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水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体的构建及遗传转化研究


24 核 农 学 报 2010, (2) :225 ~ 230 Journal of Nuclear Agricultural Sciences

225

8551(2010)02022506 文章编号:1000-

水稻 OsHsfA7 基因 RNA 干扰载体的 构建及遗传转化研究
刘爱玲 邹 杰

>1

王文芳

1

周小云

2

张先文

1

陈信波

1,2 410128 )

(1. 湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南 长沙

410128;2. 作物基因工程湖南省重点实验室, 湖南 长沙



本文通过 要: 为研究水稻热激转录因子基因 OsHsfA7 的功能及其在水稻耐热育种方面的应用价值,

从反向遗传学进行基因的功能分析。扩 构建水稻 OsHsfA7 基因 RNA 干扰载体获得功能抑制变异材料, 增 OsHsfA7 cDNA 3’ 编码区 470bp 片段, 分别以 反 向 和 正 向 插 入 到 中 间 载 体 pBSK 连 接 的 GUS 片 段 两 构建以 CaMV35S 启动子驱动表 侧,然后将得到的 RNA 干扰片段克隆到改造的植物表达载体 p1301M, 达的水稻 OsHsfA7 基因 RNA 干扰表达载体。将该载体转入根癌农杆菌 EHA105 后, 采用农杆菌介导法 进行了水稻日本晴品种的遗传转化, 获得了 23 株具有潮霉素抗性的转基因植株, 其中 12 株经 GUS 染 RNA 检 测 其 中 6 株 OsHsfA7 基 因 的 表 达 水 平 下 降 甚 至 色呈蓝色并且 DNA 检测 10 株已插入目的片段, 未检出。结果说明本研究构建的 OsHsfA7 基因 RNA 干扰载体对该基因表达沉默是有效的。
关键词: 水稻; 热激转录因子基因 HsfA7; 干扰载体

CONSTRUCTION OF RNAi EXPRESSION VECTOR AND TRANSFORMATION OF OSHSFA7 GENE IN Oryza sativa L.

LIU Ai-ling 1

ZOU Jie 1

WANG Wen-fang 1

ZHOU Xiao-yun 2 ZHANG Xian-wen 1
410128 )

CHEN Xin-bo 1 ,2
410128 ;

(1. College of Bioscience and Technology of Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 2. Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province,Changsha,Hunan

Abstract:RNAi expression vector of rice heat shock transcription factor OsHsfA7 was constructed and transformed into Oryza sativa L. to generate low or null expression mutants for the functional characterization by reverse genetics and evaluate its application value on rice breeding for heat tolerance. A 470bp fragment amplified from the 3 ’ end of OsHsfA7 cDNA were inserted into both sides of GUS fragment linked with intermediate vector pBSK in reverse and forward direction,respectively. The RNA interference fragment was then cloned into a reconstructive vector p1301M to form OsHsfA7 RNA interference expression vector driven by CaMV35S promoter. The recombinant was transformed into Oryza sativa L. mediated by Agrobacteria tumefaciens EHA105. Twenty-three transgenic rice plants were obtained by hygromycin resistance selection and twelve of the transformant leaves showed blue by GUS staining. Successful intergration of the RNA interference fragment was confirmed in ten transgenic plants by DNA amplification and RT-PCR amplification showed that the transcript levels of OsHsfA7 in six transgenic plants were greatly decreased or undetectable. The results demonstrated that the OsHsfA7 RNA interference vector was effective for this gene silencing in Oryza sativa L. Key words:Oryza sativa L. ;heat shock transcription factor gene A7;RNA interference vector

09 05 收稿日期:2009- -

12 04 接受日期:2009 - -

973 计划前期研究专项(2007 CB116207 ) , 基金项目:国家自然科学基金(30870206 ) , 教育 部 博 士 点 基 金 ( 20050537001 ) , 南 省 教 育 厅 青 年 基 金 湖 (09B045 ) 作者简介:刘爱玲(1975 -) , 湖南衡阳人, 女, 博士研究生, 从事水稻逆境分子生物学研究。E-mail:liu_ailinglal@ yahoo. com. cn 通讯作者:陈信波(1962 -) , 湖北荆门人,教授, 男, 主要从事植物抗逆性分子生物学与基因工程。E-mail: xinbochen@ live. cn

226









24 卷

高温胁迫是我国南方水稻生产主要自然灾害之 一。大量研究表明高 温 胁 迫 影 响 水 稻 的 生 长 发 育 产量
[ 2] [ 1]

晴( Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare ) 。 1. 2 质粒与菌株 水稻热激蛋白 转 录 因 子 基 因 HsfA7 的 全 长 cDNA 质 粒,购 于 日 本 农 业 生 物 资 源 研 究 所 ( National Institute of Agrobiological Sciences, NIAS ) 。 中 间 载 体 pBluescriptⅡ SK ( + / - ) ( 简 称 pBSK,~ 3000bp ) 和 pBGUS( 连 接 GUS 片 段 的 pBSK 载 体,~ 4000bp ) , 表 1300-multi ( 简 称 p1300M, ~ 达 载 体 pCAMBIA12000bp) 和 pCAMBIA1301 ( 简称 p1301,~ 11837bp) , 大肠杆 菌 DH5α, 杆 菌 EHA105 均 由 湖 南 省 作 物 基 农 因工程重点实验室保存。 1. 3 引物设计 利用软件 primer premier 5 设 计 引 物, 上 海 英 骏 由 生物技术公司合成。 本 试 验 中, 于 载 体 构 建 的 引 物 用 根据 OsHsfA7 基 因 全 长 cDNA 序 列 设 计, 增 正 向 片 扩 -AT GGATCC CTCCTGGTGAGGTT段 上 游 引 物 5’ GTGAG3’( BamHI 酶 切 位 点 ) ,下 游 引 物 5 ’ -AT TCTAGACTGCTCCATTCCAGTTTCA - ’( XbaI 酶 切 位 3 -AT 点 ) ,扩 增 反 向 片 段 上 游 引 物 为 5 ’ GAATTC CTCCTGGTGAGGTTGTGAG- ( EcoRI 酶 切 位 点 ) , 游 3’ 下 -ATGGTACCCTGCTCCATTCCAGTTTCA- ’ 3 引物 为 5’ ( KpnI 酶切位 点 ) 。RNAi 载 体 的 间 隔 序 列 GUS 上 游 -ATGGATCCGATATCTACCCGCTTCGCGTCG引物 为 5 ’ 3 ’ ( BamHI 酶 切 位 点 ) , 下 游 引 物 为 5 ’ GGGAATTCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC- ’( EcoRI 酶 3 切位点) 。用于转基因 DNA 检 测 的 上 游 引 物 35S:5 ’ CGCACAATCCCACTATCCTT- 根据 CaMV35S 序 列 设 3’ 计。用于 转 基 因 RNA 检 测 的 OsHsfA7 基 因 上 游 引 物 5’ -TTCGCCAGCTCAACACCTA- ’ 3 ,下 游 引 物 5 ’ TCCATCAGCCGTTGTCTT- ’ ACTIN 基 因 上 游 引 物 3 ; 5’ -CTTCAACACCCCTGCTATG- ’ 3 ,下 游 引 物 5 ’ TCCATCAGGAAGCTCGTAG- 。 3’ 1. 4 OsHsfA7RNAi 表达载体构建 选用 OsHsfA7 基因 cDNA 3’ 470bp 的 编 码 序 列 端 作为靶序列, 通过 引 入 不 同 的 酶 切 位 点 ( 正 向 片 段 引 入 BamH I 和 Xba I 酶切位点, 反向片段引入 Kpn I 和 EcoR I 酶 切 位 点 ) , 反 向 和 正 向 分 别 插 入 中 间 载 体 以 pBSK 连 接 的 GUS 片 段 ( 从 质 粒 pBI121 上 扩 增 ) 两



、 质 品

[] 3

以及生理生化

[ ~ 8] 4

特 性, 且 水 稻 耐 而
[ ~ 12] 9

热性属于数量遗传 性 状, 多 基 因 的 控 制 受

。目前

报道 与 耐 热 相 关 的 基 因 包 括 热 激 蛋 白 基 因 ( Heat shock protein,Hsp ) 和 热 激 蛋 白 转 录 因 子 基 因 ( heat shock transcription factor,Hsf) 等。 随 着 全 球“温 室 效 应” 加剧, 高温胁迫 出 现 频 率 呈 增 加 趋 势, 切 需 要 培 迫 而 育耐热的水稻新材料, 水 稻 耐 热 机 制 的 阐 明 和 耐 热 相关基因克隆鉴定是水稻耐热育种的重要基础。笔者 所在研究室选择遗传背景相似但在高温下结实率和产 量有显著差 异 的 耐 热 性 品 种 996 和 热 敏 感 品 种 4628 为材料, 利用基因芯 片 分 析 了 幼 穗 分 化 期 高 温 胁 迫 下 幼穗基因表达的动态 变 化 谱, 现 耐 热 性 品 种 的 热 激 发 转录因子基因 OsHsfA7 表达受高温诱导, 而且通过 RTPCR 方法证实在高温胁迫处理期间 OsHsfA7 基因的表 与芯 片 结 果 基 本 吻 合。 因 此 本 文 选 择 目 达差异明显, 前尚未报道 的 OsHsfA7 基 因 进 行 功 能 鉴 定, 在 阐 明 旨 OsHsfA7 基因在水稻耐热育种方面的应用价值。 RNA 干 扰 ( RNA interference,RNAi) 技 术 为 研 究 简便的方法。RNAi 技术 基因的功能提供了一种快速、 通过双链 RNA 介导特异性地降解同源的 mRNA, 从而 特异性地阻断相应基因的表达
[ 13]

, 是近年来迅速发展

特 易 起 来 的 高 效、 异、 操 作 的 基 因 沉 默 技 术。 目 前, RNAi 技术已 广 泛 应 用 于 植 物 基 因 功 能 分 析、 物 抗 植 病抗逆及提高植物营养价值等品种的改良和植物发育 及生理代谢途径的研究
[ ] 14

。由于在植物中利用 RNAi

技术需要通过转 化 载 体 导 入 能 产 生 发 夹 结 构 RNA 的 表达单位, 便 有 效 的 RNAi 表 达 载 体 的 构 建 成 为 高 方 效利用 RNAi 技 术 的 关 键。 本 研 究 通 过 构 建 OsHsfA7 基因 RNA 干扰载体, 利用农杆菌进行水稻的遗传转化, 通过反向遗传学获得功能缺失突变体, 为研究 OsHsfA7 基因的功能奠定基础, 并为进一步利用 OsHsfA7 基因来 提高水稻的耐热性提供重要的理论价值。

1
1. 1

材料与方法
植物材料 本试验用于遗传转化的受体材料为粳稻品种日本

图1

RNAi 表达载体结构图

Fig. 1

Structure of RNAi expression vector

2期

水稻 OsHsfA7 基因 RNA 干扰载体的构建及遗传转化研究

227

端, 最后将 RNAi 片 段 ( 即 反 向 + GUS + 正 向 ) 连 接 到 改造 的 p1301M。 其 RNAi 载 体 的 结 构 图 和 相 关 酶 切 位点如图 1 所示: 1. 5 1. 6 1. 6. 1 农杆菌介导的水稻遗传转化 15, 。 转化方法和所用培养基参照文献[ 16] 转基因水稻植株的检测 GUS 染色 将愈 伤 组 织 和 水 稻 叶 片 用 不 含 底

物的 X-Gluc 染 色 液 ( 染 色 液 组 成: 1. 0 mmol / L XpH Gluc;50mmol / L 磷 酸 缓 冲 液, 7. 2;2 mmol / L 铁 氰 2 0. 100 化钾, mmol / L 亚 铁 氰 化 钾, 1% Triton X- ) 清 洗 1 ~ 2 次, 加 入 含 底 物 的 X-Gluc 染 色 液, 真 空 再 抽 20min 后, 37℃ 保 温 过 夜 进 行 组 织 化 学 染 色,用 于 70% 乙醇脱色后观察, 照相。 1. 6. 2 献
[ 17]

图2

p1301M 和 p1300M 载体酶切图

Fig. 2

p1301M and p1300M vectors

digested by restriction enzyme 取 水 稻 幼 嫩 叶 片,
M: Marker Ⅲ; 1: p1300M EcoRⅠ和 Hind Ⅲ 酶切; 2: p1301 M EcoRⅠ和 Hind Ⅲ 酶切 M:Marker Ⅲ; 1: p1300 M digested by EcoRⅠand Hind Ⅲ; 2: p1301 M digested by EcoRⅠand Hind Ⅲ

DNA 提取及 PCR 的 检 测

CTAB 法 提 取 小 量 叶 片 总 DNA, 体 步 骤 参 照 文 具 。以 35S 启 动 子 上 的 一 段 序 列 为 上 游 引 物, OsHsfA7 基因反向片段特异序列为下游引物, 进行转基 58℃ 因 的 PCR 检测。反应参数: 94℃ 5min;94℃ 30s, 72℃ 1min(35 个循环) ;72℃ 10min。PCR 产物用 30s, 1. 5% 的琼脂糖凝胶电泳检测。 1. 6. 3 RNA 提取及 RT-PCR 检测 取水稻嫩叶, 液氮 速冻后用 于 总 RNA 的 提 取。 水 稻 总 RNA 的 提 取 用 Trizol 试剂参照说明 书 进 行。 提 取 的 RNA 溶 于 DEPC 处理 过 的 去 离 子 水 中, 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 用 RNA 的 完 整 性。 总 RNA 经 DNase I 除 DNA 后, 用 Toyobo 公司的反转 录 酶 ReverTra Ace 合 成 cDNA。 以 水稻 ACTIN 基因 ( 登录 号 为:AB047313 ) 为 内 参 进 行 RT-PCR 分 析。 反 应 参 数:94℃ 5min;94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 40s; 72℃ 10min。PCR 产物用 2% 的琼脂糖 凝胶电泳检测。

泳道 1) 约 500bp 大小的目的带。再 将 pBGUS-正 向 和 OsHsfA7-RNAi 反向片段经 Kpn I 和 EcoR I 双 酶 切, 连 用 接转化, GUS 下 游 引 物 和 反 式 片 段 引 物 进 行 PCR 检测, 得到预期的约 1500bp 大 小 片 段 ( 图 3 泳 道 2 ) 。 为验 证 重 组 质 粒 pBSK-OsHsfA7-RNAi 的 准 确 性, 用 Kpn I 和 Xba I 酶切, 电泳结果( 图 3 泳道 3) 与预想结 确定 OsHsfA7-RNAi 片段已克隆到 pBSK 载体。 果相符, 2. 3 OsHsfA7RNAi 的构建 植物表达载体 p1301M为 方 便 将 载 体 用 于 水 稻 的 遗 传 转 化, 研 究 对 本 pBSK 连接的 OsHsfA7-RNAi 片 段 和 改 造 的 p1301M 载 体用 Kpn I 和 Xba I 酶 切 回 收, 接 转 化, 测 结 果 见 连 检 切 图 4。 用 Kpn I 和 Xba I 双 酶 切, 出 包 括 OsHsfA7RNAi 的正向 和 反 向 片 段 以 及 GUS 片 段 的 约 2000bp 目的带(1 泳道 ) ;2 泳 道 用 KpnI 和 BamHI 双 酶 切, 切 出约 1500bp 的目 的 带。酶 切 结 果 说 明 植 物 表 达 载 体 p1301M-OsHsfA7-RNAi 已经构建成功。 2. 4 农杆菌介导的水稻遗传转化 将 p1301M-OsHsfA7-RNAi 载体通过冻融法转化农杆 菌 EHA105, RNAi 反向片段引物扩增鉴定农杆菌质粒 用 中目的基因的存在。从图 5 可知农杆菌质粒 PCR 与大肠 说明植物表达载体 p1301M杆菌质粒 PCR 结果相吻合, OsHsfA7-RNAi 已转 化 到 农 杆 菌 中。经 愈 伤 诱 导、 培 共 养、 筛选、 预分化、 分化得到 23 株转基因水稻苗。 2. 5 转基因水稻的检测 对具有潮霉素抗性的愈伤组织和转基因水稻叶片 进行 GUS 染色检测, 结果见图 6。在 23 株转基因水稻 中, 12 株 GUS 染色呈蓝色, 有 初步证明 OsHsfA7-RNAi 片段已整合到水稻基因组中。

2
2. 1

结果与分析
p1301 载体的改造 为采用 GUS 染色法进行转基因的早期检测, 研 本

究对 p1301 载 体 进 行 了 改 造。 用 EcoR Ⅰ 和 Hind Ⅲ 双酶切载体 p1300M 和 p1301, 连接转化后得到的重组 2 子为 p1301M。从图 2 可知, 个 载 体 酶 切 片 段 长 度 完 全 一 致, 约 800bp 左 右, 明 p1300M 载 体 中 的 大 说 CaMV35S 启动子、 多克隆位 点 与 Nos 终 止 子 片 段 已 连 接到 p1301 载体。 2. 2 OsHsfA7RNAi 的构建 中间载体 pBSK将 PCR 扩增的 OsHsfA7-RNAi 正向片段与 pBGUS 载体分别经 BamH I 和 Xba I 双酶切, 连接转化大肠杆 菌 DH5α, OsHsfA7-RNAi 正向片段引物扩增出 ( 图 3 用

228









24 卷

图3

重组质粒 pBSK - OsHsfA7 - RNAi 的 PCR 和酶切鉴定

Fig. 3

PCR identification and restriction enzymes digestion of recombinant pBSK-OsHsfA7-RNAi plasmid
M: Marker Ⅲ; 1 : 重组质粒 pBGUS - 正向片段 PCR; 2 : 重组质粒 pBSK-OsHsfA7 -RNAi 的 GUS 和反向片段 PCR; 3 : 重组质粒 pBSK-OsHsfA7-RNAi 的 Kpn Ⅰ和 XbaⅠ酶切 M: Marker Ⅲ; 1 : PCR identification of recombinant pBGUS-forward plasmid with forward primers; 2 : PCR identification of recombinant pBSK-OsHsfA7 -RNAi plasmid with GUS and reverse primers; 3: recombinant pBSK-OsHsfA7 -RNAi plasmid digested by Kpn Ⅰ and XbaⅠ

图5 图4 重组质粒 p1301M-OsHsfA7-RNAi 的酶切鉴定

质粒 p1301M-OsHsfA7-RNAi 转化农杆 菌 EHA105 的 PCR 检测

Fig. 4

Restriction enzymes digestion of recombinant P1301M-OsHsfA7-RNAi plasmid
1 : p1301M-OsHsfA7-RNAi 载体的 Kpn I 和 XbaⅠ酶切;

Fig. 5

PCR Identification of EHA105 transformed p1301M-OsHsfA7-RNAi plasmid

M: Marker Ⅲ;

M: Marker Ⅲ; 1: 农杆菌质粒 p1301M-OsHsfA7 -RNAi 的 PCR 结果;2 : 大肠杆菌质粒 p1301M-OsHsfA7 -RNAi 的 PCR 结果 M: Marker Ⅲ; 1 : PCR result of p1301 M-OsHsfA7-RNAi plasmid of Agrobacterium tumefaciens; 2 : PCR result of p1301M-OsHsfA7-RNAi plasmid of E. coli

2 : p1301 M-OsHsfA7 -RNAi 载体的 Kpn I 和 BamHⅠ酶切 M: Marker Ⅲ; 1 : p1301 M-OsHsfA7-RNAi vector digested by Kpn I and XbaⅠ; 2 : p1301 M-OsHsfA7-RNAi vector digestied by Kpn I and BamHⅠ

由于 GUS 染色有时会出现少量的假阳性, 此 本 因 研究通过 CTAB 法提取转基因水稻叶片的 DNA, 检测目 的片段是否插入。用 35S 和反向片段上游引物对 T 0 代 植株进行 PCR 扩增, 以构建好的表 达 载 体 质 粒 为 阳 性 对照、 野生型日本晴为阴性对照, 如图 7 所示, 转基因植 株与质粒对照扩增的条带大小一致, 说明干扰片段已整 合到水稻基因组中, 共检测出 10 株阳性植株。 为检测阳性转基 因 植 株 在 转 录 水 平 的 表 达, 野 以 生型日本晴为对照, OsHsfA7-RNAi 阳性转基因植株 对 6 进行 RT-PCR 分析。如图 8 所示, 株转基因阳性植株 OsHsfA7 基因的转录水平表现出不同程度的下调, 说明 本研究构建 的 OsHsfA7 基 因 RNA 干 扰 载 体 对 该 基 因
图6 愈伤组织( 左) 和转基因水稻叶片( 右) 的 GUS 染色

Fig. 6

GUS staining of callus( L) and leaf of transgenic rice( R)

表达沉默是有效的。

2期

水稻 OsHsfA7 基因 RNA 干扰载体的构建及遗传转化研究

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图7

部分 OsHsfA7-RNAi 转基因植株 PCR 检测

Fig. 7

PCR analysis of OsHsfA7-RNAi transgenic rice

M: Marker II; P: OsHsfA7 -RNAi 质粒; CK: 野生型水稻; 1 ~ 6: 转基因水稻 M: Marker II; P: OsHsfA7-RNAi plasmid; CK: wild type rice; 1 ~ 6 : transgenic rice

图8

OsHsfA7-RNAi 转基因植株 RT-PCR 分析

Fig. 8

RT-PCR analysis of OsHsfA7-RNAi transgenic rice

CK: 野生型水稻; 4 , 6, 10 , 13, , , 5, 8, 12, 16 18 20: OsHsfA7 -RNAi 转基因水稻 CK: wild type rice; 4, 6, 10 , 13, , 20 : transgenic OsHsfA7-RNAi rice 5, 8, 12, 16 18,

靶基因序列不同位置设计的 RNAi 影 响 目 的 基 因 的 抑

3

讨论
p1301 是近年来在水稻上 普 遍 应 用 的 一 种 优 良 的

制效果。对于保守性强的基因家族来说,若要沉默整 可选择保守性序列构建 RNA 干扰 个基因家族的基因, 载体。如果选择 mRNA 的 5’端和 3’ 端非翻译区及起 始密码子附近 序 列 设 计 RNAi,可 能 会 因 为 这 些 区 域 的调节蛋白与 RNA 诱导的沉默复合 体 ( RISC) 竞 争 结 而降低基因沉默效应 合靶序列,
[ ] 18

植物双元载体, 它所带的报告基因 GUS 能在真核细胞 中起显色反应, 但它 的 多 克 隆 位 点 两 侧 没 有 启 动 子 与 终止 子。 为 了 能 够 利 用 p1301 载 体 的 报 告 基 因 GUS 进行转基因的早 期 检 测, 研 究 对 p1301 载 体 进 行 了 本 改造。p1300M 载体的多克隆位点上游有 CaMV35S 启 动 子和 EcoR I 酶切位点, 下游有 Nos 终止子和 Hind Ⅲ 酶切位 点, 2 个 酶 切 位 点 与 p1301 质 粒 多 克 隆 位 点 这 因 的第一个酶切位点和 最 后 一 个 酶 切 位 点 恰 巧 相 同, 此本研究利用 EcoR I 和 Hind Ⅲ 双酶切把 p1301 的多 克隆位点替换为 p1300M 的 CaMV35S 启 动 子、 克 隆 多 位点和 Nos 终止子 片 段, 而 启 动 多 克 隆 位 点 插 入 片 从 段的转录, 而且在愈伤组织筛选期间采用 GUS 染色法 进行早期检测, 以便快速判断转基因的成功与否, 节省 后续的转基因工作。 RNA 干扰现象自 20 世纪 90 年代被发现以来, 现 在已逐渐成为分子生 物 学 研 究 的 一 种 有 用 工 具, 广 被 泛应用于植物 功 能 基 因 组 研 究。 RNAi 通 过 人 为 地 引 入与内源靶基因具有相同 序 列 的 双 链 RNA, 而 诱 导 从 内源靶基 因 的 mRNA 降 解, 到 阻 止 基 因 表 达 的 目 达 的
[ 13]

。本研究选用了水

稻热激 转 录 因 子 基 因 OsHsfA7 cDNA 3 ’ 码 区 做 为 编 RNAi 载体靶基因 序 列 区 段, 转 基 因 植 株 的 RNA 水 从 平证明了 3’ 编码 区 设 计 RNAi 的 可 行 性。 第 二, 基 靶 因序列长度也是影 响 目 的 基 因 表 达 效 果 的 重 要 因 素。 对于载体介导的 RNAi 来 说,干 扰 片 段 的 长 短 对 转 录 后的抑制效果 有 很 大 的 影 响。 Hammond 等
[ 19]

认为干

扰片段在 300 ~ 500bp 之间干扰效果好, 太长或太短干 扰效果都不太好;而 且 靶 基 因 序 列 长 度 与 载 体 的 填 充 片段长度有关, 若载体填充片段较长, 目的基因片段太 短就不能形成 发 夹 结 构
[ 20]

。本研究使用的双元载体

p1301M 的 填 充 GUS 片 段 长 达 1040bp, 此 选 用 因 470bp 左右的长 度 构 建 OsHsfA7 基 因 RNA 干 扰 载 体, 分子检测结果表明该载体对目的基因表达沉默是有效 双 的。第 三, 链 RNA 的 连 接 方 式 影 响 基 因 沉 默 的 效 果。黄 冰 艳 等
[ 21]

在 水 稻 淀 粉 脱 支 酶 基 因 的 ihpRNA

载体构建中, 采用约 500bp 的靶基因片段, 而且反向重 复片段是先反后正, 得 极 高 的 基 因 沉 默 效 果。 本 研 获 究在 35S 启动子后首 先 连 接 反 向 片 段, 后 是 间 隔 序 然

, 而双链 RNA 序列的选择、 连接方式和载体 间 隔

片段的选择 对 RNAi 的 抑 制 效 果 有 重 要 影 响。 第 一,

230

Journal of Nuclear Agricultural Sciences 2010 , (2 ) :225 ~ 230 24 2003 ,17(3 ) : 223 - 227 [ 10] 赵志刚,江 玲,肖应辉,张文伟,翟虎渠,万 建 民. 水 稻 孕 穗

RNAi 的 效 果 明 列 GUS 片 段, 后 再 连 接 正 向 片 段, 最 显。因此先反后正的连接方式是 RNAi 基因沉默一种 可行高效的方法。第 四, 前 很 多 研 究 采 用 保 守 内 含 目 子作中间间 隔 片 段 构 建 RNAi 载 体, 大 多 数 的 内 含 但 内 子是转入受体植株基 因 组 本 身 不 具 备 的 片 段, 含 子 的作用主要用来形成 发 夹 结 构, 否 具 有 其 他 特 殊 功 是 能和 ihpRNA 载体沉默效应 很 高 的 机 理 尚 不 清 楚。本 研究参考文献
[ 22]

. 32 期耐热性 QTLs 分析[J] 作物学报,2006 , (5) : 640 - 644 [ 11] 朱昌兰,肖应辉,王春明,江 玲,翟虎渠,万 建 民. 水 稻 灌 浆

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. 淀粉含量和胶稠度对高温耐性的 QTL 分 析[J] 中 国 水 稻 科 学, 2006 ,20 (3) : 248 - 252 [ 13] Fire A,Xu S,Montgomery M K,Kostas S A,Driver S E,Mello C C. Potent and specific genetic interference by double stranded RNA . in Caenorhabditis elegans[J] Nature,1998,391 :806 - 811 [ 14] 马 . 建, 刘艺苓, 王丕武. 植 物 RNA 干 扰 的 研 究 进 展[J] 中 国

采用 GUS 基 因 编 码 序 列 做 间 隔 构 建

RNAi 载体, 而且近年来根据 Gateway 技 术 开 发 的 一 种 专 门 针 对 水 稻 基 因 组 功 能 分 析 的 RNA 干 扰 载 体— pANDA[23]用的间隔序 列 也 是 GUS linker, 同 于 常 规 不 采用保守内含子作中 间 片 段 的 方 法, 种 方 法 是 否 具 这 有潜在的优势或不好的影响值得以后进一步探讨。 参考文献:
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