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共生法培养外生菌根菌菌丝体


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共生法培养外生菌根菌菌丝体
黄光文1 , 张   2 平
   摘要 : 首次报道外生菌根菌的共生培养法 。初步研

(1. 湖南科技学院生命科学与化学工程系 , 湖南   永州   425006 ; 2. 湖南师范大学真菌研究室 , 长沙   410081)

究了一个较好的外生菌根菌菌丝体

培养方法 , 即 将宿主 的愈伤组织与外生菌根共同培养 , 可以明显地促进真菌 菌丝的萌发和生长 。愈伤组织匀浆液也可促进菌丝体早 期生长 。 关键词 : 共生培养法 ; 鹅膏菌 ; 外生菌根菌 ; 菌丝体 中图分类号 : S646    文献标识码 : A 文章编号 : 1003 - 8310 (2005) 03 - 0016 - 02

1  材料与方法

mg , 甘氨酸 210 mg , 盐酸硫氨素 014 mg , 烟酸 015 mg , 盐酸吡哆醇 015 mg , 琼脂 18 g , 蔗糖 23 g , 胡 萝卜 100 g ( 煮汁) , 加水至 1 000 mL 。 11212   菌丝生长培养基 : 上述培养基中加入葡萄 糖 2 g 、蛋白胨 2 g 、麦芽汁 (12 波美度) 20 mL 。 113   愈伤组织培养方法 改良 MS 培养基附加 2 , 4 - 014 mg? - 1 或 6 L BA 018 mg? - 1 , 24 ℃ 20 ℃ ( 日/ 夜 ) 下自然光照 。 L / 详见文献 [2 ] 。 114   菌丝培养方法 对照 : 用打孔器打出直径为 015 cm 的菌丝块 接入装有 40 mL 菌丝生长培养基的 100 mL 三角瓶 中 , 于 20 ℃下 培 养 , 各 设 10 瓶 。测 定 萌 发 时 间

111   材料 宿主 植 物 : 石 栎 ( Lithocarpus glaber ( Thunb. ) Nakai) , 采自长沙县星沙镇 , 有鹅膏菌共生 。 菌根真菌 : 假褐云斑鹅膏 ( Amanita pseudopor2 phyria Hongo) 、黄盖鹅膏白色变种 ( A . subjunquillea var. alba Zhu L. Yang) 、欧氏鹅膏 ( A . oberwinkler2 ana Zhu L. Yang & Y oshim. Doi ) 。经组织分离纯培 养而来 , 并经 RAPD 鉴定 [1 ] 。 112   培养基 11211   改良 MS 培养基 : K 3 119 g , NH4NO3 1165 NO g , KH2 PO4 0117 g , CaCl2 ? 2O 0144 g , MgSO4 ? 2O H 7H 0137 g , FeSO4 ? 2O 2718 mg , Na2 EDTA ? 2O 3713 7H H mg , H3BO3 612 mg , ZnSO4 ? 2O 816 mg , MnSO4 ? 5H H2O 1619 mg , Na2MoO4 ? 2O 0125 mg , KI 0183 mg , 2H CaSO4 ? 2O 01025 mg , CoCl2 01025 mg , 肌 醇 100 5H

收稿日期 : 2004 - 10 - 18 基金项目 : 国家科委重点课题项目 (96 - C02 - 03 - 07) ; 湖南省教育厅课题 (03C358)

中国食用菌  EDIBLE FUNGI OF CHINA         124 , No13 Vol

(以肉眼明显可见菌丝外伸为度 ) , 萌发后每 10 d 量一次菌丝长度 。( 下同) 方法 A : 在改良 MS 培养基中加入经过过滤除 菌的菌根浸出液 ( 菌根重量与组织块重量一致) 作 为生长刺激因子 。 方法 B : 菌丝块接种于 ( 紧贴 ) 愈伤组织旁 ( 即共培养方法) 。 方法 C : 将愈伤组织全部挑出 , 在剩下的改良 MS 培养基上接入菌丝块 。 方法 D : 无菌状态下将愈伤组织研磨成匀浆 , 加入到新的菌丝生长培养基中后接种真菌 。

2  结果与分析

实验结果显示 , 四种方法培养的菌丝在萌发速 度 ( 图 1) 和生长速度 ( 图 2 ) 上比对照均有不同 程度的提高 , 其中方法 B 即共培养方法的效果最 为显著 。 从图 3 可以看出 , 菌丝在改良培养基上的生长 比较均衡 , 在前 30 d 逐渐缓缓加快 , 然后缓缓减 慢 。愈伤组织匀浆 、菌根提取液和愈伤组织分泌物 对菌丝的前期生长有较好的刺激效果 , 效果依次减 小 , 但相关不大 。三种刺激物作用一段时间后失去 影响 。而共培养的菌丝生长速度比其他四者均高 , 而且在生长后期效果依然显著 。不同的菌株对刺激 因子的反映程度略有不同 , 但总的趋势一致 。

图1  菌丝萌发时间的比较 注 : A. pse = 假 褐 云 斑 鹅 膏 ( A . pseudoporphyria ) ; A. sub = 黄盖鹅膏白色变种 ( A . subjunquillea) ; A. obe = 欧氏鹅膏 ( A . oberwinklerana)

3  讨论

从实验结果看 , 菌丝体的共培养法是促进外生

第 24 卷   3 期         第 中国食用菌  EDIBLE FUNGI OF CHINA

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图2  五种不同培养方法的菌丝平均生长速度的比较 注 : 同图 1

中 。受此影响 , 此方法在大量培养菌丝时还不完 善 , 有必要进一步研究 。 菌根浸出液和愈伤组织浆对菌丝生长的促进作 用推测是因为其中所含的激素 、降解核酸和蛋白质 等成分 。因为降解蛋白质 、氨基酸 、核酸成分和一 些激素可促进菌丝生长 [3 ] 。而前者比后者作用小 , 可能是菌根上的菌丝在研磨中产生了自融的废物 。 愈伤组织挑走后的培养基对菌丝也有生长作用表 明 , 愈伤组织在生长过程中向培养基分泌一些有益 物质 , 可能是许多酶和多种其他化合物 , 从而可以 促进菌丝生长 , 也说明共培养方法是可行的 。但培 养基中的附加物 2 , 4 - D 、6 - BA 和 NAA 对菌丝生 长没有影响 [4 ] 。共培养法的菌丝比其他方法在后期 生长中要好 , 是因为其他方法中刺激因子的消耗 , 而愈伤组织可以持续地分泌刺激因子 。但究竟有哪 些物质在起作用 , 是进一步研究的内容 , 。研究结 果将为菌丝对营养根的趋化性研究和直接向培养基 中加入刺激物质以促进菌丝快速生长提供重要的参考 信息。愈伤组织也可能会对孢子萌发有刺激作用。
[参 考 文 献] [1 ] 黄光文 , 张平 , 张志光 . 柯的组织培养 [J ] . 零陵学 院学报 . 2002 , 03 : 81 - 83. [2 ] 陈作红 , 张志光 , 张平 . 几种鹅膏菌菌种分离及其 RAPD 鉴 定 [ J ] . 湖 南 师 范 大 学 学 报 自 然 科 学 版 . 2000 , 23 (4) : 56 - 91. [3 ] 郭秀珍 , 毕国昌 . 林木菌根及应用技术 [ M] . 中国 林业出版社 . 1989. [ 4 ] 陈豫 . 外生菌根真菌鳞柄白毒鹅膏与白毒鹅膏生物学 特性的研究 [ R] . 湖南师范大学硕士论文 : 2000 , 5.

图3  五种不同培养方法的菌丝生长速度曲线图

菌根菌菌丝生长的十分有效的方法 。此方法以前未 见报道 。由于外生菌根菌适应了与宿主植物的共生 生活 , 在人工培养基上生长会受到抑制 。人们研究 外生菌根和外生菌根菌时常常需要解决菌丝体的生 长问题 。因此能有效促进菌丝体生长的培养条件一 直是研究者们所追寻的 。本方法为改良外生菌根菌 培养方法提供了一个很有益的思路 。但是 , 宿主植 物 的愈伤组织本身的培养在很多树种中尚在摸索

Symbiosis - based Culturing : A Ne w Effective Method of Culturing Ectomycorrhizal Fungi
HUANG Guang - wen1 , ZHANG Ping2 (1. Department of Life Science and Chemistry Engineering , Hunan Science and Tecinology Institue , Y ongzhou   425006 , China ; 2. College of Life Science , Hunan Normal University , Changsha 410081 , China)

Abstract : A new method , Co - culturing , of culturing ectomycorrhizal fungi is reported for the first time. The ef2 fective method is that ectomycorrhizal fungi are introduced just beside the callus of host plant , which can evidently upgrade the growth of the hyphae. The callus juice can also do on the early growth. Key words : symbiosis - based culturing method ; Amanita ; ectomycorrhizal ; hyphae

声明 : “神经致幻型毒蕈 205 新菌株的驯化研究试验” ( 见本刊 05 年第二期 , 第 13~14 页) 研 究所采用的 205 菌株 , 是由西南科技大学的贺新生教授提供 , 以此致歉 。 杜秀菊 2005 年 3 月 24 日


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