哆醇、 积累,因此,在保持吡哆醇、生物素和核黄素浓度不变的前提 下,进一步考察了烟酸和硫胺素的水平变化对丙酮酸合成的协 同作用。 同作用。

实验结果表明:培养基中硫胺素浓度为 实验结果表明:培养基中硫胺素浓度为0.01mg/L,烟酸浓 , 度为2mg/L时,丙酮酸产率虽然较高,但葡萄糖消耗速度却相 度为 时 丙酮酸产率虽然较高, 对较慢;将烟酸浓度提高到10mg/L时,葡萄糖消耗速度和丙酮 对较慢;将烟酸浓度提高到 时 酸产量分别增加了35%和29%,而丙酮酸产率仅下降了3.6%。 酸产量分别增加了 和 ,而丙酮酸产率仅下降了 。 当培养基中硫胺素浓度为0.02mg/L,烟酸浓度为 当培养基中硫胺素浓度为 ,烟酸浓度为8mg/L时,虽 时 然葡萄糖的消耗加速,但丙酮酸产量和产率明显下降。因此, 然葡萄糖的消耗加速,但丙酮酸产量和产率明显下降。因此, 细胞以葡萄糖为碳源积累丙酮酸时, 细胞以葡萄糖为碳源积累丙酮酸时,烟酸和硫胺素较优浓度的 确定,对维持丙酮酸合成与降解的平衡非常重要。 确定,对维持丙酮酸合成与降解的平衡非常重要。 三、维生素亚适量供应下的分批发酵过程 根据确定的较优维生素浓度组合, 烟酸8mg/L,硫胺 根据确定的较优维生素浓度组合,即:烟酸 , 素0.015mg/L,吡哆醇 ,吡哆醇0.4mg/L,生物素 ,生物素0.04mg/L,核黄素 , 0.1mg/L在小型发酵罐上进行分批发酵实验。 在小型发酵罐上进行分批发酵实验。 在小型发酵罐上进行分批发酵实验

实验结果表明:发酵前 实验结果表明:发酵前10h,DOT和乙醇浓度变化最为显 , 和乙醇浓度变化最为显 此时细胞生长较快,生长比速?在 范围内,此后? 著,此时细胞生长较快,生长比速 在0.2~0.3h-1范围内,此后 逐渐降低, 时降低到0.1h-1以下,36h后稳定在 以下, 后稳定在0.02 h-1的水 逐渐降低,24h时降低到 时降低到 后稳定在 平,且15h后细胞产率均低于 后细胞产率均低于0.2g/g。与之相应,12h后丙酮酸 。与之相应, 后丙酮酸 后细胞产率均低于 开始大量产生, 丙酮酸产率基本维持在0.6g/g以上,56h 以上, 开始大量产生,20~40h丙酮酸产率基本维持在 丙酮酸产率基本维持在 以上 丙酮酸产量和产率分别比摇瓶培养的最好结果提高了32%和 丙酮酸产量和产率分别比摇瓶培养的最好结果提高了 和 21%。 。 第四节、 第四节、丙酮酸分批发酵的供氧控制模式 由于丙酮酸位于EMP途径和 途径和TCA循环的交叉位置,溶氧水 循环的交叉位置, 由于丙酮酸位于 途径和 循环的交叉位置 平直接影响碳流的走向, 平直接影响碳流的走向,溶氧水平低会导致乙醇产量增加而丙 酮酸产量降低,较高的溶氧有利于丙酮酸的积累。 酮酸产量降低,较高的溶氧有利于丙酮酸的积累。本节将力图 阐明溶氧究竟要高到什么程度和如何控制等问题。 阐明溶氧究竟要高到什么程度和如何控制等问题。

一、丙酮酸分批发酵过程的溶氧变化情况 恒定的条件下考察了发酵过程中溶氧的变化特征。 在kLa恒定的条件下考察了发酵过程中溶氧的变化特征。 的结果表明: 图5-16的结果表明:在控制不同 La的发酵过程中,溶氧均表 的结果表明 在控制不同k 的发酵过程中, 现出相似的变化规律,即发酵初期(0~16h)菌体耗氧速率快 现出相似的变化规律,即发酵初期( ) 于供氧速率,表现为溶氧的迅速下降, 于供氧速率,表现为溶氧的迅速下降,16h后,耗氧速率和供 后 氧速率则基本保持平衡。但保持平衡状态时不同的k 氧速率则基本保持平衡。但保持平衡状态时不同的 La所维持 的溶氧水平却不同, 越高,维持的溶氧水平也越高。 的溶氧水平却不同, kLa越高,维持的溶氧水平也越高。 不同k 二、不同 La下WSH-IP303发酵生产丙酮酸的动力学特征 发酵生产丙酮酸的动力学特征 为不同k 图5-17[(a)~(c)]为不同 La下WSH-IP303发酵生产丙 ( ) ( ) 为不同 发酵生产丙 酮酸过程中细胞干重、葡萄糖浓度和丙酮酸浓度的变化曲线, 酮酸过程中细胞干重、葡萄糖浓度和丙酮酸浓度的变化曲线, 为不同k 图5-17[(d)~(f)]为不同 La下WSH-IP303发酵过程动力学 ( ) ( ) 为不同 发酵过程动力学 参数的变化曲线, 为不同k 参数的变化曲线,图5-18为不同 La下丙酮酸产率和细胞产率 为不同 的变化曲线。综合分析图5-17和图 和图5-18,可以发现: 的变化曲线。综合分析图 和图 ,可以发现:

),细胞在发酵前期 细胞在发酵前期( ①在较高的kLa下(450h-1),细胞在发酵前期(0~16h) 在较高的 ) 具有较高的?和 图 具有较高的 和qp[图5-17(d)和(f)]。整个过程中细胞消耗 ( ) )。 葡萄糖的速率虽然相对较低[图 葡萄糖的速率虽然相对较低 图5-17(b)和(f)] ,但能长时 ( ) ) 间维持合成丙酮酸的能力[图5-17(c)],且丙酮酸产率相当 间维持合成丙酮酸的能力 图 ( ), 细胞消耗葡萄糖的速率随着k 高 [图5-18(a)] ;②细胞消耗葡萄糖的速率随着 La的降低而 图 ( ) 增大[图 而丙酮酸产率则反之[图 增大 图5-17(b)和(e)] ,而丙酮酸产率则反之 图5-18 ( ) ) (a)] 。 ) 三、分阶段供氧控制模式的提出和实验验证 为了进一步解释不同k 下发酵过程的特点, 为了进一步解释不同 La下发酵过程的特点,表5-18给出 给出 了不同k 下发酵过程的主要参数。结合图5-17和图 和图5-18,可 了不同 La下发酵过程的主要参数。结合图 和图 , 以认为在发酵过程中维持恒定的k 很难实现高产量、 以认为在发酵过程中维持恒定的 La,很难实现高产量、高产 率和高生产强度的统一。 率和高生产强度的统一。

给出了恒定k 表5-19给出了恒定 La下不同发酵阶段的碳平衡,在 给出了恒定 下不同发酵阶段的碳平衡, 0~16h,底物中的碳主要用于合成细胞,16h后碳流则转向丙 ,底物中的碳主要用于合成细胞, 后碳流则转向丙 酮酸的积累。鉴于: 丙酮酸分批发酵过程前期( 酮酸的积累。鉴于:①丙酮酸分批发酵过程前期(0~16h) ) 溶氧迅速下降( ),且控制较高的 溶氧迅速下降(图5-16),且控制较高的 La (450h-1)有利 ),且控制较高的k 于合成细胞( );② 后细胞耗氧速率基本恒定( 于合成细胞(表5-19);②16h后细胞耗氧速率基本恒定(图 ); 后细胞耗氧速率基本恒定 5-16),且降低 La 可明显提高细胞的丙酮酸合成速率(图5),且降低 ),且降低k 可明显提高细胞的丙酮酸合成速率( 17f),为了探讨是否存在能尽可能实现丙酮酸高产量、高产 ),为了探讨是否存在能尽可能实现丙酮酸高产量 ),为了探讨是否存在能尽可能实现丙酮酸高产量、 率和高生产强度统一的供氧控制模式,采用0~16h控制较高 率和高生产强度统一的供氧控制模式,采用 控制较高 ),16h后将 kLa 降低到 降低到200h-1的方法进行分批 的kLa (450h-1), 后将 发酵,主要过程参数见表5-18,发酵过程曲线和碳平衡分别 发酵,主要过程参数见表 , 见图5-19和表 和表5-20 。 见图 和表

由表5-18可知,采用分阶段供氧控制模式,既能够保持 可知,采用分阶段供氧控制模式, 由表 可知 较高的产率( ),又能够保持较高的耗糖速率 较高的产率(0.636g/g),又能够保持较高的耗糖速率 ), [1.95g/(L.h)],发酵 丙酮酸产量就达到了69.4g/L,生产强 ,发酵56h丙酮酸产量就达到了 丙酮酸产量就达到了 , 恒定为450h-1、300h-1和200h-1的分批 度[1.24g/(L.h)],比kLa恒定为 , 发酵过程分别提高了36%、23%和31%。 发酵过程分别提高了 、 和 。 比较发酵过程的碳平衡( 和表5-20)可以发现, 比较发酵过程的碳平衡(表5-19和表 和表 )可以发现, 恒定为200h-1的分批发酵过程相比,采用分阶段供氧控 的分批发酵过程相比, 与kLa恒定为 制模式, 制模式,16h后通往细胞合成和丙酮酸积累的碳流平均提高 后通往细胞合成和丙酮酸积累的碳流平均提高 左右。 了35%和20%左右。 和 左右 由此可见,采用分阶段供氧控制模式,能够兼顾高k 由此可见,采用分阶段供氧控制模式,能够兼顾高 La下 丙酮酸产率高和低k 下葡萄糖消耗速度快的优点, 丙酮酸产率高和低 La下葡萄糖消耗速度快的优点,从而实现 丙酮酸发酵过程高产量、高产率和高生产强度的相对统一。 丙酮酸发酵过程高产量、高产率和高生产强度的相对统一。

由前面的内容知道, 由前面的内容知道,维生素水平和溶氧水平影响丙酮酸 的积累。对于溶氧而言,在溶氧较低的情况下, 的积累。对于溶氧而言,在溶氧较低的情况下,胞内线粒体 发育不良,酵解产生的NADH不能通过呼吸链氧化,必须将 不能通过呼吸链氧化, 发育不良,酵解产生的 不能通过呼吸链氧化 氢传递给乙醛,形成乙醇以再生NAD+,才能保持酵解的继 氢传递给乙醛,形成乙醇以再生 续进行。大量乙醇的形成导致丙酮酸产率显著降低,因此, 续进行。大量乙醇的形成导致丙酮酸产率显著降低,因此, 保持发酵罐处于相对较高的溶氧水平, 保持发酵罐处于相对较高的溶氧水平,是实现丙酮酸高产率 的基础。 的基础。 培养基中的维生素水平,特别是硫胺素的浓度, 培养基中的维生素水平,特别是硫胺素的浓度,会影响 胞内负责丙酮酸降解的酶的活性, 胞内负责丙酮酸降解的酶的活性,因而是影响丙酮酸产率的 及其重要的因素。 及其重要的因素。 当细胞转入丙酮酸合成期以后, 当细胞转入丙酮酸合成期以后,如果假设丙酮酸的降解 途径被基本阻断,则酵解产生的NADH必须以适当的方式氧 途径被基本阻断,则酵解产生的 必须以适当的方式氧 化才能保证酵解的继续进行和丙酮酸的大量积累。 化才能保证酵解的继续进行和丙酮酸的大量积累。

导致细胞处于高溶氧状态,此时酵解产生的NADH 高kLa导致细胞处于高溶氧状态,此时酵解产生的 通过呼吸链产生大量的ATP,而酵解途径的限速酶 通过呼吸链产生大量的 ,而酵解途径的限速酶——磷酸 磷酸 果糖激酶受ATP的变构抑制,ATP水平的升高必然抑制磷酸 的变构抑制, 果糖激酶受 的变构抑制 水平的升高必然抑制磷酸 果糖激酶的活性,从而导致葡萄糖消耗速率的下降; 果糖激酶的活性,从而导致葡萄糖消耗速率的下降;而在较 细胞处于相对较低的溶氧状态, 低的 kLa下,细胞处于相对较低的溶氧状态,可能只有一部 通过呼吸链氧化, 分NADH通过呼吸链氧化,相对较低的 通过呼吸链氧化 相对较低的ATP水平使酵解得以 水平使酵解得以 快速进行。 快速进行。 由于PDC活性受限制,剩余的 活性受限制, 或生成乳酸、 由于 活性受限制 剩余的NADH或生成乳酸、或生 或生成乳酸 成甘油( ),才能实现 的再生。碳平衡( 成甘油(图5-20),才能实现 ),才能实现NAD+的再生。碳平衡(表5-19) ) 表明随着k 的降低,转向合成副产物的碳流确实增加。 表明随着 La的降低,转向合成副产物的碳流确实增加。

鉴于高k 有利于细胞生长而不利于葡萄糖的消耗的特点, 鉴于高 La有利于细胞生长而不利于葡萄糖的消耗的特点, 如果能够解除NADH与ATP的偶联,即细胞酵解产生的 的偶联, 如果能够解除 与 的偶联 即细胞酵解产生的NADH 在氧化和NAD+再生的同时,不产生 再生的同时,不产生ATP,其能量以热的形式 在氧化和 , 释放,就有可能在保证高产率的前提下, 释放,就有可能在保证高产率的前提下,实现高速酵解和丙 酮酸的快速积累。(调节细胞的能量水平, 。(调节细胞的能量水平 酮酸的快速积累。(调节细胞的能量水平,改变某些关键途 径的活性) 径的活性)

发酵过程优化原理复习思考题 1、发酵过程优化的目标 、 2、发酵过程优化主要涉及的研究内容 、 3、Hasting(1954年)指出生化工程要解决的十大问题 、 ( 年 是哪些? 是哪些? 4、Cooney指出,要实现发酵过程的优化与控制,必须 指出, 、 指出 要实现发酵过程的优化与控制, 解决好哪些问题? 解决好哪些问题? 5、流加发酵、分批发酵、连续发酵方式的优缺点比较 、流加发酵、分批发酵、 6、重组生物药物生产过程的优化包括哪 个方面 、重组生物药物生产过程的优化包括哪6个方面 7、操作细胞循环生物反应器时必须考虑哪两个因素?为 、操作细胞循环生物反应器时必须考虑哪两个因素? 什么? 什么? 8、细胞生长过程可以分为哪 个步骤,运输过程包括其 个步骤, 、细胞生长过程可以分为哪3个步骤 中的两个步骤, 中的两个步骤,在细胞膜上的运输过程是研究者普遍关心 的内容,在细胞膜上可能存在哪些运输机制?各有何特点? 的内容,在细胞膜上可能存在哪些运输机制?各有何特点?

9、发酵过程数量化处理包括哪些方面的内容?常规的 、发酵过程数量化处理包括哪些方面的内容? 参数一般包括哪些?通常如何测量这些参数? 参数一般包括哪些?通常如何测量这些参数? 10、比速率和速率有什么区别? 、比速率和速率有什么区别? 11、生物反应过程中有关的宏观产率系数及定义 、 12、YATP与其它产率系数相比有何特点? 与其它产率系数相比有何特点? 、 13、复合培养基厌氧培养过程中细胞的生物合成步骤 、 及ATP的生成和利用途径 的生成和利用途径 14、代谢产物理论产率系数和实际过程产率系数有何 、 区别?影响实际过程产率系数的因素有哪些? 区别?影响实际过程产率系数的因素有哪些? 15、微生物反应动力学模型的类型及着眼点。Monod 、微生物反应动力学模型的类型及着眼点。 模型属于什么模型?其使用的条件包括哪些? 模型属于什么模型?其使用的条件包括哪些 16、对于一个具体的发酵产品,需要使用哪些模型才 、对于一个具体的发酵产品, 能完整地对其进行描述?为什么? 能完整地对其进行描述?为什么?

17、Gaden根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关系, 、 根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关系, 根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关系 将产物形成分成了哪几种类型?除此之外, 将产物形成分成了哪几种类型?除此之外,还有哪两种模 型? 18、发酵过程优化一般包括哪些步骤?具体陈述 、发酵过程优化一般包括哪些步骤? 19、系统优化方法的基本原则,具体陈述 、系统优化方法的基本原则, 20、构建 再生系统必须满足那些条件? 、构建ATP再生系统必须满足那些条件? 目前报道的 再生系统必须满足那些条件 ATP再生系统按底物不同可以分为哪几类?根据酶源的不同, 再生系统按底物不同可以分为哪几类? 再生系统按底物不同可以分为哪几类 根据酶源的不同, 可分为哪几类?各有何特点? 可分为哪几类?各有何特点 21、ATP再生系统存在的问题 、 再生系统存在的问题 22、采用 再生系统来生产有用物质时, 、采用ATP再生系统来生产有用物质时,固定化微生物 再生系统来生产有用物质时 细胞进行这些有用物质的生产具有什么优点? 细胞进行这些有用物质的生产具有什么优点? 23、E.coliⅡ-1是一株合成 是一株合成GSH的重组微生物,请分析有 的重组微生物, 、 Ⅱ 是一株合成 的重组微生物 机溶剂和前体氨基酸对其合成GSH的影响 机溶剂和前体氨基酸对其合成 的影响

24、有机废水处理如何与PHAs的合成耦合?分析影响耦合 、有机废水处理如何与 的合成耦合? 的合成耦合 的有关因素 25、在有机废水酸化工艺中,HRT对酸化产物分布的影响? 对酸化产物分布的影响? 、在有机废水酸化工艺中, 对酸化产物分布的影响 26、生物反应与产物分离的组合系统具有什么特征? 应用该 、生物反应与产物分离的组合系统具有什么特征? 系统时,分离技术的选择是关键, 系统时,分离技术的选择是关键,分离技术的选择主要考虑哪 些因素? 内部随程溶剂萃取和外部随程溶剂萃取各有何特点? 些因素? 内部随程溶剂萃取和外部随程溶剂萃取各有何特点? 27、流加发酵的分类 、 28、赖氨酸的生产方法有哪些?酶法生产赖氨酸的工艺有哪 、赖氨酸的生产方法有哪些? 些? 29、目前通常采用哪些方法来保持高产菌株遗传性能的稳定, 、目前通常采用哪些方法来保持高产菌株遗传性能的稳定, 防止其回复突变? 防止其回复突变? 30、黄色短杆菌是我国赖氨酸发酵的常用菌株,请分析其产 、黄色短杆菌是我国赖氨酸发酵的常用菌株, 赖氨酸的合成途径及调控机制, 赖氨酸的合成途径及调控机制,根据其赖氨酸合成途径及代谢 调控机制,可以采用哪些育种策略? 调控机制,可以采用哪些育种策略?这些问题与发酵过程优化 有什么关系? 有什么关系?

31、FB42(Leu-Thr-AECrAHVrLysHxr)是一株能大量 、 ( ) 合成赖氨酸的黄色短杆菌,在分批发酵中,初糖浓度、溶氧、 合成赖氨酸的黄色短杆菌,在分批发酵中,初糖浓度、溶氧、 pH对其发酵过程有什么影响?Thr、Leu、生物素对其分泌 对其发酵过程有什么影响? 对其发酵过程有什么影响 、 、 赖氨酸有何影响? 赖氨酸有何影响?为什么其发酵动力学模型的建立需要首先 进行发酵过程的动力学分析? 进行发酵过程的动力学分析? 应当如何评价所建立的动力学 模型? 模型? 32、以赖氨酸发酵生产为例,请你结合发酵过程优化的基 、以赖氨酸发酵生产为例, 本原理,谈谈你的优化思路。 本原理,谈谈你的优化思路。 33、以丙酮酸发酵生产为例,请你结合发酵过程优化的基 、以丙酮酸发酵生产为例, 本原理,谈谈你的优化思路。 本原理,谈谈你的优化思路。 34、利用 菌株发酵法生产丙酮酸时, 、利用WSH-IP12菌株发酵法生产丙酮酸时,氮源、碳 菌株发酵法生产丙酮酸时 氮源、 氮比对其丙酮酸发酵有何影响? 氮比对其丙酮酸发酵有何影响? 35、WSH-IP12与WSH-IP303相比主要有什么差异?维生 相比主要有什么差异? 、 与 相比主要有什么差异 素对WSH-IP303菌株过量合成丙酮酸中的影响 素对 菌株过量合成丙酮酸中的影响 题型:填空题、选择题、简述题、 题型:填空题、选择题、简述题、综述题


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