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白酒窖泥中酵母菌的分离鉴定及发酵特性研究


天津大学 硕士学位论文 白酒窖泥中酵母菌的分离鉴定及发酵特性研究 姓名:郜希璐 申请学位级别:硕士 专业:食品科学 指导教师:周志江 20090601

摘要
酵母是工业酒精发酵和酒类饮料发酵不可或缺的微生物,对发酵过程中乙醇 的产量起着关键的作用。我国白酒酿造一般采用含有复杂微生物种类的酒曲进 行,并在酒窖这种特殊的发酵环境中进行发酵,因此酒窖中

的窖泥中有非常丰富 的微生物群系,包括种类丰富的酵母。本试验的目的是从某白酒厂提供的窖泥中 分离酵母菌,对其生理生化特性和发酵特性进行鉴定,以期获得可以工业应用的 酵母菌种。 本试验将窖泥接种至麦芽汁液体培养基进行增菌培养,然后将增菌培养液接 种至含有氯霉素的YEPD琼脂培养基。培养后选取符合酵母菌落特征的菌株98株, 用于之后的进一步筛选和鉴定。 对这些菌株进行温度适应性试驻.将其接种至YEPD液体培养基,分别于32 ℃、36℃、40℃、44℃、48℃条件下培养,获得耐受44℃温度的菌株18株。将 该18株菌接种至YEPD琼脂培养基,。生长后加入TTC上层培养基,通过颜色的变 化观察其呼吸强度,选取呼吸强度高的红色菌落进行菌株的乙醇耐受性试验。将 这些菌株接种至含10%乙醇和加有杜氏小管的YEPD液体培养基中进行培养,其 中有10株菌生长良好,表现出对乙醇的耐受性。


对上述10株菌进行形态学观察和生理生化鉴定,10株菌均为酵母菌,分别 属于5个种,其中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)4株,异形汉逊酵母
(Hansenula

polymorpha)2株,鲁氏接合酵母(Zygosaccbaromyces rouxil)

2株,耐热克鲁维酵母(K1uyveromyces thermotolerans)1株,粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)l株。 从上述5个菌种中各选取1株菌进行生长和发酵特性研究,获得了各株菌的 最适生长和最适发酵条件参数。其中酿酒酵母A1在最适培养条件下乙醇产量最 高。以酿酒酵母Al作为出发菌,以玉米面为发酵原料,探索了温度、pH、接种 量、摇床速度、氮源等因素对乙醇产生量的影响,获得的优化发酵条件的参数。 本试验从白酒窖泥中分离出了5种共10株耐高温、呼吸强度高和耐乙醇的酵 母菌种,对其生长和发酵特性进行了研究,并对1株菌进行了发酵条件的研究和 优化。在阐明白酒酵母菌系的同时,所获得的酵母菌种有望用于工业化生产,具 有良好的应用前景。

关键词:

酵母菌白酒窖泥分离鉴定发酵

ABSTRACT
Yeasts
are

organisms that wide Spread in nature,and most of them are capable of

producing ethanol which is essential to the liquor industry.In Chinese traditional craft, liquor is fermented in

cellar and hence the cellar mud eonmms diverse kinds of
at

microorganisms including many species of yeasts.T【lis paper aims from cellar mud which were collected from
physiological and


isolating yeasts

distillery,making identification through

biochemical

experiments and testing fermenting characteristics.

The cellar mud was inoculated in malt extract medium

and

then WaS proliferated
tO

in YEPD?chloramphenicol liquid medium.A total of 98 strains which conformed
the characteristics of yeast colony were The

isolated

for further screening.

temperature-enduring properties

of the 98 strains were analyzed.The strains
at

were inoculated in YEPD liquid medium

32℃、36℃、40℃、44℃、48℃and intensity

18

strains were capable of fermentating at 44"C.Respiratory was tested by inoculated in 1vrC top agar.By inoculated which

of the 1 8 stra.ins

in YEPD liquid for stronger

medium
of

contained
alcoh01.

1 O%alcoh01.1 0

strains

were screened

ability

enduring

According to

the morphological and cultural traits,physiological proterties and

biochemical reactions,and the above 10 strains were primarily classified as follows:
Saccharomyces

cerevisiae(4),Hansenula polymorpha(2),Zygosaccharomyces rouxil
Schizosaccharomyces

(2),Kluyveromyces thermotolerans(1)and

pombe(1).

On the basis of studying the resistance capability of alcohol,sugar and acid,the

best temperature and pH value of each genera,it is suggested that the isolated strain of
A1

has

the highest ability to produce aeoh01.The fermentation condition and medium

of AI

have

been

optimized.Through
are

single factor and orthogonal experiments.the

optimum conditions ofAl
In this
temperature

obtained.
stronger mud abi lity

paper,1 0 were
isolated

strains with from cellar

of enduring high research

alcohol
On

and high

and the preliminary
to

fermentation

characteristics was studied.These

studies have important meaning

the strains in making

full

use

ofalcohol production.

KEY

WORDS:cellar

mud,yeast,isolation,identification,fermentation

独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果,除了文中特别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他人已经发表

或撰写过的研究成果,也不包含为获得墨鲞盘鲎或其他教育机构的学位或证
书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。

学位论文作者签名:蜘匆数

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≥∞?



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本学位论文作者完全了解苤鲞盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丕奎态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检
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第一章文献综述

第一章文献综述

中国白酒是我国特有的传统酒种,在漫长的发展过程中形成了独特的工艺和 风味特征,在世界范围内享有很高的声誉,与白兰地、威士忌、朗姆酒、伏特加、 金酒齐名,被誉为世界著名的六大蒸馏酒之一。白酒传统酿造以含有复杂微生物 种类的酒曲作为发酵剂,以淀粉质、糖质为原料,在泥窖窖池中完成酒精的发酵 过程。在发酵过程中,窖泥和发酵糟醅密封接触,大量微生物在两者间扩散、交 换,最终使得作为发酵容器的窖泥中含有包括酵母菌在内的非常丰富的微生物群 系,因而也使得白酒厂窖池窖泥成为酵母菌及其他微生物分离选育的良好来源。

1.1白酒客泥概述

窖池大多由弱酸性黄泥粘土建造而成,白酒发酵时以泥窖窖池作为发酵容 器,将经蒸煮糖化的糟醅密封于窖池中,使其自然发酵。当糟醅被封盖发酵后。 随着发酵产热、产气,窖内压力增加,产生了大量“黄浆水”,成为窖泥与糟醅

物质交换的载体【11。酒糟中的养份和来自曲药、环境的微生物及其代谢产物不断
通过黄浆水渗入泥中,使窖泥成为大量微生物的生长介质。每一次发酵过程,黄 浆水都为窖泥中的微生物带来营养物质,同时也带来更多种类的微生物,在实现 窖泥自身新陈代谢的同时,也完成窖泥与糟醅的物质能量交换,窖龄越长,微生 物和香味物质越多,酒香越浓。简而言之,窖泥是发酵中几乎所有菌种的集合载 体,在发酵过程中协助合成各种风味。 窖池在酿造使用过程中通过长期的驯化会因使用环境、用水、温度的不同而 形成特定的微生物环境【2】。我国历史悠久的几大名窖都是长期不问断地培养,再 加上特殊的地质土壤气候条件等才形成的。以五粮液酒厂窖池为例,经过几百年 不间断发酵的积累,该厂窖池中的窖泥中的菌群种类极为丰富,被视作国宝。 作为酒精发酵容器,窖池的窖泥中含有种类丰富的酵母菌。这些酵母菌长期 处于发酵环境中,经过自然筛选、诱变而具有一定的特殊性质,如耐高温、耐高 糖、耐乙醇等。

1.1.1国外酒精生产现状
酒精,化学名为乙醇,分子式为C2H50H,是一种分子结构简单的二元醇,

第一章文献综述

具有很强的挥发性和刺激性气味,极易燃烧。同时放出大量的热量。化学性质上, 乙醇十分活泼,可与水、醇类、乙醚、苯、甘油等有机溶剂混合,也可与多种金 属盐类、碳氢化合物、脂肪酸等起化学反应,是许多化工产品如乙酸、乙醛、丁 醇和乙烯的生产原料。酒精广泛地应用于人们生活的各个方面,有着巨大的需求。 在国民生产中,酒精工业也占有重要的位置,长期以来在医药、化工、食品、农 业及国防工业都有广泛的应用。 自20世纪70年代石油危机以来,各国出于战略考虑,纷纷开始了可替代石 油的新燃料研究。燃料酒精作为生物燃料的重要,在国外已经有了比较成熟的产 业化发展。目前发展燃料酒精项目最为活跃的国家是美国和巴西,这两个国家酒 精产量约占全球总产量的95%以上,其中,巴西产量约占全球总产量的58%, 美国产量约占全球总产量38%。其次是加拿大墨西哥等国家.而现在欧洲各国也 开始逐步研究、推广和使用生物燃料【3J。研究表明,酒精作为内燃机的燃料与汽 油相比有很多优势。酒精便于储存、输送,并且完全与现有的加油站设施相容, 且在减少环境污染方面还有极大的优势。 巴西自然条件优越,甘蔗资源丰富,在以甘蕉作为原料发展燃料酒精工业方 面极具代表性。目前巴西是世界上最大的燃料酒精生产和消费国。2000年巴西 共消费了340亿升汽油,消费燃料酒精约160亿升(其中约1/2.3/4用于酒精汽油, 其余直接使用),这也使得巴西成为世界上唯一不使用纯汽油作为汽车燃料的国 家;美国是能源消耗大国,每年石油消耗量中的50%是需要进口,占美国贸易赤 字的45%左右。目前美国燃料酒精年产500万吨,美国政府已颁布法令.规定 37个大城市的汽车所用的汽油中必须添加5%的燃料酒精,这一法令的实施给美 国国家贸易平衡贡献将近15亿美元14】:欧洲已对发展生物燃料表现出极大兴趣, 因此世界范围内酒精生产新一轮增长很可能会发生在欧洲,欧盟目前酒精年产量 为175万吨左右,酒精汽油的使用量大约100万吨。1992年欧共体通过法律, 统一各种矿物油的消费税。对于可再生资源为原料生产燃料的试验性项目,成员 国可采取免税政策,而燃料酒精包括在有税收优惠之列。由于燃料酒精的生产成 本较汽油高,故税收优惠的原则是将酒精汽油的价格调到与汽油相当的水平l 51。 纵观各国燃料酒精的推广和发展,不难发现其成功的应用都离不开两方面因 素:一是政策保障:如巴西为了增加酒精对消费者的吸引力,在加油站以汽油价 格的59%来出售;美国采取税收鼓励政策,即减免燃料货物税,数额由燃料中酒 精含量而定,含量越高,物税减免比例就越大:二是技术保障,包括实验室中酵 母菌株的筛选选育、培养条件的优化、生产工艺的创新以及生产设施的完善等。 其中作为发酵核心的优良酵母选育,在降低成本、提高生产效率方面无疑起到至 关重要的作用。



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1.1.2国内酒精生产现状
中国酒精工业的发展已有近百年的历史,但工业基础十分薄弱.建国后,随 着国民经济的发展和白酒液态法生产法的推广,酒精工业进入崭新的发展阶段。 发酵原料主要以甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、玉米、木薯、红薯干为主,黑龙江、吉林、 山东、安徽、河南、广西等地酒精制造业较为发达,是目前中国酒精的主要产区。 但是目前国内供求需求以及发展趋势都朝着有利于燃料酒精的方向发展。自 上世纪90年代中期开始,我国酒精生产能力就己经开始过剩。酒精价格受甘蔗、 玉米等的生产和市场供求关系影响较大。一方面,由于近年粮食生产的丰收以及 消费者喝酒习惯由白酒转向果酒而导致酒精生产市场疲软。另一方面,由于经济 的发展,生活水平的提高以及汽车关税的人幅度下降,我国的汽车消费浪潮逐渐 到来,由此汽车燃料的需求将大幅度提高。与此同时,作为一个人口众多、能源 相对匮乏的国家,在新时期又面临着能源开发与环境保护的双重问题。一方面, 我国煤炭、石油等能源资源有限,开采成本高昂,而国际原油价格受国际部分国 家操控,制约工业、制造业等行业的迅速发展;另。一方面.由于技术所限导致的 开采利用低效,以及过多依赖化石燃料,环境污染和资源过度开采已经引发了大 量的环境问题,影响到可持续发展的顺利进行。生产和使用燃料酒精在一定程度 上不但可以缓解石油供求矛盾,而且也可以扩大玉米等原材料消费市场,带动农 业生产增加农民收入、消化陈化粮【6】。另外,燃料酒精的使用还可以有效降低汽 车尾气中有害气体的排放,改善了环境和空气质量,节约石油资源、减少对进口 石油的依赖并且以酒精替代MTBE,避免了MTBE引起的污染,减少汽车尾气 中一氧化碳和碳氢化合物的排放,改善环境质量。 为此。我国政府正大力推进包括太阳能和燃料酒精在内的清洁能源研究计划 的进行。2001年我国已经将“大力发展燃料酒精”产业列入十五燃料酒精高产 酵母菌株选育及应用研究计划中,并且在《国民经济和社会发展第十个五年计划 纲要》中做了明确的要求。2001年9月22曰,中国石油天然气集团公司、吉林 粮食集团公司和中国华润总公司共同出资,在我国吉林省吉林市建立了第一个 60万吨燃料酒精项目,项目总投资达29亿元人民币,并计划在交通运输行业中 推广使用燃料酒精【7】。而在技术方面,我国工业微生物技术人员也正在积极探求 选育具有发酵力强,繁殖速度快,耐酒精能力强,耐温性能好,抵抗杂菌能力强,

生产性能稳定,变异性小等优良特性的菌种【61,以期投入生产获得高效回报。

第一章文献综述

1.2酒精发酵的研究现状

酒精生产方法通常有两类:微生物发酵法和化学合成法。其中化学合成法生 产的酒精往往夹杂高级醇类,对人体神经中枢有麻痹作用,不能食用,一般被称 为工业酒精。用化学合成法生产酒精,生产设备要求、生产条件和成本均比较高, 我国一般不用此方法,基本上是用淀粉质或糖质原料进行发酵生产:发酵法又分 为固体发酵法、半固体发酵法和液体发酵法三种。目前固体发酵法和半固体发酵 法在我国主要用于生产白酒,一般产量较小,生产工艺较古老,劳动强度大。而 在现代大生产中,都采用液体发酵法生产酒精,它与固体发酵法相比,具有生产 成本低、生产周期短、连续化、设备能自动化,大大减轻劳动强度等优点。 不论是固体、半固11奉、液体发酵法,都是利用淀粉作原料,经过微生物发酵 转化为糖,再由糖转化为酒精。转化时原料中的可溶性淀粉在糖化酶的作用下被 转化为可发酵的糖,然后在酵母作用下糖水解成酒精并放出二氧化碳。食用酒精 必须以薯类、谷物或废糖蜜为原料,并通过发酵法酿造。菌种是发酵工程的关键, 发酵和酿造工业都是以微生物菌种为核心组织生产的.酒精发酵工业也不例外。 选育高产高效的优良菌种,可以大幅度地提高酒精的发酵生产率,显著提高酒精 产业的经济效益。

1.2.1酵母菌及分类
酵母菌是单细胞真核微生物,在自然界中普遍存在.主要分布于含糖质较多 的偏酸性环境中,如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子以及果园土壤中。石油酵母较 多地分布在油田周图的土壤中。细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆 形、柠檬形或藕节形,其大小随培养基成分的改变,菌龄的长短,及培养时间的 不同而有差异,一般为(8.30)um×(1.5)um,最长的可以达到100 um。 无鞭毛,不运动。细胞构造具有真菌细胞的一般特征,细胞壁不含纤维素,由葡 聚糖、甘露聚糖等多糖组成。大多数酵母菌的菌落多为乳白色,少数为红色,个 别为黑色,表面光滑、湿润、粘稠,容易挑起,质地均匀。其繁殖方式可分为有 性生殖和无性生殖.绝大多数酵母都以芽殖、裂殖来进行无性繁殖,极少数种可 以产生子囊孢子进行有性繁殖。酵母菌生长温度为4-30℃,最适培养温度为25.30 ℃,pH5-6。常用的培养基为麦芽汁、YEPD、GYP和PDA等【8】。酵母菌在自然 界中分布很广,尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长,在水果、蔬菜、花 蜜、植物叶子表面和在果园土壤中最为常见,也有一些酵母如白假丝酵母会生长 于生物体内,是临床常见的致病菌。在油田周图的土壤中也分布着大量石油酵母。 由于酵母菌主要利用单糖和二糖,不能利用多糖,因此淀粉和纤维素等多糖


第一章文献综述

物质需经过淀粉酶和糖化酶的转化,形成葡萄糖,再经EMP途径生成乙醇181。 酵母菌这一名称其实并非基于分类学,而通常是用来定义以芽殖或裂殖方式 来进行无性繁殖的单细胞真菌,以此与霉菌区分开。对酵母菌的分类可以追溯到 1860年,丹麦的酵母专家Emil
Christian

Hansen首先对酵母菌进行分类研究,他

被公认为是最早系统研究酵母菌的微生物学家。随后人们又相继提出了多种分类 方法并不断改进。1970年,Loddert9】将酵母菌分为四大类,即子囊酵母类、黑粉 菌目酵母类、掷孢酵母类和无孢酵母类。1982年,Kreger
Van

Rij研究资料显示,

己知的酵母菌有500多种,共有56个属,分属于子菌亚门、担子菌亚门及半知 菌门。其中比较著名的是,1983年Lodder和Barrier对酵母菌进行了系统分类方 法.其原则步骤是: 第一步:依据是否具有有性生殖过程、能否形成子囊孢子、具有掷孢子或冬 孢子以及孢子的形状、特点、数目以及能否形成真假菌丝分类到纲、目、科。 第一步:依据菌落形态、细胞形状、增殖方式、是否形成真假菌丝,并结合 少数糖类发酵和硝酸盐利用等试验分类归属。 第三步:根据生理特征,尤其是糖发酵、同化试验和利用硝酸盐的情况分类 到种。 目前酒精工业生产中使用的酵母菌大多属于真菌门(Eumycota)、子囊菌纲 (Ascomycetes)、半子囊菌亚纲(Hemiascomycetes)、酵母目(Endomycetales)、 酵母科(Saccharotnycemceae)。大多数用于酒精发酵的酵母菌都属于酵母属的酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces
carlsbergensis)、

清酒酵母(Saccharomyces sake)及其变种。其它的属如粟酒裂殖酵母
(Shizosaccharomyces pombe)、脆壁克鲁维酵母(Kluyberomyces fi'egilis)、树干

毕赤酵母(Pichia stipitis)、克劳森酒香酵母(Brettanomyxes claussenii)、热带假 丝酵母(Candida tropicalis)和管囊酵母(Pachysolen tannlphilus)等也有一定应
用f8】。

工业上常用的酒精发酵菌株有K字酵母、南阳1300酵母、南阳1308酵母、 拉斯2号、拉斯12号、古巴I和古巴n等,均属于酿酒酵母。 酒精生产中对酵母菌菌株的生理特性有一定的要求…】:(1)发酵力强而且迅 速,有较强的酒化酶;(2)繁殖速度快,有较强的增殖能力:(3)耐乙醇能力强, 能在较高浓度的酒精发酵醪中发酵;(4)耐温性能好,能在较高温度下发酵;(5) 抵抗杂菌能力强(6)耐酸能力强:(7)生产性能稳定,变异性小,发酵时产生 泡沫小。

第一章文献综述

1.2.2酒精发酵机理
酒精发酵作用.是酵母菌将可发酵的糖。在无氧条件下,经EMP途径先分 解为丙酮酸,然后在丙酮酸脱羧酶的作用下脱羧成乙醛和二氧化碳,再经过细胞 内酒化酶的作用转变成乙醇.最后通过细胞膜将产物排出体外‘引。其反应过程如
下:

(1)葡萄糖生成丙酮酸
C6H1206

(EMP途径)

(2)丙酮酸脱羧生成乙醛
cH,cOOH

亘塑堕壁丝堕》cH,cHo+co:1、

(3)乙醛进一步还原为乙醇
CH

3CHO+2H——一C2H50H+H:O

总反应式如下:
C6Hn06———÷2C2HsOH+2C02+1 1 2.9kj

1.2.3酵母菌鉴定方法
1.2.3.1传统鉴定方法 常规的酵母菌鉴定方法【lo_13】主要是通过对菌株菌落形态特征、细胞形态、特 殊的细胞形态(如假菌丝、子囊孢子等)观察、酵母菌菌的生理生化特征(如糖发酵、 碳源和氮源的同化、产酯试验、石蕊牛乳试验等)、查检索表这样几个步骤来确 定所测菌株的种属。微生物的形态特征和生理生化特性是传统分类方法的依据, 而形态特征和生理生化特性是受多方面影响的,有时同种也会出现不同的形态及 生理生化特征,而且因实验条件的所限,实验结果偶尔会出现波动,重现性和可 靠性不够理想。通常整个步骤需要做60一90次试验,需要花费大量的人力、时间 和金钱,比较繁琐费时【13】。 1.2.3.2快速鉴定方法 几十年来,在菌种快速鉴定系统产品中,也出现了如API
20C

AUX系统、

Biolog微生物鉴定系统等较为成熟可靠、使用广泛的产品,在短时间内极大的提 高了菌株鉴定的特异性、重复性和准确性。同时随着分子生物学技术的前进和发 展,出现了多种基于PCR的DNA多态性鉴定方法,常用的几种酵母菌鉴定DNA 分子标记技术包括RAPD(random amplified polymorphic,随机扩增多态性DNA)、
RFLP(restriction fragment length

polymorphism,限制性片断长度多态性)、AFLP



第一章文献综述

(amplified fragment length sequence

polymorphism,扩增片断长度多态性)及SSR(simple

repeat,微卫星DNA分子标记),在短时间内极大的提高了菌株鉴定的

特异性、重复性和准确性。
(1)API 20CAUX

菌种快速鉴定系统产品多达20多种,如API
Vitek

20C,ATB 32C,Auxacolor,

YBC和APICandid|1 5】系统等,克服了传统菌种鉴定费时、操作要求高的缺

点,其中API菌种鉴定系统在世界范围内应用较广,其鉴定结果的准确性已被微 生物学界所公认。API由法国生物梅里埃公司出品,始创于1970年,其通过对 传统技术标准化、微量化的变革,使细菌鉴定更加简单、快速和可靠。在世界范 围内得到广泛认可。在我国,该系统己广泛应用于临床医学微生物检验。徐红等 IHj利用API
20C

AUX系统鉴定了120株病原酵母菌,鉴定结果与常规方法相比

较符合率达95%。
API

20CAUX系统包括试剂条和数据库,试剂条通常包含20个微量生化试

验。系统内含一塑胶带,配有20个独立细管,每管内含有不同化学试剂,可进 行生化反应试验。先把待鉴定菌在萨布罗右旋糖琼脂(Sabouraud
DextroseAgar)

上培养48h.72h,然后用无菌环挑取菌落于上述液体培养基中制成标准浊度的菌 悬液,将其依次添加到含化学试剂的独立细管内,在30℃培养72h。菌体在生长 时,菌悬液的浊度不断变化,通过与系统的阴性对照相比,配合鉴别图表和电脑 辅助系统来鉴定菌种。 S.G。GtlNDES等【161应用API
20C

AUX系统对116株分离的酵母菌株的正确

鉴定率为87%,其中对自假丝酵母(Candida albicans)的正确鉴定率为89.7%, 对热带假丝酵母(Candida tropicalis)的正确鉴定率为100%,对中型近平滑假丝 酵母(Candida parapsilosis)的正确鉴定率为83.3%。王丽敏等117]利用酵母粉.葡 萄糖琼脂培养基对15个批次苹果原料样本中的酵母菌进行分离,并用API
20C

AUX系统进行鉴定,得到25株酵母菌分别属于假丝酵母菌属、酿酒酵母菌属和 克勒克酵母菌属的6个种:克柔/平常假丝酵母菌(Candida krusei)13株,酿酒 酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)5株,克勒克酵母菌属酵母菌(Kloeckera spp.) 2株,木蓝假丝酵母菌(C.magnoliae)2株,热带假丝酵母菌(C.tropicalis)和 乳酒假丝酵母菌(C.kefyr)各一株,鉴定准确率均超过95%,其中模式菌酿酒 酵母的鉴定准确率为98.7%,相似度1.00,证明该系统能够快速、准确地鉴定苹 果原料中的酵母菌。 (2)Biolog微生物自动分析系统 Biolog自动分析系统是美国Biolog公司于1989年开发的微生物鉴定产品, 其微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的,可鉴定包括细菌、酵母和丝状真



第一章文献综述

菌在内总计1973种微生物,几乎涵盖了所有人类、动物、植物病原菌以及食品 和环境微生物。Biolog鉴定系统由浊度计、读数仪、软件、数据库、微孔鉴定板 组成,其独创碳源利用方法.针对每一类微生物筛选95种不同碳源,配合显色 物质固定于孔板上。当微生物利用95种不同碳源进行呼吸时,会将显色物质氧 化还原,从而在鉴定板上形成该微生物特征性的反应模式或“指纹”。通过设备 读取颜色变化,将目标微生物与数据库的相关菌的特征数据进行对比,就可以在 瞬间得到鉴定结果,确定所分析的微生物的属名或种名I”J。 目前Biolog微生物自动分析系统在酵母菌多相分类鉴定中应用较广。 Praphailong等【l 8】用该系统对72株酵母进行了154次鉴定实验,结果表明Biolog 系统对Candida krusei、C.parapsilosis等常见酵母准确鉴定到种的概率达到100%, 取得了良好结果。 (3)分子生物学方法 随着分子生物学技术的前进和发展,在菌种鉴定领域还出现了多种基于PCR 的DNA多态性鉴定方法【201,常用的几种酵母菌鉴定DNA分子标记技术包括
RAPD(random amplified polymorphic,随机扩增多态性DNA)、RFLP(restriction fragment length

iength polymorphism,限制性片断长度多态性)、AFLP(amplified

fragment

polymorphism,扩增片断长度多态性)12l】及SSR(simple

sequence repeat,

微卫星DNA分子标记)[221,都能在短时间内准确鉴定菌株。但对于每一种方法 来说,都有其局限性。因此并非任何一种方法都适用于所有的酵母菌鉴定,甚至 有时使用不同的方法会产生不同的结果。尽管近年来人们不断应用新技术对酵母 菌进行鉴定和分析,但对一些疑难菌株的鉴定往往需要应用多种方法才能获得满 意结论。随着技术的进步,酵母菌的分类方法将会不断地更新和完善。

1.2.4酵母菌育种研究
针对不同的用途及特性,可以通过育种改进产酒精酵母的生产性能。目前主 要的选育方向集中于发酵原料拓展和菌种的耐抗性两个方面[231。 1.2.4.1发酵材料 长期以来,酵母发酵酒精多采用玉米、非糖蜜或蔗糖作为原料,成本较低廉, 但是受粮食危机影响,近几年来这些原料价格不断提高,在一定程度上限制了燃 料酒精的发展。酵母菌所能利用的底物范围非常有限,大多数既不能利用由淀粉 水解产生的大部分寡糖,包括比麦芽三糖链更长的糊精和异麦芽糖,也不能利用 纤维素、半纤维素、纤维二糖和大多数戊糖,而长远看来粮食危机很难在短期内 解决,因此要发展燃料乙醇发展清洁能源,就必须培育出能够直接发酵纤维素等

第一章文献综述

廉价而来源广泛原料的菌种。 目前的育种研究主要集中于两个方面(1)分解淀粉质原料的菌种研究。目 前已有研究先后将黑曲霉、泡盛曲霉、米根霉或米曲霉等的糖化酶cDNA、糖化 酵母或拟内抱霉的糖化酶基因、地衣杆菌或解淀粉芽抱杆菌的a.淀粉酶基因克 隆到酿酒酵母中,并获得了表达。此外,也有研究利用原生质体融合技术,完成 了糖化酵母与酿酒酵母的原生质体燃料酒精高产酵母菌株选育及应用研究融合, 实现了酿酒酵母与出芽短梗霉的原生质体融合,获得了能发酵淀粉的稳定融合 子。另外,Zastrow等【24】人分离到能利用麦芽三糖发酵的酵母菌,同样拓宽了酵 母菌利用淀粉材料的范围。(2)分解纤维质原料的菌种研究。目前已知的具有工 业应用前景、能利用木糖发酵生成酒精的三种酵母菌是管囊酵母(Pachysolen
tannlphilus

J、树干毕赤酵母(Pichia stipits)和休哈塔假丝酵母(C.shechatae)。

在筛选和培育戊糖发酵菌株方面,科学家也取得了一定的进展,如张继泉等12 51 从木糖固体培养基中筛选到一株能发酵戊糖的管囊酵母(Pachysolen tannlphilus),产乙醇能力相当于理论产量的60%,耐乙醇能力为14%(v/v),42 ℃下能正常发酵。Nancy_【26】利用大肠杆菌.酵母菌穿梭质粒将树干毕赤酵母(Pichia stipits)的木糖分解基因转入到酿酒酵母中,构建的工程菌既能利用葡萄糖也能 利用木糖发酵生产乙醇。Moniruzzrnant2 7】构建的1400酵母工程菌能高效表达木 糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶,在含有80∥L葡萄糖和409/L的木糖的 混合培养基中可产生529/L的乙醇,理论转化率为85%。 1.2.4.2菌种耐受性 在酒精发酵生产中,生产商会根据菌种的不同特性配制条件最适于发酵的培 养基质,包括最适pH、培养基、温度等,以保证最大的回报率,但是考虑到实 际生产成本以及随着发酵进行带来的条件改变,需要菌种对不良环境有较高的的 抗性与耐受性。通过育种培育出耐高温、耐高渗、耐酸碱等特性的菌株,对于改

进工艺、降低能耗均有重要意义【28】。
(1)耐高温酒精酵母 耐高温酒精酵母的育种方法主要有自然分离、高温驯化、诱变和原生质体融 合四种【29】。国外在70年代末掀起了研究热潮,国内则在80年代以后投入了研究。 目前国内较有代表性的耐高温酵母主要是沈睿的YH41301,蒋亚平的WVHY8【3¨, 宜昌酵母基地的YY和WY,北京酒精厂的80.1428。国外的研究主要集中在东 南亚和日本。日本有学者以SaicESake为菌种,培养出的酵母在20℃下清酒发 酵20d可得到的乙醇体积分数为19.0%t32l。 (2)耐乙醇、耐高渗酵母



第一章文献综述

乙醇是酿酒酵母厌氧发酵的重要工业产物,但对酵母细胞本身又是毒素和抑 制荆。酵母菌耐乙醇的生化机理是十分复杂的,细胞中的许多组分与酵母菌耐乙 醇能力有密切的关系,所以细胞的许多基因控制着酵母菌耐乙醇的特性。通过连 续筛选分离的方法,Eenandes等【3 3】通过改变温度等方法分离出乙醇耐性株,以 蔗糖为原料,可产乙醇163∥L,他们还发现由于乙醇抑制酵母的生长和发酵, 温度增加乙醇在酵母中的毒性,通过改变温度使酒精耐性株的存活率提高了,发

酵能力也提高了。Bertolini掣34】分离出可在最初浓度为30%的可发酵糖中发酵的
新酵母菌株,并且具有酒精耐性和温度耐性,最终酒精浓度为1639/L。酵母存

活率也增加了。陈国潮等P51通过原生质体融合而获得的酿酒酵母菌株HU.Ⅳ1A
与糖化酵母菌株5206.1B的不同核倍性融合株,在30℃培养时,其生长速度和 生物量略高于亲株,40℃时明显高于双亲,耐高渗透压和涌精能力高于5206.1B,

与HU.佯1A相当,40℃时发酵能力优于双亲株。
(3)其他特性酵母 耐酸酵母在发酵的过程中可以大大减少染菌机会,给操作带来方便。酸度大 的环境中耐酸酒精酵母能提高原料的利用率和出酒率。中科院成都生物所自浓香 型大曲酒酒糟中分离到一株耐酸型酒精酵母,并进行了中试试验,证明该菌在浓 香型大曲酒的生产中确实起到了一定的作用。 低产乙醇酵母因产品乙醇含量低,使其味道更适口,受到饮料行业青睐。利 用该类酵母可以生产无醇啤酒【231。我国微生物学工作者先后选育了几株低产或不 产酒精的的酵母菌株,以期实残产生风味物质的同时少产或不产酒精的目标。

1.3耐高温酒精酵母研究
耐高温酒精酵母的研究已成为当前国内外酒精行业的热门课题。使用耐高温 酵母不仅有利于降低生产水耗、电耗,充分利用现有设备,缩短生产周期,提高 生产率,而且在夏季保证了正常生产【36|。运用生物工程技术,培育具有特殊性能 的生产菌株及改进传统酒精发酵工艺,科学研究机构和酒精生产企业都在为之作 不懈努力。早在上世纪50年代以来我国微生物学家就从事驯化育种以糖蜜原料 发酵的耐高温酒精酵母。上世纪末期宜昌酵母基地从收集到的耐高温酵母菌中筛 选出耐高温、发酵性能良好的菌株,并将其制成活性干酵母。它们在生产上获得 了较成功的应用。也有研究者对生产用菌株通过驯化与筛选,得到了适合于玉米 醪发酵的耐高温酒精酵母12引。 耐高温酵母不是微生物分类学上的名词,而是从生态方面表达此类酵母对温 度的忍耐性与普通酵母的差异【37】。对生活条件的变化有迅速的适应能力,这是微
10

第一章文献综述

生物的一大特点。外界环境的变化,使微生物群体中迅速产生变种。驯化就是通 过破坏微生物正常的生活条件,积累定向变异而实现的。它跟诱变育种或利用细 胞原生质体融合,进而发生细胞核染色体基因间的重组获得新种相比较,具有培 育条件温和、操作简单、投人少、易掌握诸优点。华子安f3 8】以酵母为出发菌株, 通过驯化、筛选,使其发酵温度从32.34℃提高到38-40℃的选育方法,作为改 良菌种的一种尝试,获得了一定成功。 对传统酵母菌株来说,其发酵温度低、酶活性低,易污染杂菌,浪费能源。 如酿酒酵母传统菌株的发酵温度控制在28.34℃,当温度超过35℃,生产和发酵 能力大大减弱.且为了控制由于发酵热所引起的温度上升,需要大量冷却水。而 耐高温酵母菌株具有生长速度快、生产效率高的优点,而且不易污染杂菌,节省 能源。它们所合成的酶与适温同类酵母菌株产生的酶相比,高温时具有更高的酶 活性。因此对于生产那些质量指标要求较高的发酵产物和SCP生产,耐高温酵 母具有重要的地位和广泛的应用 应用耐高温酵母于酒精生产,有以下好处:(1)可节约冷却费用,节水节能; (2)可维持夏季正常生产;(3)夏季生产与常温酵母相比,可减少污染生酸, 提高出酒率:(4)一般可缩短发酵周期,提高设备利用率”引:

1.3.1酵母菌在高温条件下的代谢机制
高温条件下,酵母菌发酵酒精仍然是通过EMP途径将糖类分解代谢,但是 高温条件会导致细胞膜及胞内代谢过程发生改变。 高温对酵母细胞有破坏性作用,温度升高时,通常会引起酵母细胞内各种成 分,如脂肪酸、磷脂、麦角固醇等的变化,导致细胞早衰、死亡,使杂菌占优势, 破坏正常发酵活动。高温还会引起细胞膜的无序和蛋白质的变性,抑制糖的酵解 作用,同时增加了原生质 膜的渗透性,导致了质子流的上升。这驱散了细胞在膜两边维持的电化学梯 度,反过来又影响营养物质的吸收、钾平衡的维持和膜内pH的调节机制。 1.3.1.1脂肪酸组成变化 高温通常会引起细胞膜流动性的变化,酵母通过改变它的脂肪酸组成来适应 这一变化。有一些酵母细胞在生长过程中可以合成较多的长链不饱和脂肪酸,抵 抗高温带来的细胞膜变化。温度越高,酵母细胞细胞膜内的饱和脂肪酸越多,油 酸、亚油酸、亚麻酸等含不饱和酰基链的脂肪酸减少,而棕榈酸,棕榈油酸等饱 和脂肪酸的含量则增加。在培养基中加入适量的脂肪酸,特别是不饱和脂肪酸, 在被酵母细胞所吸收后,可以提高细胞膜的流动性,从而提高酵母细胞的耐热性。

第一章文献综述

M.Suutari等mJ通过研究发现,酵母包含了3.5种不同类型的脂肪酸,占全 部脂肪酸的90%以上。其中主要是棕榈酸(C16:0),棕榈油酸(C16:1),油 酸(C18:1),亚油酸(C18:2),和亚麻酸(C18:3)。棕榈酸是目前所研究的 菌株中惟一一种重要的饱和脂肪酸,随着生长温度的上升,棕榈酸的相对含量呈 上升趋势。在C.oleophia,C.utilis,L.starkeyi和S.cerevisiae菌株中,随温度的下 降,棕榈酸的绝对含量上升。油酸是目前所研究过的菌株中惟一的不饱和脂肪酸, 由于温度导致的油酸变化会因菌种的不同而有差异。在L.starkeyi中,油酸的相 对和绝对含量随温度的下降而上升。在C.utilis和L.starkeyi中,亚麻酸的绝对 和相对含量在低温(>20%)下是恒定的,但随温度的进一步上升而降低,在C.utflis 中,随着亚麻酸含量减少,亚油酸含量增加。 在R.toruloides中.亚麻酸很明显被亚油酸所代替,当用相对脂肪酸含量来 表示时,随着温度的上升,油酸的含量会减少。Sumari等[401研究了几株酵母随 温度变化的情况,随温度的上升,有的酵母脂肪酸链的平均长度增加了,有的酵 母脂肪酸的不饱和程度上升了,有的酵母则两种情况都发生,脂肪酸链长度增加 的同时,其脂肪酸的不饱和度也增加。而使用亚麻籽油、芥茉油,以及从这些油 中提取出来的脂肪酸.则可以减轻酒精或温度对酵母细胞膜的损害。 1.3.1.2磷脂量变化 磷脂是细胞膜最重要的成分。在高温条件下,酵母菌会改变膜的磷脂数量, 以维持细胞活性的最适膜流动性。 细胞在不同温度下生长会使得磷脂与蛋白的比率发生变化。膜片段中的脂类 与蛋白比率在20℃时为560I.tg磷脂儋膜蛋白,而当温度剩到4l℃时,脂类与蛋 白比率降至含270}.tg磷脂儋膜蛋白,即生长在41℃的细胞中每克分子蛋白中所 含的磷脂数量大约为30℃时所含磷脂数量的60%;当温度升高时,双磷脂酞甘 油(包括痕量的磷脂酸)和磷脂酞胆碱的比例也会随之增加,而磷脂酞甘油和磷脂 酞乙醇胺的含量则随温度的上升而下降。 1.3.1.3麦角固醇变化 麦角固醇是酵母细胞固醇类中最主要的一种化合物,由于它的特殊化学结 构,能够增加细胞膜的坚固性,从而在有高温下使膜具有更好的稳定性。 Kazccyoshiohta等【3川发现,当温度从40"C上升至50"(2时,细胞中甾醇(尤其是麦 角固醇1的含量会明显。一株缺乏麦角固醇的H.polymorphaCK-1突变株在40℃ .50℃的生长速率比它的野生型菌株慢,而在50℃时,当这株突变株生长在含有 麦角固醇.卵磷脂的乳浊液中时,它可以结合麦角固醇,提高生产速率。

12

第一章文献综述

1.3.2耐高温酵母的菌种选育
1.3.2.1传统育种方法 传统育种方法因操作设备简单,目前乃至今后相当长的时间内仍将被广泛使 用。利用传统技术培育耐高温酒精酵母的目标是选育耐高温(40℃以上),耐酒 精(10%),发酵周期短的菌种141|。 传统的酵母菌育种技术主要有直接筛选、杂交育种和诱变育种等。采取传 统方法筛选育种,一般要通过初筛和复筛两阶段完成。初筛方法是以所需目的菌 株为出发点而设计出的一种比较各突变株性能的方法。目前国内普遍采用的初筛 方法是“直接测定法”,即每挑出一个菌落,就要转入斜面,而后进行性z~"e-':。10定, 往往一次育种实验,至少要挑出几百支乃至上千支菌株,这需要测定几百次乃至 上千次,因此,造成工作量大、进度慢,如果有合理的初筛方法,就能够迅速淘 汰大量突变株,浓缩正变株,从而提高了整个筛选效率。酒精酵母所需具备的几 大特性如淀粉分解能力、产酒精能力、耐高温高糖、耐酒精、耐酸性等是设计初 筛方法的基础。

通常优良菌株出现机率极小,而筛选实验的误差却较大,用多级初筛将获
得优良菌株,它的原则是让分离菌株相继通过一系列筛选,每一级只选取一定百 分数的分离菌株,这样分离菌株数量便逐渐减少。因为实验准确性的提高只正比 于实验重复次数的平方。因此早期阶段需测试菌株数量是相当大的,这只能使用 较粗糙的平板筛选方法,由于其灵敏度较低,因此更趋于选用弃取低效价菌株而 不是选出高效价菌株的方法。筛选后期,供试菌株大为减少,因此可用高灵敏度 的摇瓶培养方法【431。 在工业育种中,经这些方法选育出的菌种具有生产稳定性好、实用性强、菌 种适应性强等优点。现在工厂中使用的菌株大多是采用这种方法选育的。 目前,从发酵基质中直接筛选耐高温的酵母菌是一种最经济实用的方法。在 发酵液或自然界中长期进化.使得这些酵母菌在遗传性能以及高产和耐高浓度酒 精方面相当稳定1441,国内已有许多成功的例子。钟桂芳等【421在对中科院微生物 所遗传与育种实验室保存的524株酵母菌进行筛选后,得到了耐高温酿酒酵母 G47,该菌株在45℃能良好生长,当底物浓度为10%葡萄糖时,41℃和45℃下

发酵,发酵液中酒精终浓度为分别为3.9%(v/v)和2.O%(vM,转化率分别为75%
和39%。

1.3.2.2工程菌构建 采用原生质体融合技术提高酵母菌发酵木糖产酒精的能力是有效的育种方

第一章文献综述

法之一。钟桂芳f42J以高温下发酵葡萄糖的酿酒酵母G47和木糖发酵菌株休哈塔 假丝酵母1766作为出发菌株,通过聚乙二醇(PEG)和电诱导融合等方法构建了高 温糖发酵菌株的融合亲株,该融合子F.71能在45℃下发酵木糖产酒精,其在45 ℃发酵木糖的产酒率为1.67%(v/v):与亲株相比,其酒精耐受能力也提高了 14.3%。谭强等通过对酵母细胞悬液和原生质体的诱变、筛选,选育出一株耐高 温高产菌株75L3566,其在40。C条件下,浓度为20。BX的麦芽汁培养基中,产 酒率达到1 1.5%,且发酵速度快,发酵周期缩短12h。

1.4本课题的立题依据及研究内容
1.4.1本课题的立题依据
(1)选育耐高温酵母意义重大 酒精工业用传统菌种为酿酒酵母及其变种,这些菌株的发酵温度通常为 28.35℃,当温度超过35℃,其生产和发酵能力就会大大减弱。在白酒工业,安 全度夏是普遍遇到的问题。在实际生产中,‘-经蒸煮糖化的醪液需冷却到30℃以 下才能进入发酵生产,由于酵母生产发酵是放热反应,为了控制发酵热引起的升 温.就需要消耗大量冷却水来使其降温,增加了生产成本。特别是夏季气候炎热, 地表水温度升高,消耗的冷却水就更多,发酵温度往往可达38℃以上,使工厂 难以维持正常生产”51。同时,高温使一般酵母细胞过早衰老,活力降低,并导致 杂菌繁殖,造成生产原料的浪费。因此国内外都十分重视耐高温酒精酵母的选育, 希望可以得到能在高温条件下正常发酵的菌株。耐高温酵母菌株可以在较高温度 下正常生长发酵,其合成酶与适温同类酵母菌株相比,在高温时具有更高的活性。 这样不仅可以加快生产速度,缩短发酵周期,而且也可以节约能源,降低综合成 本,提高设备的利用率。 (2)窖泥酵母群系有待研究 白酒窖泥微生物资源极为丰富,具有巨大的开发价值。以五粮液窖泥为例, 每1克老窖泥中含lO亿个以上的微生物,形成一个庞大的微生物群落,这其中 包含有丰富的菌种资源。但因技术手段落后,白酒窖泥微生物群系的结构和功能 尚未得到充分的认识,其中的微生物菌种资源也未得到充分的利用,因此有必要 保藏窖泥菌种及基因资源,建立菌种资源数据库,充分认识并利用这些菌种,不 断开发有益微生物.应用于工业生产。 (3)实验方法可行 从育种角度看,从发酵基质或自然界中直接筛选耐高浓度酒精的酵母菌是目


14

第一章文献综述

‘前获得高产酒精酵母最经济实用的方法。经过发酵液或自然界中的长期驯化,这 些酵母菌在遗传性能和高产、耐乙醇方面相对稳定,国内外都有许多成功的例子。 Bertolini等【46】从巴西的酒精厂分离得到两株既耐高渗又高产酒精的酵母菌 osmo.1和osmo-2,在30%的蔗糖糖浆中发酵,最终酒精产量分别达到19.5%(v/v) 和19.6%(v~)。曹俊峰等14列采用负染色法从甜高粱汁中直接分离出一株以甜高 粱汁为原料发酵产生酒精的酵母菌,其产量达到12.8%(v/v)。吴伟祥等【45】从木 薯粉中筛选得到一株用于木薯淀粉酒精发酵的耐温酵母,并对其形态及部分生理 和发酵特性进行了研究。该菌株可在34℃下25%木薯糖化醛中进行发酵,48h 产酒率为10.67%(v/v),可直接用于木薯淀粉的酒精生产。王瑞明等【48J从白酒 酒醅中分离得到一株酿酒酵母,最适发酵温度为35—37℃。在pH2.8时可以正常 发酵,在含水量65%的固态基质上发酵产酒率为12%(v/v),其淀粉利用率为89%。 综上所述,本实验室从某白酒厂窖池采集新鲜窖泥,期望通过分离、筛选、 鉴定得到具有耐高温、耐乙醇性质的优良酵母菌株,同时对窖泥中酵母菌系特征 进行初步研究,最后对筛选所得菌种进行发酵工艺研究,以期将其用于工业生产。

1.4.2本课题的研究内容
1.从白酒窖泥中分离出具有典型酵母菌菌落特征的菌株,通过耐高温、1]rC平 板筛选、耐乙醇三级试验筛选出性状优良的菌株。 2.通过形态观察及生理生化试验,对筛选得到的菌株进行鉴定,确定其分别属 于酿酒酵母,多形汉逊酵母,鲁氏接合酵母,耐热克鲁维酵母,粟酒裂殖酵母。 3.从分离得到的不同酵母菌种中各选1株进行特性分析,测定其最适生长温度、 最适发酵温度、最适生长pH值、最适发酵pH值、热致死温度、耐糖性、耐乙 醇性,描绘菌种发酵和生长曲线;在每株最适发酵条件下进行发酵,以产酒率为 主要指标比较各菌株发酵特性。
4.

以产酒率最高的酿酒酵母A1为发酵出发菌。对其进行发酵条件优化。将影

响因素分为培养基成分和发酵条件两组,分别进行正交试验,确定最优发酵条件 并进行发酵验证。

第二章窖泥中酵母菌的分离鉴定

第二章窖泥中酵母菌的分离鉴定

.传统白酒的酿造以泥窖窖池为发酵容器。在长期的发酵过程中,发酵糟醅产 生了种类繁多的微生物和香味物质,并慢慢向泥窖深入渗透,使窖泥成为一个由 多种有益微生物共同组成的、群微共酵的完整生物体系。窖泥中包含多种霉菌、 酵母菌、细菌,这些微生物之间互生、共生、寄生、拮抗,共同发挥发酵作用。 本实验根据立题依据.以筛选出耐高温酵母菌为目标,对从窖泥中分离出具有酵 母菌形态特征的菌种。并通过44℃生长、TTC平板筛选、10%乙醇生长三级筛选 得到目标菌种.最后采用传统生理生化反应对其进行鉴定。

2.1实验材料

2,1.1样品
白酒厂窖泥:某酒厂提供

2.1.2主要药品与试剂
药品与试剂 蛋白胨 酵母膏 琼脂粉 无水葡萄糖 氯霉素 蔗糖 硫酸钙 柠檬酸 乳糖 尿素 氯化钠 麦芽糖 鼠李糖 赤藓糖 等级 生化纯(BR) 生化纯(BR) 生化纯(BR) 分析纯(AR) 生化纯(BR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 高级纯 高级纯 高级纯
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第■章窖泥中酵母菌的分离鉴定

蜜三糖 半乳糖 木糖 山梨醇
TTC

高级纯 高级纯 高级纯 生化纯(BRl 高级纯 分析纯(AR) 分析纯(AR) 分析纯(AR) 生化纯(BR) 分析纯(AR)

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苯酚红 孔雀绿 美蓝 可溶性淀粉 95%乙醇

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2.1.3主要仪器设备
仪器 光学显微镜 型号 BH.2型 生产厂家
?OLYMPUS

恒温振荡培养箱HZO.X100 精密pH计PH3B 电子天平 双人单面净化工作台 .20℃冰箱 微波炉
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电热鼓风干燥箱DHl01 电热恒温培养箱HH.B1 25×16型血球计数板 酒精密度计 手持折光仪 目镜测微尺 镜台测微尺

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第一二章窖泥中酵母菌的分离鉴定

2.1.4培养基及试剂配制
2.1.4.1分离培养基 (1)富集培养基 麦芽汁培养基:取新鲜小麦经发芽至长度为lcm左右,晒干烘干后打粉制 麦芽粉,以l:3的比例与水混合于恒温水浴锅中加热,于55℃搅拌糖化4个h。 取糖化液5ml,加入95%的酒精20ml,充分振荡后静止放置,倒掉上清液,加 水20ml,重复振荡,加入路格式碘液1.2滴。若呈黄色则糖化完全,若呈蓝色 或褐色则糖化完全,继续于55℃糖化。将完全糖化的麦芽汁用纱布过滤至澄清, 加水稀释至10。Bx,pH自然,115℃灭菌20min。 (2)分离培养基 YEPD液体培养基:葡萄糖49,蛋白胨49,酵母膏29.蒸馏水100ml,pH4.5, 115℃灭菌20rain。 氯霉素分离培养基:葡萄糖49,蛋白胨49,酵母膏29.琼脂29,蒸馏水 100ml,pH4.5,115℃灭菌20min:使用时将培养基融化并冷却至50.60℃时,无 菌操作加入氯霉素溶液10009l,摇匀倒平板使用。 (3)初筛培养基 ”rC上层培养基:TTC0.059,葡萄糖0.Sg,琼脂1.59,蒸馏水100ml,pH6.0, 115℃灭菌20rain。培养基灭菌后,冷却至60℃左右时,加入一定量的TTC溶液, 立即倾于底层平板上。 ”rC下层培养基(YEPD固体培养基):葡萄糖49,蛋白胨49,酵母膏29, 琼脂49,蒸馏水100ml,pH4.5,115"C灭菌20rain。. (4)复筛培养基 加有杜氏小管的YEPD液体培养基,115℃灭菌20min。 (5)含乙醇lO%液体培养基 95%乙醇1.05ml,麦芽汁培养基8.95ml,用微量移液器取样后混合摇匀,115 ℃灭菌20min。 (6)保藏用培养基 斜面培养基:葡萄糖49,蛋白胨49,酵母膏lg,琼脂49,蒸馏水100ml, pH4.5,115"C灭菌20min。 2.1.4.2鉴定用培养基 (1)生孢子培养基: 胰蛋白胨培养基:NaCl0.069,CH3COONa0.59,胰蛋白胨0.259,pH6-7,

第二章窖泥中酵母菌的分离答定

琼脂29。蒸馏水100ml,115℃灭菌20min。 (2)PDA培养基:取去皮马铃薯2009,切成小块,置于1000ml蒸馏水中煮沸 lh,用双层纱布过滤成清液。加水补充因蒸发而减少的水分,加琼脂2%,115 ℃灭菌20rain。 (3)糖发酵培养基: 1259黄豆芽置于1000ml蒸馏水中,煮沸30-40min,过滤,补充水至豆芽汁 浓度为10%,pH自然,121℃灭菌30min。 (4)碳源同化培养基:
(NI-h)2S04 0.59,KH2P04 O.1 g,MgS04?7H20 0.059,酵母膏0.029,pH5—6,

琼脂29,蒸馏水100m1.115℃灭菌15min。 (5)氮源同化培养基: 葡萄糖29.KI-12P04 0.19.MgS04?7H20 0.059.酵母膏0.029。pH5-6,琼 脂29,蒸馏水100ml,115℃灭菌15min。 (6)分解尿素培养基: 蛋白胨lg,NaCl 59,KH2P04’29,酚红0.0019,用1mol/LNaOH调pH至 6.8.琼脂29,蒸馏水100ml。 尿素2.49,蒸馏水12ml。 将上述试剂分别于115℃灭菌15min,于50℃左右混合摇匀。 (7)产生类淀粉培养基: 0qI-h)2S04 O.19,KH2P04 O.19,MgS04?7H20 0.059,葡萄糖lg,pH5.6, 琼脂29,蒸馏水100m1.1 15℃灭菌15min。 (8)产酯培养基: 1009黄豆芽置于1000ml蒸馏水中,煮沸30-40rain,过滤,补充水到1000m!, 加葡萄糖59,pH5?6,115℃灭菌15rain。 (9)石蕊牛乳培养基: 脱脂牛奶100ml,2.5%石蕊水溶液16ml,pH自然,121℃灭菌15rain (10)缺维生素培养基: 葡萄糖0.Sg,MgS04?7H20
0.01 0.0079, KH2P040.01 g,CaCl2 0.0049,MgS04

g,pH5.5—6,琼脂29,蒸馏水1 00ml,

121℃,115"C灭菌15rain。

(11)耐高盐培养基: 蛋白胨19,麦芽糖29,酵母膏0.Sg,NaCllog,pH5—6,琼脂29,蒸馏水 100ml,121℃灭菌15rain (12)耐有机酸培养基: 蛋白胨19,麦芽糖29,酵母膏0.59,冰醋酸lg,pH5—6,琼脂29,蒸馏水 100ml,121℃灭菌15rain。
19

第■章窖泥中酵母菌的分离鉴定

2.1.4.3试剂 (1)路格氏碘液: 29碘化钾溶于20ml蒸馏水中,加碘19,待碘溶解后定容至300ml。 (2)生理盐水:
NaCl

0.99,蒸馏水100ml

(3)吕氏美蓝染色液: 美蓝0.39,95%乙醇30ml,0.01%氢氧化钠溶液100ml。 (4)孔雀绿染色液: 孔雀绿59,95%乙醇l 00ml。 (5)氯霉素溶液 氯霉素0.259,无水乙醇10ml。

2.1.5测定方法
2.1.5.1糖度测定 以手持折光仪测定,本章中可溶性固形物与糖度等价 2.1.5.2细胞计数(/lit球计数法) (1)检查:先镜检计数室,看是否占有杂质或菌体,若有污物用脱脂棉蘸95% 乙醇擦洗计数室,用蒸馏水冲洗计数板,经滤纸吸干水分后用擦镜纸擦干。 (2)稀释:用无菌生理盐水稀释样本,保证每格有4_5个酵母细胞。 (3)加样:将盖玻片置于计数室上,用吸管吸取稀释后的菌液滴于盖玻片边缘, 让菌液自行渗入,静置5min待细胞下沉后开始计数 (4)计数:用4×低倍镜找到计数室,转用10倍镜观察计数。按对角线方位取 左上、右上、左下、右下及中央(共5个大格、80个小格)内的细胞,重复计 数三次取平均值,按公式计算出每毫升菌液所含的酵母细胞数。
25 x 16型血球计数板计算公式:

酵母菌细胞数/毫升=(80小格内酵母菌细胞总数/80)X400×10X 1000×稀 释倍数。 测定活菌数时,在计数板上滴加美蓝染液,通过染色情况观察活细胞数量。

第二章窖泥中酵母菌的分离鉴定

2.2实验方法

2.2.1酵母菌分离步骤 样品稀释——富集培养——平板分离一一高温筛选一一TTC复筛一lO%乙 醇三筛——形态特征观察——生理生化反应——查检索表鉴定——斜面保藏 2.2.2采样
从天津市某酒厂得到白酒窖泥样本,置于磨口玻璃瓶,4"C低温保存。

2.2.3窖泥富集培养
取窖泥109,,以无菌操作加入到200ml富集培养基中,加灭菌玻璃珠.于
30℃,1

10r/min,恒温摇床培养1h.置于30℃恒温箱中静置培养24h。

2.2.4酵母菌的平板分离
●●

取10009l菌液涂布于YEPD固体平皿,于30℃培养48h,直至长出乳白色 菌落,选择具有典型酵母菌落特征的单菌落,划线分离2.3次,经镜检为纯种后 用接种针接入斜面培养基,于30℃恒温培养,长出菌落后于4℃低温保存。

2.2.5酵母菌的筛选
(1)一级筛选 高温筛选:将每株斜面菌种以相同接种量接入5支装有3m1YEPD液体培养 基的试管,于30℃100r/rain恒温振荡1h后,分别置于30℃、37℃、40℃、44 ℃、48℃下静止培养2天。 镜检:培养2天后用美蓝染色法观察液体培养基中有无活菌存在,若有则取 600I_tl接入YEPD固体平板中,在对应温度条件下培养,观察各菌株生长情况并 记录。 (2)二级筛选 TTC染色:选择菌落数为10.500的YEPD平板,倾入融化并冷却至50℃左 右的TTC上层培养基,使之覆盖菌落,待琼脂凝固后于30℃避光保存2h,随时 观察菌落颜色变化。 呼吸强度筛选:由菌落呈色的深浅来判定酵母产酒精能力的大小,选取每板 上颜色较深,形态完整的单菌落,取灭菌药匙挑开1]rC上层培养基,用接种针 挑取菌体接入YEPD斜面,置于37℃恒温培养,待长出菌落后于4℃低温保存。
2l

第_章窖泥中酵母菌的分离鏊定

(3)三级筛选 10%乙醇耐受:将菌种接YEPD液体培养基32℃活化培养24h后.按10% 的接种量接于装有杜氏小管的、乙醇含量为10%的麦芽汁培养基试管中,将菌液 摇匀,于32℃下静置,观察是否有气体生成。

2.2.6形态特征观察
2.2.6.1个体形态观察 (1)细胞形态观察: 取0.05%吕氏美蓝染色液1滴,滴于载玻片中央,用接种环挑取菌落少许, 或直接用吸管吸取菌液,加入美蓝染色液,混匀.染色2-3min.加盖玻片.于 100×油镜下观察细胞形态,观祭记录菌体形状、大小、出芽情况、芽体形态、 是否有裂殖现象等,静置30min后可以观察活菌数。 (2)细胞大小测定 使用时先用镜台测微尺标定,在4×低倍镜下记录目镜测微尺与镜台测微尺 重合刻度间的格数。目镜测微尺每格长度计算公式: 每格长度(I.tm)=(两重合线间镜台测微尺格数宰10)/N重合线间目镜测微 尺格数。 每标本上选取5.10个细胞,取平均值。 (3)酵母假菌丝的观察:: 接菌种于YEPD液体培养基,37。C活化24h,取菌液在YEPD琼脂培养基 上划线,30℃培养3d后,用接种环挑取少许,用载玻片进行观察假菌丝的形态。 (4)酵母菌子囊孢子的观察: 接菌种于YEPD液体培养基,37℃活化24h,取菌液在产孢子培养基斜面上 划线,30℃培养3d,镜检是否有子囊孢子。凡未见孢子的在30℃左右保持4— 6周,每周再检查是否出现子囊孢子。注意观察子囊和子囊孢子的形状,每一子 囊内孢子的数目,以及子是否有颜色。 (5)掷孢子的形成实验: 在PDA平板培养基上沿两个垂直直径用接种环划线接种,把接种后的培养 皿倒扣于另一个培养皿上,底层培养皿事先放一个无菌的载玻片,然后也倒入 PDA培养基。将两个培养皿扣紧,置于30℃培养3周,观察是否有掷孢子形成, 如果有,取载玻片放于高倍镜下观察,观察记录掷孢子的形态特征等 2.2.6.2群体形态观察 液体培养特性:将菌落接YEPD液体培养基37"C活化24h,观察菌体存在的

第二=章窖泥中酵母菌的分离豁定

位置,液面是否有菌膜、菌环、菌岛.底层是否有沉淀,菌液是否浑浊.培养液 颜色以及有无气泡产生,记录并列表。 固体培养菌落形态:观察菌落大小、形状、颜色、透明度、边缘、质地、湿 润程度等。

2.2.7生理生化特征测定
2.2.7.1糖类发酵试验 测试的糖类为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蜜三糖、赤藓糖。 将12.5%豆芽汁分装于含杜氏小管的试管中,121℃灭菌15rain。用无菌水 将测试的糖类配成10%的溶液,煮沸15miIl,冷却后用无菌移液管吸取一定量的 糖液分装于试管内的豆芽汁中的,使糖液浓度达到2%。再用接种环将新鲜的菌 种接入以上发酵管中,每种菌做三个平行实验,以不加测试糖、不接菌的的发酵 管作为空白对照,置于30。C下静置培养,每天观察杜氏小管中气泡量110】。 2.2.7.2碳源同化试验


测试的碳源为柠檬酸、乳糖、木糖、山梨糖、鼠李糖、乙醇。 将供试菌种接入3ml无菌生理盐水,充分摇匀,吸取1000¨1酵母悬液于无 菌培养皿中,再倾入融化并冷却至50℃左右的无碳源基础培养基,摇匀并凝固 后,置于30℃下倒置培养7h,使表面稍干。将上述碳源分别加入到无碳源培养 基平板中,用灭菌的注射器经过滤(0.209m)除菌,使其含量达到50mmol/L。 接入碳源后先正放2-4h,然后置于30℃下倒置培养24h,每种菌做三个平行实验, 以不加测试碳源的培养基作为空白对照,每天观察培养皿中是否有菌落生长【lo】。 2.2.7.3氮源同化试验 测试的氮源为硝酸钾、硫酸铵。 采用与碳源同化相同的方法。将供试菌种接入3ml无菌生理盐水,充分摇匀, 吸取10009l酵母悬液于无菌培养皿中,再倾入融化并冷却至50℃左右的无氮源 基础培养基,摇匀并凝固后,置于30℃下倒置培养7h,使表面稍干。用灭菌的 注射器经过滤(0.20pm)除菌,使其含量达到50mmoFL。接入氮源后先正放24h, 然后置于30℃下倒置培养24h,每种菌做三个平行实验,以不加测试氮源的培养 基作为空白对照,每天观察培养皿中是否有菌落生长【lo】。 2.2.7.4分解尿素试验 用接种环将供试菌接种于水解尿素琼脂斜面培养基,每种菌做三个平行实

第二章窖泥中酵母菌的分离鉴定

验,以不接菌的试管斜面作为空白对照,于30℃下静置培养,每天观察培养基 的变化。 2.2.7.5产生类淀粉试验 取产生类淀粉化合物平板培养基,用接种环在其上划线接种,每种菌做三个 平行实验,以不划线接种的培养皿为空白对照,于30℃下静置培养培养1.2周后,

待菌落生长正常时,在菌落表面及其周围滴l一2滴路哥氏碘液,观察现象。
2.2.7.6产酯试验 将产酯培养基分装于多支试管中,每支约5ml,用接种环向其内接入供试菌, 每种菌做三个平行实验,以不接菌的试管作为空白对照,于30℃下静置培养3.5d, 观察是否产生气泡。是否有香气。 2.2.7.7石蕊牛乳试验 将石蕊牛乳培养基分装于多支试管中,每支约5ml。用接种环向其内接入供 试菌.每种菌做三个平行实验,以不接菌的培养基作为空白对照:于30℃下静 置培养3.5d,观察培养基颜色变化,是否有凝固、胨化的现象【10]。 2.2.7.8缺维生素培养试验 用接种环将供试菌划线接种于缺维生素平板培养基,每菌做三个平行实验, 用酵母完全培养基划线接菌作为对照,于30℃下静置培养3.5d,每天观察各培 养基中是否有菌落生长。 2.2.7.9耐高盐试验 用接种环将测试菌种分别接于氯化钠浓度为0%,10%的平板培养基中,每 种菌做三个平行实验,其中以氯化钠浓度为O%的培养基,即无盐培养基作为对 照,于30℃下静置培养2周,观察两种氯化钠浓度培养基上是否有菌落生长。 2.2.7.10耐有机酸试验 用接种环将测试菌种分别接于冰醋酸浓度为O%,1%的平板培养基中,每种 菌做三个平行实验,其中以冰醋酸浓度为O%的培养基,即正常培养基作为对照, 于30℃下静置培养2周,观察两种冰醋酸糖浓度培养基上是否有菌落生长。

第二章窖泥中酵母菌的分离鉴定

2.3结果与讨论

2.3.1分离纯化
白酒的传统发酵生产,主要以白酒窖泥作为发酵微生物的依附介质。白酒 窖泥由多种微生物共同组成,是一个群微共酵的完整生物体系,其中包含多种霉 菌、酵母菌、细菌,这些微生物之间互生、共生、寄生、拮抗,共同发挥发酵作 用。以酒曲为例,整个发酵过程按照菌群数量关系可将发酵周期划分为3个时期, 即前、中、后期。在发酵前期(12.36h)酵母菌和细菌作为优势群类,在数量上 占据主导地位,中期(36-72h)以霉菌占优势,后期以霉菌和细菌居多…。 在培养基中添加抗生素等抑菌物质,可以干扰细菌细胞壁的生物合成,减 少菌液中细菌含量.从而提高酵母菌分离选育效率。 本试验取新鲜窖泥,模拟发酵前期阶段,当窖泥经富集培养基24h培养后, 菌群处于发酵前期,菌液以酵母菌和细菌为主,于此时吸取菌液涂布于含有可以 抑制细菌生长的氯霉素的YEPD平板,抑制细菌生长,以此提高酵母菌分离效率。 对具有典型酵母菌特征的菌落进行反复分离.镜检初步确定其符合酵母菌 细胞及形态特征。共筛选出98株样本,编号为1至98号,斜面低温保存。

2.3.2菌种筛选
2.3.2.1一级筛选
表2一l 酵母菌44℃下培养生长情况

酵母菌生长温度通常为4.30℃,最适培养温度为25.30℃,一般认定在超过 40"C条件下正常生长的菌株为耐高温菌种。 本试验中98株菌种分别在30℃、37"C、40。C、44"C、48"C五个温度梯度下 静置培养24h后,美蓝染色法镜检发现:菌液中活细胞率随温度升高而降低,30 ℃和37℃下绝大部分菌株的菌液中均有活菌存在,40℃和44℃有部分菌株有活

第=章窖泥中酵母葡的升离鉴定

菌存在.而48℃染色后无明显活细胞特征静置30mhl后镜检结果投有变化, 选取4.4"C液体培养基中培养24h的菌株接入YEPD同体平板培荐,仍在“℃下
恒温培养.结果如表2-1.98株酵母茁中有43株能茌“℃条什F的YEPD平板 长出菌落.其中1 8栋生长迅速.能在24h内长出酵母茁典型菌落有30标莆落 较多(N>50)。

根据本文立题依据,选取能耐受“℃.发酵速度较快、能在2411能生长出肉
眼可见媳型酵母菌落的18株苗株进入下一轮筛选。
2.3 2

2二级筛选 红四氮唑(2.3.5——氯化苯基四氟唑.简写做TIC)是一种是脂溶性光敏

复合显色指示剂.原本无色.但其可被活苗中的脱氢酶还碌成竹色的TF使卓 饭上原先看不太清楚的微小茁落驰成肉眼清晰可见的红色菌落。同时通过呈色的 深i戋可判断酵母呼吸酶活力的大小以及酵母产酒精能力的高低。产酒精能力强的 酵母菌种会显现呈探红色.次之显糟红包,微红色或不显色””. 生产用洒精酵母经若干代的转接保藏.往往含出现酵母生产性能的衰退或酵

母细胞性能良莠不齐等现象经过TTc显色平扳筛选樽到的酵母细胞个体大、
大小均一、形状规则统一.呈长卵圆形,出芽车高.生长快.死亡翠鞍低,在同

样的发酵条件下,它的发酵速度更快.耐;酉精、产酒精能力更强,并且成品酒酒 精度较高,残糖低。氰基氮选到优衄产品要求.口味酵厚唧l。在实际生产中选用 Trc进行呼吸强度筛选,可提高酒精酵母的分离选育效率,降低实验成本。

在初筛所得菌种的YEPD固体平板上倒入玳上层培养基,经37"C避光2h
后.观察苗落颜色,如图2-1所示。挑选颜色较深的菌落接入斜面,共得18抹, 按照AI.A2、A3 A18对其进行编号。

圉2.1酵母茁落TTC靳色结皋 2.3 2 3三级筛选

将二级筛选所得菌种接于含有10%70酵的壹芽汁培养基.每12h观察是否
26

第■章窖泥中酵母菌的分离鉴定

有气体生成,结果如表2.2所示。
表2.2含10%乙醇液体培养基产气结果 菌株
12h 24h 36h 48h 60h



+ + 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 + 一 一 一 一

+ + + 一 一 一 一 一 一 一 + 一 一 + 一 一 + 一

+ ++ ++ 一 + 一

+ + + 一

舵 躬 M 筋 M 们 熊 肿

¨
一 + 一 一 一 + 一 一 + 一 一 +


¨
一 + 一 一 +

¨
+ + 一 一 + + 一 一 + 一




¨
一 一 + 一 一 十 +


三耋

川 ;耋 舶 卅


十+ +

注:根据杜氏小管中产期多少分为5个等级

。抖什”表示杜氏小管中充满气体

“卅”表示杜氏小管中充满3/4气体
‘++”

表示杜氏小管中充满1彪气体
表示杜氏小管中充满l/4气体 表示杜氏小管中没有气体

。+”

“一”

由结果可知,共有12株可以在10%乙醇浓度下生长,6株不能生长。从产 气速度看,接种12h后即产气的菌种有3株(A1、A2、A14),接种24h后产气 的有3株(A3、A11、A17),36h后产气的有3株(A5、A7、A18),48h后产 气的有l株(A10),60h后产气的有2株(A6、A16);从产气量看,产气量达 到1/2小管的菌株有1株(A5),其余10株产气量均为1/4小管。 白酒窖池本身即为乙醇发酵容器,窖泥中的酵母菌长期处于乙醇环境中,对 其有一定的耐受性。同时根据文献可知,对乙醇有较强耐受力的菌种也具有较强

第■章害泥中酵母曲的分离壤定

的羁耩发酵能力。本实验用古10%乙醇的培养基进行产气试验.综合考虑产气速 度种产气量。选定可以正常靛酵产气的10栋菌AI、A2.、A3、A5、A7、A10、 A1I,A14.A17、A18进入下一节鉴定实验。A6、A16虽然也能正常发酵.但 其起酵时间过长,在接种60h后才有气体生成.且产气量较低.不能满足筛选需 要,故将其舍弃。本实验中各菌种产气量均较低.分析原因可能是由于培养基含

糖量不足.同时培养基中的乙醇抑制了酵母菌的正常代谢。
综上所述,经过三级筛选.从98株具有典型酵母茁菌落特征的菌株中.选 出AI、A2,A3、A5、A7、A10、A11,A14,A17,A18共10栋菌株进行鉴定。

2.3.3菌株鉴定
2.3

3】形态殛培养特征

、1)培养特征

各稿株液体培养特征相似,均无菌醭、苗岛.试管底部有白色絮抗沉淀:平
扳菌落大多呈圆形,直径l-4mm.白色或乳白色.奶油状,不透明.表面光滑. 粘稠.有发酵的香气.其中A】、A3、A7,A10、A11、A14、A'17菌落直径2-4ram, 茁落表面千燥有褶皱.边缘不整齐:A2、A18落直径O

5.1衄,表面光滑而湿润,

低凸起,边缘整齐;A5直径I-2mm.表面光滑而湿润.边缘整齐。 (2)细胞特征 由表2-3可知,各菌株细胞里分别呈卵圆形、椭圆形和柠禳形,太小2~6pm
×4

5~20txm.多采用芽殖.只观察到少量子囊孢于.来观察到假茁丝。如图2-3

所示.分别为AI、A5、A7、AII、A18五株菌的美蓝染色结果。A5可吼观察到
比较孵显的裂殖现象。

一呔?'
,崾
A5

圈2-2酵母苗AI,A5美蓝染色结果

第■章窖泥中酵母苗的分离鉴定

萄g

细胞形状

太小,lIm

繁殖方式

有无假菌丝

子囊艳子数目

23

32生理生化试验
根据根据J

A巴尼特《酵母菌的特征与鉴定手册》㈦.对10株菌进行

生理生化试验,包括糖发酵试验、碳源同化试验、氪源同化试验、代谢试验等。
结果如表2.4,表2-5.表2-6所示。

第■章窖泥中酵母菌的分离鉴定

表2-4酵母菌的生理生化试验鉴定结果——碳源同化及发酵

(注:表中“+”代表阳性反应,“一”代表阴性反应)

结合菌株的形态学及生理生化试验鉴定结果,查阅J.A.巴尼特.《酵母菌 的特征与鉴定手册》【121检索表可以得出:A1、A3、A10、A17为酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae),A2、A18为多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha),
Al

l、A14为鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxil),A7为耐热克鲁维酵母

第_章窖泥中酵母菌的分离答定

(Kluyveromyces thermotolerans),A5为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces

pombe)。分别选出A1、A5、A7、A11、A18五株菌株进行下一章种群特性试验。

2.4小结

本章实验以白酒厂窖池的新鲜窖泥为研究对象,分离、筛选并鉴定出具有一 定优良特性的酵母菌株。 经麦芽汁富集及氯霉素.YEPD培养基选择性培养.从窖泥样本分离出具有典 型酵母菌菌落特征的菌株98株.通过44℃生长实验、T1℃平板筛选、耐10%乙 醇实验三级筛选后.最终得到10株菌株。在对其菌体形态、固体液体培养特征、 生理特征、生化反瘦等特性进行研究后,将这10株菌种初步鉴定为酿酒酵母
(Saccharomyces cerevi

siae),多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha),鲁氏

接合酵母(Zygosacchal’omyces rouxiI),耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。选出A1、A5、 A7、A11、A18五株菌株进行下一章种群特性试验。 本实验目标在于筛选出对高温、乙醇有一定耐受性的酒精酵母,故仅从耐温 性、耐乙醇性两个角度进行菌种筛选,而白酒窖泥作为一个完整的微生物平衡体 系,包含种类繁多特性各异的酵母菌和其他微生物,要了解其群系组成及相互关 系及影响,尚需进行深入研究。

第三章窖泥中酵母菌生长特性的研究

第三章窖泥中酵母菌生长特性的研究

白酒窖池是一个群微共酵的生物体系,各菌种协同代谢共同作用生产出具有 特殊风味的白酒。其中乙醇的发酵主要依靠酵母菌完成。本实验自酒厂窖池池窖 泥中分离到了大量酵母菌,并通过多级筛选选育出具有优良耐热特性的菌株,鉴 定出其分属5个不同的种。为研究窖泥中耐高温酵母菌的群系特征,本章从A1、 A5、A7、All、A18这5个种菌株的性质入手。通过温度、pH及耐性实验确定 不同种酵母菌各自的最适发酵条件。分别并在其最适发酵条件下进行酒精发酵. 从而筛选出具有最强产酒精能力的菌种。

3.1实验材料

3.1.1菌种 酵母菌株:自行分离菌株,本实验室从某白酒厂发酵池窖泥中分离获得。 编号分别为A1、A5、A7、A11、A18。 3.1.2主要药品与试剂 蛋白胨,酵母膏,麦芽,葡萄糖,次甲基蓝,标准葡萄糖液 3.1.3主要仪器设备 721型分光光度计、蛇形蒸馏管、水浴装置,血球计数板,电子天平 3.1.4培养基及试剂配制 YEPD培养基,麦芽汁培养基

3.2实验方法
3.2.1测定方法

32

第三章窖泥中酵母菌生长特性的研究

3…2



1酒精含量测定(蒸馏.乙醇计法) 用干燥100ml容量瓶,准确量取发酵液(液温20℃)100ml于500ml蒸馏瓶,

用50ml蒸馏水分三次冲洗容量瓶.洗液并入蒸馏瓶。加入玻璃珠数粒,连接蛇形 冷却管,用前述取样用100ml容量瓶做接收器(外加冰浴),开启冷却水缓慢加 热蒸馏,控制蒸馏速度,使蒸馏在30-40min内完成。收集馏出液,当接近100ml 刻度时,取下容量瓶,盖塞,于20℃水浴中保温30min,再补加水至刻度,混匀 备用。 将蒸馏后的样品倒入量筒中,将洗净擦干的乙醇计缓缓沉入量简,静止后再 轻轻按下少许,待其上升静止后,从水平位置观察其与液面相交处的刻度即为乙 醇浓度,同时测定温度.按测定的温度与浓度.换算成温度20℃时的乙醇浓度(%)

3…2

1 2

CO!失重量测定

发酵过程中,酵母菌代谢糖产生乙醇和co:。CO:不断排出,使发酵液的重 量减轻,因此可以根据发酵过程中发酵液的失重量来考察发酵的速度与程度。在

发酵前测定发酵瓶的重量,发酵开始后定期测量重量并计算差值:以100ml发酵
液计,当12h内失重量小于0.19lFj即可认为发酵结束,此时总失重即为发酵过程 中CO:失重量。 3.2.1.3斐林标定 吸取斐林甲乙液各5ml,置于250ml=角瓶中,加10ml蒸馏水,并从滴定管 中预先加入约19m10.1%的标准葡萄糖液(保证滴定时葡萄糖液在lml以内),摇匀 后于电炉上加热至沸,并加2滴1%的次甲基兰,然后保持微沸,以4秒左右一滴 的速度滴定至蓝色消失,此时溶液显淡黄色,读取消耗葡萄糖液的体积。 3.2.1A生长曲线测定 (1)血球计数板法:见2.1.5.2。此方法操作简便但测定结果误差较大。 (2)菌落计数法:取0.1ml菌悬液,用平板倾注法做菌落计数,以培养时间为横 坐标,菌落数的对数为纵坐标绘图,能真实反映活菌增殖情况,但工作量较大 (3)OD值法:用721型分光光度计在可见光波长下以空白培养基为参照,每 隔一段时间从培养基中取出适量菌液测定其OD值。以培养时间为横坐标,OD 值为纵坐标绘图。本实验采用此种方法。用721分光光度计,在590rim下以YEPD 液体培养基为空白,每2h取菌液测定OD值(比色皿厚度为lem)。以培养时间为 横坐标,OD值为纵坐标绘图。

第三章窖泥中酵母菌生长特性的研究

3.2.1.5总糖测定 采用手持折光仪(O一30%)测定发酵液中总糖。 3.2.1.6还原糖测定 采用直接滴定法测定发酵液中还原糖。

3.2.2温度对菌种特性的影响
3.2.2.1最适生长温度 将菌种接种于YEPD液体培养基,37℃下活化24h后.转接于YEPD液体 培养基,接种量1×10 7cell/ml,分别在不同的温度(32℃、34℃、36℃、38℃、 40℃、44℃、46。C、48"C)下静置培养,pH自然,24h后进行血球板计数。 3.2.2.2最适发酵温度 将菌种接种子YEPD液体培养基,37℃下活化24h后,转接于含糖量为10%

的麦芽汁培养基,接种量1×10 7cell/m1.分别在不同的温度(34。C、36℃、38℃、
40。C、44"C)下静置培养,pH自然,测量酵母菌的C02失重量。待发酵完全后 测定发酵液酒精度。 3.2.2.3热致死温度 将菌种接种于YEPD液体培养基,37。C下活化24h后分别置于48"C、50℃、 52℃、54℃、56℃下水浴5min,然后立即取出并放入冰水中冷却。冷却后每支 试管取6009l涂布于YEPD平板,37。C下静置培养,观察菌落生长情况。
3.2.3

pH对菌种特性的影响

3.2.3.1最适生长pH值 将菌种接种于YEPD液体培养基,37"C下活化24h后分别接于pH不同 (pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的YEPD液体培养基,接种量1


107cell/ml,37*(2静置培养,24h后进行血球板计数。


3…2

2最适发酵pH值 将菌种接种于YEPD液体培养基,37。C下活化24h后分别接于pH不同

(pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)含糖量为10%的麦芽汁培养基, 接种量l


107cell/ml,37"C静置培养,测量酵母菌的C02失重量,待发酵完全后

第三章窖泥中酵母菌生长特性的研究

测定发酵液酒精度。

3.2.4菌种耐受性试验
3.2.4.1耐糖性 将菌种接种于YEPD液体培养基,37℃下活化24h后分别接于不同糖度 (10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)的麦芽汁培养基,接种量 1×107ceU/ml,37。C静置培养,测量酵母菌的C02失重量,37"C静置培养,测量 酵母菌的C02失重量并记录起酵时间,待发酵完全后测定发酵液酒精度。 3.2.4.2耐乙醇性 将菌种接种于YEPD液体培养基,37℃下活化24h后分别接于含不同浓度 (1050、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)乙醇并装有杜氏小管的麦 芽汁培养基试管中,接种量1


107celFml,37。C静置培养,观察其产气情况。

3.2.5发酵试验
根据3.2.2和3.2.3试验所得结果,将活化后菌种接于糖度15%的麦芽汁培养 基,接种量10%,分别在各菌种最适发酵温度和最适发酵pH下进行3TC静置发 酵。测量酵母菌的C02失重量,待发酵完全后测定其酒精度、还原糖、总失重 量、pH。

3.3结果与讨论 3.3.1温度对菌种特性的影响
微生物的生命活动是由众多生物化学反应组成的,通过调节外界环境因素如 温度、湿度、气压等即可在一定程度上调控微生物的活动。在这些因素中,温度 起到相当重要的作用,是影响微生物生长繁殖的最重要因素之一。 在一定的温度范围内,机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增加。 温度上升到一定程度,则开始对机体产生不利影响,如再继续升高,则细胞功能 极具下降以至死亡。与其他生物一样,任何微生物的生长温度范围尽管有宽有窄, 但总有最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这3个重要指标,这就是生 长温度的三基点。最适生长温度是指某微生物群体生长繁殖速度最快的温度,代 时也最短。但它不等于发酵的最适温度,也不等于积累代谢产物的最适温度,更 不等于积累某一代谢产物的最适温度。在较高温度条件下,细胞分裂虽然较快,

第三章害泥中酵母茁生长特性的研宄

但维持的时间不长,容易老化。相反.在较低温度下.细胞分裂较慢.但维持时 间较长,结果细胞的总产量反而较高吲。同样.发酵速度与代谢产物积累量之问
也有类似的关系。

对于白酒发酵的实际生产,最低生长温度意义不大,而最适生长温度和最适
发酵温度剐关系到生产效率和产品品质,

33L1量适生长温度 在不同的温度下用YEPD液体培养基中培养酵母,24h后得到各菌株细胞数.
结果如图3-1。

30

32

34

36

38

40

42

44

46

48

温度(℃)
图}1不同温度对酵母菌细胞生长的影响

最适生长温度是指细胞的最高生长率所需的温度.在此温度下能获得最大 的细胞量.且与细胞生长中相关的酶活性最高。根据2 3上3结果.这5槔菌在 24h后都开始发酵产气.故选择培养24h后进行计数。由图3-1可知,AI、A7、
A1l、AI¥最适温度集中于36-38"C左右,分别为Al,36℃;A7t 37"C:A11,

36'C;A18,36'C;而A5最适温度略高,在38"C左右。而在相同温度下培养2Ah

后,A1细胞数始终高于其他菌株,m内可达到5×107枷.AS细胞散最低,
3.3.1.2最适发酵温度 在不同的温度下用含糖10%的麦芽汁培养基培养酵母.待发酵结束后测定酒 精度,结果如图3-2。

第三章窖泥中酵母苗生长特性的日R

87

;:

i:
畦;
0 30

32“36

38鲫42 温度(℃)

44

46

48

圈3-2不f目温窿对酵母菌蕞醪的髟w

最适技酵温度通常为一个温度范围.在此温度范围内莳种的发酵代谢产物量
最高。本实驰以酒精度作为麓酵程度的衡量标准,南嗣3-2可钿.各菌株最适发 酵温度基本集中在34.36"C.低于最适生长温度:萁中AI,A5、A7在34-36"C

发酵酒精浓度相差不大.其酒精度最高舒别为64%,4

9%.5蛳,AII、A18

在32.36"C酒精度近似,其酒精度最高分别为6 2%.47%:而当温度提高到38
℃左右时.各菌株糟精度开始下降.分析廪圆可能是高韫加遮了蕴种老化,使稳 定期缩短.菌种提前进入衰亡期,同时长期处于高温环境.发酵液中酒精不断挥 发使酒精度下降。但考虑到在高锰条件下.酵母苗发酵速度较快.能提高效率节 省时问+因此在发酵酒精度相同条件下.选择温度范围上限作为展适发酵温度, 综上,AI、A5、A7、A11、A18最适发酵温度分别为36℃、34℃、36℃、36℃
和36℃。

33.13热致死温度
对菌株进行热致死处理,将蓖液涂布于固体平板.通过观察菹落生长情况判 断其热致死温度.结果如表3-I。
表3-1*同荫株的热虫死强度 菌株
48℃ 50"C 52"C 54"C 56"C

死亡盎度(℃

Al 8











(注:表中。+”代表平扳育苗落生长…’代表无菌落生长}



通常将能在10rain内杀死微生物的温度称为致死温度。不同类群、不同菌株

第三章窖泥中酵母酋生长特性的研宄

甚至不同菌龄微生物的细胞抗热性均不相同。大多数酵母苗营养细胞的致死温度 为55—60℃,因而在牛奶、饮料和酒粪生产中.多采用62—65*C30min威70℃15min 的巴氏消毒法.本实验通过热致死实验避一步探究各菌株的耐热特制- 测定热致死温度时,由于热休克作用,顽在实验结果的最高生长温度上提高 卜2℃作为热致死温度。本实验在结果上提高2"C。由表3 1可知,各菌株的热 致死温度接近,分别为孔℃、56℃,54℃、56℃,54℃,其中^_和Al】热致死

温度相对较高,耐热性也相应较高,与晟适生长温度趋势基本一致。
3.3.2

pH值对菌种特性的影响

培养基的DH值对酵母的生缸活动有重要的影响.溶液中的氢离子能改变菌 傩细胞原生质膜胶体的电荷.当氢离子浓度拄生变化,原生质膜对某些物质和离 子的遁透性也随之变化,影响细胞对营养物质的吸收和利用”“

与温度的三基点相似.不同微生物的生长邮也存在最低、最适与最高3十 数值,在最适pH值范围内微生物生长繁殖速度最快.在最低或最高DH值的环境 中.微生物虽能生存和生长,但生长非常缓慢而且容易死亡。酵母茁晟适州值 大多在5-6Z间。对于授酵工业面言.通过调节环境pH加快酵母茁生长速度、
增加代谢产物积景.具有十分重要的意义。 3.3.2.1最适生长口H健

在不同的口H值下用YEPD渡体培养基中培养酵母,24h后得到各菌株细胞
数.结果如图30。

.80 g 70





4050畛1
60


30

…’


自z0 t 10





忿
5 5 5 5



A5

A11



















DH值
囤3-3不同pH对酵母菌细胞生长的髟响

在pH值2-8的范围内,酵母菌都能保持生命活动.但一般酵母生长的最适 州值范围为4
8-5

0。由图3-3可知.各菌株最适生长pH值集中与4 5-5 5之

第=章窖泥中酵母苗生长特性的研宄

问.基本符合酵母蓖生长规律,其中A1、A5最适生长口H值在5 5左右.而^7、 A11、k18在偏酸环境下生长更好,最适生长pH值均为4 5。同时pH对各菌株生 长影响显著,吼AI为例OH5 5时其细胞数约为其他pH值条件下的2到3倍, 由此可毗推断培养基pH值也将明显影响到发酵效率,

3.3.20最适发酵pH位 在不同的pH值下用含糖10%的麦芽汁培养基培养酵母,待发酵结束后测定
酒精度.结果如图34。

8 7

;6





:4 世3

罄2



3 3 5 4 4
















DH值
圈34不_司pH对酵母苗发酵效应的影响

由图3-4可知,备菌株最适发酵pH值集中于4

5-5

5之间.与最适生长pH

值基本一致,其中Al、蛎最适pH值为5 5,A7、A11为4 5,k18为5 0。从产

酒率可知,最适洲值可队促进产霭率提高,^1./111的酒精度分别达到5


7哺

8%。但其对发酵的整体影响比温度小,各pH下酒精产率的差距减小。

3.3.3菌种耐受性研究
培养基成分对菌种生长及代谢有重要影响。在实际生产中.常常需要菌种
能够耐受特殊的环境。如在诔醪发酵中.需要菌种在生产能力高的同时+还能够 耐受高糖高乙醇环境.以便在高糖醪渣(可溶性同形物1 80/0PA E)中起酵,生产

高浓度乙醇:在果酒发酵中,通常需要菌种能够耐受果汁原料的酸性环境,防止 果汁被氧化啪3q。本实验选取耐糖性和耐乙醇性两十角度.分别研亢五个酵母菌 种的特性。
3.3.3l耐糖性

用含糖浓度不同的麦芽汁培养基培养酵母,涮定起酵时间,待发酵结束后测

第三章窖泥中酵母菌生长特性的研究

表3.3不同糖浓度F酵母菌的发酵特性(2)

在传统酒精发酵过程中,醪液中可溶性固形物含量在10-12%之间,此时酵母 能够充分利用糖类,产酒率最高。本实验以麦芽糖作为碳源,初始糖度以总糖计。

第三章窖泥中酵母菌生长特性的研究

由表3-2可知,各菌株可以耐受60%左右高糖,在糖浓度10一20%之间发酵酒精度较 高,A1、A5在糖度15%时酒精度最高,A7、A1l为20%,A18为10%:当糖度高于40% 时,发酵明显受到抑制,酒精度降低为最高点的1,72左右;当糖浓度为70%时,各 菌株基本都停止发酵。同时随着糖浓度增加,各菌株发酵产生的乙醇对菌种细胞 代谢产生抑制作用,起酵速率也随之变缓。 综上所述,本实验筛选的酵母对高浓度糖的耐受性不强,在总糖为15%左右 的麦芽汁培养基中产酒精能力较强。本实验考虑欠缺的一点在于未能同时测定还 原糖浓度,这样无法辨别出在糖浓度10—15%的范围内,当酒精度随糖浓度增加时, 糖的利用率是否随之增加。 3.3.3.2乙醇耐受度 用含不同浓度乙醇的麦芽汁培养基培养酵母,观察产气情况判断菌种耐乙醇 性,结果如表3.4。
表3-4不同乙醇浓度下酵母菌的发酵特性

乙醇是酵母发酵的重要工业产物,但对酵母细胞本身又是毒素和抑制荆。菌 种对乙醇的耐受度与产酒率密切相关,可以将其作为筛选高产酒精酵母的一个参 考依据。本论文在2.3.2.3中采用耐10%乙醇试验作为标准,进行菌种进行过筛 选。由表3-4可知,这5株菌均能耐受10%的酒精度,其中A1和A11能在含乙 醇14%的培养基中发酵,说明Al、A11两株菌种可能具有较强的产酒能力。 与其他文献相比,作为筛选自白酒窖泥的酵母菌,本实验菌种乙醇耐受性不 高,分析原因可能是以起酵产气而非菌种生长作为标准。酵母发酵需要的环境条 件比生长条件更加苛刻p引。

3.3.4最优条件发酵试验
每株菌株的特性各不相同,对生长和发酵的环境要求也有区别,只有在最适 的发酵及生长条件下才能发挥最大的发酵能力。通过实验3.2.2,3.2.3,3.3.4 确定了分属于酿酒酵母、异形汉逊酵母、鲁氏接合酵母、耐热克鲁维酵母和粟酒
4l

第三章窖泥中酵母菌生长特性的研究

裂殖酵母这5个种的酵母菌的生理及发酵性能,其最适发酵温度和pH分别为: A1:酿酒酵母.36℃,pH5.5i A5:栗酒裂殖酵母.34℃,pH5.5: A7:耐热克鲁维酵母,36℃,pH4.5: A11:鲁氏接合酵母,36℃,pH4.5; A18:多形汉逊酵母,36℃,pH5.0; 分别在各菌种最适发酵温度和pH值下,将菌种接于糖度15%的麦芽汁液体 培养基,接种量10%,进行静置发酵,测量酵母菌的CO:失重量并记录起酵时间, 待发酵结束测定其酒精度、还原糖、总失重量、pH值,观察发酵液沉淀情况。 结果如表3.5。
名(3-5最适条件下酵母鞠的发酵特悔

由表3—5可知,发酵结束后Al和A18的酒精度最高,为6.3%,其次是A18、 A7和A5,分别为6.2%、6.o%和5.8%:各菌株均为下面发酵,发酵结束后瓶底有 白色泥状沉淀:起酵时间I-2天;发酵周期5-8天,其中A5发酵周期最短,为 5天。Al、A11、A18酒精度接近,但由3.3.3可知A1对乙醇、高糖耐受性更强, 故选择A1作为发酵菌种,进行发酵条件鉴定。本试验中最适条件下产酒率并没 有超出其他条件的实验结果,可能是由于本实验涉及的两个指标温度和pH值并 非影响酵母菌发酵产率的最重要因素,还需要进行更深入的研究。但本试验的条 件相对其他筛选方法而言,已经排除了一些影响因素,相较之下准确性更高,可 以确定A1菌株(酿酒酵母)具有更好的耐热、高产性能。

3.4小结

白酒窖泥含有大量微生物,其中包括多种酵母菌。由于长期处于高温发酵条 件,这些酵母菌通过自然驯化筛选而获得了一定的生长及发酵特性。本章对从窖 泥中分离得到的分属五个不同种的酵母菌进行了进一步的特性研究。

第三章窖泥中酵母菌生长特性的研究

首先对5株酵母菌进行性质研究,通过最适生长温度及pH值、最适发酵温度 及pH值、耐高糖、耐乙醇实验,描绘了菌种发酵和生长曲线,同时分析并比较 窖泥这一特殊微生物体系中酵母菌群系的特征,实验发现,由于分离自酒厂窖池 窖泥,这5株菌都具有较好的耐温性,在36℃左右产酒能力最强,最适发酵pH值 4.5—5.5,能耐受10—14%的乙醇以及60-7096的高糖。在确定各菌株的最适发酵温 度和pH值后,对这5株菌分别进行发酵试验,以产酒率为主要指标比较各菌株的 发酵特性。其中酿酒酵母A1以10%的接种量接于含糖15%的麦芽汁培养基,pH值 5.5,于36℃静置发酵,发酵液酒精度为6.3%。经过综合考虑,选定A1作为发酵 菌种,进行发酵培养基和发酵条件优化。 本实验的目的在于探索白酒窖泥这一特定环境中不同种酵母菌的性质特征, 由于时间所限,仅从温度、pH值、耐糖、耐酒精这几个方面来进行了简单的测 定。而要完全弄清窖泥中酵母菌的群系关系,还需要以更多的酵母菌株为研究对 象,全面测定菌种特征参数,建立完整的酵母菌体系,从整体进行深入研究。

43

第四章酵母菌发酵条件的优化研宄

第四章酵母菌发酵条件的优化研究

在实际的发酵生产中,能够影响发酵效率的因素主要来自于三个方面:菌种、 底物和发酵条件。要得到高产率的发酵产物,就必须以培育高产优良酵母菌种、研 究最适培养基和发酵条件为目标。本实验已筛选得到了具有一定耐高温特性的优势 酒精酵母Al,本章通过单因素实验及正交实验设计,对发酵培养基及发酵条件进 行优化,以此提高酒精发酵率,为以后的发酵生产和扩大试验提供理论依据。

4.1实验材料

4.1.1菌种
酵母茵菌A1:自行分离菌株,从某白酒厂窖池窖泥中分离筛选获得。

4.1.2培养基
玉米醪液培养基:玉米粉:水=l:2,于50"C搅成粉浆,混匀后静置30min。 以玉米粉含淀粉60%计加a一淀粉酶(15u/g淀粉),搅拌并加热至90"C,糖化15rain, 取出并冷却至60"C,加入糖化酶(100u/g淀粉),保温糖化12h,离心分离(4000r/rain, 15rain),滤出清液,用少量蒸馏水洗涤残渣两次,合并清液,灭菌即得醪液。pH 自然,加无菌水,用折光仪调节糖度后待用。

4.1.3主要材料及试剂
a.淀粉酶:上海生物工程技术服务有限公司 糖化酶:上海生物工程技术服务有限公司 抗坏血酸,酵母膏,葡萄糖:天津科密欧化学试剂开发中心 玉米粉购自市场

4.1.4仪器设备
见2.1.3和3。1.3

第四章酵母菌发酵条件的优化研究

4.2实验方法 4.2.1酒精发酵的工艺流程及酵母菌活化
4.2.1.1酒精发酵工艺流程

原料加水一一加0【.淀粉酶——保温液化一一冷却一一加糖化酶一一保温糖化 ——离心灭菌——得到玉米醪液——接入酵母菌活化液发酵——蒸馏——乙醇
糖度调整:酵母菌可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等,在玉米醪液中,糖度即 可溶性固形物含量,由手持折光仪测定。在酒精发酵过程中,糖是生成酒精的基质 ,对糖度达不到要求的培养基,可以添加蔗糖,葡萄糖、淀粉糖浆等加以补足。本 试验选择将葡萄糖制成糖浆后加入。 4.2.1.2酵母菌的扩大培养 从斜面上挑取一环酵母菌,接于10ral麦芽汁培养基,于37℃下lOOr/min摇床培 养24h,接入装有lOOml麦芽汁的三角瓶中,于37℃下lOOr/min摇床培养12h,接入 500ml麦芽汁三角瓶中,37℃静止培养12h,镜检计数,当酵母菌达到1×lOVcell/ml 以上时低温保藏备用。 4.2.2培养基成分优化 4.2.2.1氮源单因素试验 在玉米醪液中分别加入质量分数0%(空白项)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.096 的酵母膏,按10%接种量接入扩培酵母液,置于37℃下静止培养,测量酵母菌的CO。 失重量,待发酵完全后测定其酒精度。 4.2.2.2维生素单因素试验 在玉米醪液中分别加入质量分数0%(空白项)、0.05%、0.1%、0.15%、0.20% 、0.25%的抗坏血酸,按10%接种量接入扩培酵母液,置于37℃下静止培养,测量酵 母菌的C02失重量,待发酵完全后测定其酒精度。 4.2.2.3糖度单因素试验 在玉米醪液中加入含糖量80%左右的葡萄糖浆,将玉米醪液糖度分别调至12% 、14%、16%、18%,按10%接种量接入扩培酵母液,置于37℃下静止培养,测量 酵母菌的C02失重量,待发酵完全后测定其酒精度。

45

第四章酵母菌发酵条件的优化研宄

4.2.2.4正交试验设计 在以上单因素试验的基础上,对酵母膏(A)、抗坏血酸(B)、糖度(C)进行3因素3 水平正交试验,以酒精度(%)作为指标,采用L9(34)正交试验设计。

4.2.3培养条件优化
4.2.3.1温度单因素试验 在玉米醪液中分别接入12%扩培酵母液,分别在不同的温度(32℃、34℃、36℃、 38℃、40"C、42℃、44℃、46℃)下静置培养,测量酵母菌的C02失重量,待发酵 完全后测定发酵液酒精度。
4.2.3.2

pH值单因素试验

在玉米醪液中分别接入12%扩培酵母液,分别于不同pH值(pH3.5、4.0、4.5、 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)下37℃静置培养,测量酵母菌的C02失重量,待发酵完 全后测定发酵液酒精度。 4.2.3.3接种量单因素试验 在玉米醪液中分别接入8%、10%、12%、14%、16%扩培酵母液,置于37"C下 静止培养,测定酵母菌的C02失重量及发酵液的酒精度,直至发酵结束。 4.2.3.4摇床速度单因素试验 在玉米醪液中分别接入12%扩培酵母液,在37"C下分别以静止发酵和摇床发 酵(40rpm、80rpm、120rpm)方式恒温培养在培养箱中发酵,测定酵母菌的C02 失重量及发酵液的酒精度,直至发酵结束。

4…2



5正交试验设计 在单因素试验的基础上,对发酵温度(A)、pH值(B)、接种量(C)及摇床速度(D)

进行4因素3水平正交试验,以酒精度(%)为指标,采用L9(34)正交试验设计。
4.2.4发酵条件验证
根据4.3.1和4.3.2的正交结果,在玉米醪液培养基中添加酵母膏0.4%,抗坏血酸 O.18%,将醪液糖度调整为14%,pH值5.0,将Al菌种接于培养基,接种量16%,温 度38"C,以30r/min的速度摇床培养,每2h取样一次,以空白玉米醪液作为参照,在

590衄测定OD值,发酵结束后测定酒精度。

第四章酵母菌发酵条件的优化研究

4.3结果与讨论 4.3.1培养基成分优化
目前对于微生物发酵培养基组分的优化,多采用单因素多水平优化及正交试验 设计。通过单因素试验获得各因素最佳水平的范围,在此基础上设计正交试验,同 时考虑各因素及水平,寻求最佳因素水平组合。 查阅有关文献【5¨,发现酵母酒精发酵中,通过添加脂类、蛋白质和维生素等补 充物可增进酒精发酵,提高最终酒精浓度。本实验对氮源、维生素、糖度这三个因 素进行单因素试验,对培养基进行优化。 4.3.1.1酵母膏对发酵结果的影响 氮源是组成酵母菌核酸和蛋白质的重要元素,对微生物的生长发育有着重要作 用。生产酒精时,玉米醪液中的淀粉被糖化降解为单糖,但玉米富含的蛋白质仍以 大分子形式存在,不能被酵母菌直接利用【5门。本试验在玉米醪液中加入酵母膏,对 其发酵影响作了研究,结果如下。
6 6 6 6 6 5 4 3 2 1 6 5 5 9 8 O 0.2 0.4 0.6 0.8 1

一孚一莓『器蜒

酵母膏含量(%)
图5—1

酵母膏含量对酒精发酵的影响

由图5.1可知,在玉米醪液中加入酵母膏,能够提高酒精产率。当添加量低于 0.4%时,产酒率随添加量的增加而提高,当添加量大于0.4%时,产酒率基本不变, 分析原因可能是由于接种量导致的氮源饱和,同时考虑到生产成本,选择酵母膏最 佳添加量为0.4%。 4.3.1.2抗坏血酸对发酵结果的影响 查阅文献可知【58】,在发酵培养基中加入抗坏血酸,可以提高酒精发酵得率,本 实验在玉米醪液中加入不同浓度的抗坏血酸,结果如下。
47

第四章酵母菌发酵条件的优化研究

6 6 6


、一



型 6 冀 熙 6




㈣『].
0 O.05 0.1 0.15 O.2 0.25

抗坏血酸含量(%) 刚5.2抗坏血酸对酒精发酵的影响

由图5.1可知,在玉米醪液中加入抗坏血酸,能够显著提高酒精产率。当添加 量低于0.15%时,产酒率随添加量的增加而提高,添加量为0.15%时,酒精度提高了 0.4%左右,当添加量大于0.15%时,产酒率增幅较小。考虑到生产成本,选择在培 养基中抗坏血酸最佳添加量为0.15%。
。 ● .

4.3.1.3糖度对发酵结果的影响 糖是酒精发酵的重要基质原料。糖度的高低会直接影响到酒精转化率,糖度高 时产生的酒精度也相对较高,但是糖度过高微生物发酵反而受到抑制,不能完全利 用原料而造成浪费。本试验研究了糖度对酒精发酵的影响,结果如下。
6 6 6 6 4 2 6 5 8 6 4 2 5 12 14 16 18

≯一世罂雾

5 5 5

糖度(%) 图5.3糖度对酒精发酵的影响

由图5.3可知,糖度对酒精发酵的影响很大。随起始糖度的增大,发酵结束时 酒精度增加,但糖度过大,则对酒精度影响不大,因此初步确定最适糖度为16%。

第四章酵母菌发酵条件的优化研究

4.3.1.4培养基正交试验 在单因素试验的基础上,对酵母膏(A)、抗坏血酸(B)、糖度(C)进行3因素3水平 正交试验,以酒精度(%)作为指标.采用L9(34)表分析试验结果。其正交试验设计因 素水平见表5.1,结果见5.2。
表5—1培养基优化正交试验因素水平表

采用直观分析法,比较试验中三个因素极差值R的大小。R值越大,则该因素的 水平变化对试验的影响越大,即在本次试验中这个因素就越重要。由表5.2可知, 三个因素的主次关系是:A(酵母膏)>C(糖度)>B(抗坏血酸),最优组合为:A282Cl 在最优组合条件下其酒精度可达7.3%。

第四章酵母菌发酵条件的优化研究

综上所述,Al酒精发酵培养基补充剂为:酵母膏0.4%,抗坏血酸0.18%,糖度
14%。

4.3.2培养条件优化



本实验从温度、pH值、接种量及摇床速度四个因素对发酵条件进行优化。 4.3.2.1温度对发酵结果的影响

7 6


艺0

摧4
蘸3
2 1 0 32. 34 36 38 40 42 44
‘j





温度(℃)


46

图5.4温度对酒精发酵的影响

每种微生物都有其最适生长温度.当低于最适温度时,随着温度升高,细胞内 的酶反应加速,酒精度升高,温度高于最适温度时,细胞活性物质发生变性。如图 54所示,AI最适发酵温度为36℃。
4.3.2.2

pH值对发酵结果的影响

7 6 5 4
____

一毋一世墼辱

3 2 l




3.5 4

4.5



5.5



6.5



pH值
图5-5 pH对酒精发酵的影响

第四章酵母菌发酵条件的优化研究

pH值主要通过对菌的生长条件、产酶能力及酶活力等产生影响而影响发酵。 很多酒精工厂都在酵母种子培养和发酵的过程中调节pH值。如图5.5所示,A1最 适发酵pH为5.殳 43.2.3接种量对发酵结果的影响 在酒精发酵生产中,接种量的大小至关重要.直接影响酵母菌的发酵周期和产 量。大量接入已经活化的菌种,可以明显缩短生长过程及发酵周期,节约发酵动力 消耗,减少杂菌污染的机会。但接种量过大时,发酵液中的营养物质大部分被用于 菌体细胞增殖,同时发酵液中还会生成大量代谢废物,不利于酒精的获得f551。本实 验在玉米醪液中接入不同接种量的菌种,结果如下。





6.5 6
?

,、



蓑5.5






4.5 4

‘厂].
8 lO 12 14 16

接种量(%) 图5.6接种量对酒精发酵的影响

由图5-6可知,随着接种量的增加,发酵液酒精度随之增加。当接种量为12% 时酒精度达到6.4%,但当接种量超过12%时,酒精度反而降低,分析原因可能是 接种导致醪液糖度下降或者菌种过量导致糖被过度消耗,故取12%为最佳接种量。 4.3.2.4摇床速度对发酵结果的影响 酵母菌作为兼性厌氧菌,在有氧和无氧的条件下都能发酵,一般情况下菌种在 有氧条件下进行呼吸产能,、生长活动旺盛,细胞增殖速度快,发酵作用较弱,而在 无氧条件下细胞生长会受到一定抑制,但此时会发酵糖类产生乙醇等代谢产物。本 实验将菌种置于不同摇床速度(静止培养时视摇床速度为0)下发酵,结果如下。

第四章酵母苗蕞酵条件的优化研宄


一%)世棼錾

6:3
2 l


80rpm

,,

0 O 0 5 1 l 5 2 2 5 3 3 5 4 4 5

发酵时问(d)
国5-7接种量对酒精控酵的影响

由图5.7可知+在摇床发酵生产中发酵速度较快,一般只需i 5到2天发酵即 可完成;而静止发酵一般需要3,5天。但摇席发酵的产酒率比静止发酵的产洒率低, 且摇床速度越高,产酒率越低。这可能是因为随着发酵液的摇动酒精较会随着C02 的排出而跑掉,所以酒精发酵方式选择静止发酵:

4,3.2.5发酵条件正交试验
在单因素试验的基础上,对发酵温度(A)、pH值(B)、接种量(c)及摇床速度(D)

进行4因素3水平正交试验.以酒精度惭)作为指标.来mL9(34)表分析试验结果。正
空设计因素水平见表5.3.结果见表54。
褒5?3发酵条件优化正交试验目素m平袁

采用直观分析法.比较试验中四个园素的极差值R大小。由表5.4可知.四个因

素的主欢关系是?BOH值))A(温度pc(接种量J>D(摇床速度),再根据各因素的k 值确定最优组合为:A,B1C,D2.在最优组合条件下发酵酒精度可选72%, 所以.AI酒精发酵条件为?接种量16%,发酵温度38'C,发酵pH值5 0,摇床
速度30r/rain。

第四章酵母菌发酵条件的优化研究 表5.4发酵条件正交试验结果

4.3.3发酵条件验证
根据培养基和发酵条件的优化结果,用优化所得的玉米醪液改良培养基培养Al ,并在优化发酵条件下发酵,测定其酒精度及OD值,结果如下。
1.4 1.2 1

j磐0.8



0.6 0.4 0.2 O 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

时间(h)
图5.8 Al生长曲线测定结果

处于对数期时,菌种生长旺盛,代谢活性强,细胞增殖速度快且生命力强。选 择这个时期的菌种细胞作为发酵出发菌,能够保证菌体活性,提高发酵效率‘581。而

酵母菌达到对数期的时间受培养基成分、温度、接种量等各方面影响。由图5-8可’
知,在优化培养条件下,酵母菌A1在8h时进入对数生长期,OD值为0.143,在20h时

第四章酵母菌发酵条件的优化研究

对数期结束,0D值为1.125。在20h以后,菌种开始进入稳定期,大量积累乙醇等代 谢产物,
表5-5发酵条件验证结果 培养力‘案 对照空白样 优化方案 酒精度
6.3% 7.7%

由表5-5可知,A1在最适发酵温度和最适发酵pH下,在玉米醪液中静置发酵的 酒精度为6.3%,而在优化培养条件下,接种于优化玉米醪液中的A1酒精度为7.7%, 酒精度提高了1.4%,由此可以初步确定优化方案能够提高酵母菌Al的发酵率。

4.4小结

本章以酿酒酵母Al作为出发菌.以玉米面为发酵原料,通过单因素试验及正交 试验设计,对A1的培养基成分及发酵条件分别进行优化,以此提高其酒精发酵率。 本实验将影响因素分为两组,即培养基成分和发酵条件,分别对其进行正交试 验,确定各自的最优组合。首先进行单因素试验,分别测定在不同温度、’pH值、接 种量、糖度、摇床速度以及在玉米醪液中添加不同含量的酵母膏、抗坏血酸等条件 下产酒率的影响,获得单因素水平参数:糖度16%,温度36℃,pH值5.5,接种量 12%,摇床速度为0(静止发酵),在培养基中添加酵母膏0.4%、抗坏血酸0.15%。 然后分别对培养基成分和发酵条件进行正交试验,培养基成分的最优组合为:糖度 为14%,酵母膏0.4%、抗坏血酸0.18%;发酵条件的最优组合为:接种量16%,温 度38℃,发酵pH值5.0,摇床速度30r/min。在最优组合条件下酒精度可达7.7%,与 原工艺相比提高了1.4%。

第五章结论

第五章结论

本论文以白酒厂窖池的新鲜窖泥为研究对象,分离、筛选并鉴定出具有一定 优良特性的酵母菌株,通过对分属于不同酵母菌种的菌株的特性分析,初步研究 了窖泥中酵母群系的特点。同时本论文以酿酒酵母A1作为出发菌,以玉米面为 发酵原料.通过单因素试验及正交试验设计,对其发酵条件进行优化,使该菌株 产酒率有所提高。 1.与一般环境相比,白酒窖池中的酵母菌长期处于高温高乙醇条件下,经自 然选择具有较好的耐热性能.因此本论文以耐温耐乙醇为标准对菌种进行筛选 采用氯霉素.YEPD培养基从窖泥样本分离出具有典型酵母菌菌落特征的菌株98 株,经44℃生长实验、TTC平板筛选、耐lO%乙醇实验三级筛选后,最终得到 10株菌株。在对其细胞形态、固液体培养、生理生化等特性进行研究后,将这 10株菌种初步鉴定为酿酒酵母.多形汉逊酵母,鲁氏接合酵母,耐热克鲁维酵 母,粟酒裂殖酵母。 2.从分离得到的不同酵母菌种中各选1株进行特性分析,测定其最适生长温 度、最适发酵温度、最适生长pH值、最适发酵pH值、热致死温度、耐糖性、耐 乙醇性,描绘了菌种发酵和生长曲线,初步建立了窖泥群系中各菌种的特性参数。 由于分离自酒厂窖池窖泥,这5株菌都具有较好的耐温性,在36℃左右产酒能力 最强,最适发酵pH值4.5—5.5,能耐受10—14%1拘乙醇以及60—70%的高糖。 在确定各菌株的最适发酵温度和pH值后,对这5株菌分别进行发酵试验,以 产酒率为主要指标比较各菌株的发酵特性。其中酿酒酵母A1以10%的接种量接于 含糖15%的麦芽汁培养基,pH值5.5,于36℃静置发酵,产酒率最高为6.3%。 3.以酿酒酵母A1为发酵出发菌,对其进行发酵条件优化。将7个影响因素分 为两组,即培养基成分和发酵条件,分别对其进行正交试验,确定各自的最优组 合。培养基成分最优组合为:糖度为14%,添加酵母膏0.4%、抗坏血酸0.18%: 发酵条件的最优组合为:接种量16%,温度38"C,pH值5.0,摇床速度30r/min。 在最优组合条件下酒精度可达7.7%,与原工艺相比提高了1.4%。所获得的酵母 菌种有望用于工业化生产,具有良好的应用前景。

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发表论文和科研情况说明

发表的论文:
“分子生物技术及快速鉴定系统在酵母鉴定中的应用”,第六届食品年会 论文集,2008.9

参与的科研项目:
挑战杯第六届科技立项“自然发酵泡菜中乳酸菌的分离鉴定”

60





硕士生活即将结束,我在天津大学六年的学习生活也将告一段落。在这里我 度过了人生最美丽的一段时光,收获了很多值得珍惜一生的东西,这里是我梦想 飞扬的起点,也留下了很多难忘的回忆,值此论文完成之际,谨以最真挚的感激 献给所有在学习、工作和生活中曾给予我指导、关心和帮助的人们! .首先我要感谢我的导师周志江教授。周老师治学严谨、实事求是,不仅传授 知识方法.而且在做人处事方面也给我树立了榜样:衷心感谢周老师在本科及研 究生阶段给予我的谆谆教诲和悉心指导,培养了我独立进行科研工作的能力,更 使我学到了一个科学工作者必须具备的品质.同时周老师的正直善良、宽容大度 也使我耳濡目染,受益终生。 感谢韩烨老师在实验设备、技术等方面为我提供的热心帮助和指导,感谢寇 晓红老师、张丽霞老师、肖华志老师、王占忠老师在实验过程中给予我的支持和 鼓励!


感谢同寝好友刘珊娜、李丽、李琳同学,她们在我面临困难和挑战的时候给 我充分的帮助和鼓励,让我时时感受到大家庭的幸福和温暖。同时李素燕师姐和

康牧旭同学对我论文的研究工作都给予了热情帮助,在此向他们表达我的感激之
情。 感谢我的父母。你们是我一生中最重要的人,是你们多年来含辛茹苦的养育, 支持我一路走到现在!每当我失落的时候,是你们的鼓励安慰与关爱支撑着我战 胜困难!我谨献上本论文表示我的感谢之情。

郜希璐 2009年5月20日

61

白酒窖泥中酵母菌的分离鉴定及发酵特性研究
作者: 学位授予单位: 郜希璐 天津大学

本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1677210.aspx


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