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第三章 细胞培养的基本方法


第三章 细胞培养的基本方法 第一节 培养细胞的细胞生物学 一、基本概念通常,体外培养的生物成分无外乎两种结构形式: 其一是小块组织或称为组织块(tissue block) ,一般称为外植块; 其二是将生物组织分散后制成的单个细胞,一般称为分离的细胞(isolated cell)或者分散的细胞 (dissociated cell)。 分散的过程通常在培养液或平衡盐溶液中进行,分散的细胞被悬浮于培养液或平衡盐溶液中。 单个细胞分散存在于培养液或其它平衡盐溶液中、 缓冲溶液中, 就称为细胞悬液(cell suspension)。 狭义的细胞培养(cell culture)主要是指分离 (散) 细胞培养, 广义的细胞培养的概念还包括单 (个) 细胞培养(single cell culture)。一种是群体培养(mass culture) ,将含有一定数量细胞的悬液置于 培养瓶中, 让细胞贴壁生长, (confluence) 汇合 后形成均匀的单细胞层; 另一种是克隆培养 (clonal culture) ,将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中,各个细胞贴壁后,彼此距离较远,经过生 长增殖每一个细胞形成一个细胞集落,称为克隆(clone) 。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于 同一个祖先细胞。 现今,用于疫苗生产的细胞基本有 3 类,即原代细胞、二倍体细胞株及传代细胞系。经过几十年 的研究和发展,目前我国已经拥有了可以进行大规模疫苗生产的动物原代细胞、二倍体细胞和 Vero 细胞等生产技术,用于生产多种人用、动物疫苗。其中二倍体细胞(如我国 70 年代建立的 人胚肺二倍体细胞株 KMB17 和 2BS)对多种病毒具有广泛的敏感性,用其制备病毒性疫苗可以 克服使用原代细胞时在其培养物中可能存在的各种潜在致病因子的危险, 是当前病毒性疫苗生产 较为理想的细胞基质。Vero 细胞是 1962 年由日本 Chiba 大学的 Yasumura 等人从成年非洲绿猴 肾中分离获得的,是一种贴壁依赖性成纤维细胞,核型为 2n 60,高倍体率约为 1.7%,可持续地 进行培养,不含任何污染因子。通常使用 199 培养基添加 5%胎牛血清进行培养。该细胞可用于 多种病毒的增殖,已被 WHO 批准广泛用于人用、动物用疫苗生产。 二、体外培养细胞的分型 (一)贴附型:大多数培养细胞贴附生长,属于贴壁依赖性细胞,大致分成以下四型: 1、成纤维细胞型:胞体呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质突起,生长时呈放射状。 除真正的成纤维细胞外,凡由中胚层间充质起源的组织,如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮 等常呈本型状态。培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 2、上皮型细胞:细胞呈扁平不规则多角形,中央有圆形核,细胞彼此紧密相连成单层膜。生长 时呈膜状移动,处于膜边缘的细胞总与膜相连,很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤 表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 3、游走细胞型:呈散在生长,一般不连成片,胞质常突起,呈活跃游走或变形运动,方向不规

则。此型细胞不稳定,有时难以和其他细胞相区别。 4、多型细胞型:有一些细胞,如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态,可统归于此类。 (二)悬浮型:见于少数特殊的细胞,如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形,不贴于支 持物上,呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 三、培养细胞的生长和增殖过程:体内细胞生长在动态平衡环境中,而组织培养细胞的生存环境 是培养瓶、皿或其它容器,生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后,则需要分离 出一部分细胞和更新营养液,否则将影响细胞的继续生存,这一过程叫传代(Passage 或 Subculture) 。每次传代以后,细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外,很多细胞在体外 的生存也不是无限的,存在着一个发展过程。所有这一切,使组织细胞在培养中有着一系列与体 内不同的生存特点。 (一)培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells):所谓培养细胞生命期,是指细胞在培养中持 续增殖和生长的时间。 体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。 人胚二倍体成 纤维细胞培养, 在不冻存和反复传代条件下, 可传 30~50 代, 相当于 150~300 个细胞增殖周期, 能维待一年左右的生存时间,最后衰老凋亡(Apoptosis) 。如供体为成体或衰老个体,则生存时 间较短;如培养的为其它细胞,如肝细胞或肾细胞,生存时间更短,仅能传几代或十几代。只有 当细胞发生遗传性改变,如获永生性或恶性转化时,细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培 养时,不论细胞的种类和供体的年龄如何,在细胞全生存过程中,大致都经历以下三个阶段: 1.原代培养(Primary Culture)期:也称初代培养,即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶 段,一般持续 1 一 4 周。此期细胞呈活跃的移动,可见细胞分裂,但不旺盛。初代培养细胞与体 内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的(Heterogeneous) ,也即各细胞的 遗传性状互不相同,细胞相互依存性强。 2.传代期:初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系(Cell Line) 。在全生命期中此期的持续时 间最长。在培养条件较好情况下,细胞增殖旺盛,并能维持二倍体核型,呈二倍体核型的细胞称 二倍体细胞系(Diploid Cell Line) 。为保持二倍体细胞性质,细胞应在初代培养期或传代后早期 冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存,则需反复传代以维持细胞的适宜密 度, 以利于生存。 但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。 一般情况下当传代 10~ 50 次左右,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止,细胞进入第三期。 3.衰退期:此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;细胞形态轮廓增强,最后衰退凋亡。 在细胞生命期阶段,少数情况下,在以上三期任何一点(多发生在传代末或衰退期) ,由于某种 因素的影响,细胞可能发生自发转化(Spontaneous Transformation) 。转化的标志之一是细胞可能 获得永生性(Immortality)或恶性性(Malignancy) 。细胞永生性也称不死性,即细胞获持久性 增殖能力,这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite Cell Line) ,也称连续细胞系(Continuous Cell Line) 。无限细胞系的形成主要发生在第二期末,或第三期初阶段。细胞获不死性后,核型大多 变成异倍体(Heteroploid) 。细胞转化亦可用人工方法诱发,转化后的细胞也可能具有恶性性质。 细胞永生性和恶性性非同一性状。 (二)组织培养细胞一代生存期 所有体外培养细胞,包括初代培养及各种细胞系,当生长达到

一定密度后,都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速 度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下,细胞数量增加与饱和速度相对 要快(实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快) 。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代 培养细胞增殖快,培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词,系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间,这已成为培养工作中的 一种习惯说法,它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第 153 代细胞,即指该细胞系已 传代 153 次。它与细胞世代(Generation)或倍增〔Doubling〕不同;在细胞一代中,细胞能倍 增 3~6 次。 细胞传一代后,一般要经过以下三个阶段: 1.潜伏期(Latent Phase) :细胞接种培养后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此 时细胞胞质回缩,胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上,称贴壁,悬浮期结束。 各种细胞贴附速度不同,这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养 细胞贴附慢,可长达 10~24 小时或更多;连续细胞系和恶性细胞系快,10~30 分钟即可贴附。 细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。 支持物能影响细胞的贴附; 底物表面不 洁不利贴附,底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中,有一些特殊物质如纤维连接 素(Fibronectin) ,又称 LETS(Larger External Transformation Substance) ,细胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分,它们有的存在于细胞膜的 表面(如 CSP) ,有的则来自培养基中的血清(LETS) 。近年又从各种不同组织和生物成分中提 取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。 细胞贴附于支持物后,除先经过前述延展过程变成极性细胞,还要经过一个潜伏阶段,才进入生 长和增殖期。细胞处在潜伏期时,可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相。细胞潜伏期与细胞 接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长,约 24~96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅 6~24 小时;细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开 始出现并逐渐增多时,标志细胞已进入指数增生期。 2.指数增生期(Logarithmic growth Phase) :这是细胞增值最旺盛的阶段,细胞分裂相增多。指 数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂 (Mitotic Index:MI)表示,即细胞群中每 1000 个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数 受细胞种类、 培养液成分、 pH、 培养箱温度等多种因素的影响。 一般细胞的分裂指数介于 0.1%~ 0.5%,初代细胞分裂指数低,连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达 3%~5%。pH 和培养液血清 含量变动对细胞分裂指数有很大影响。 指数增生期是细胞一代中活力最好的时期, 因此是进行各 种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续 3~5 天后,随细 胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后,如培养的 是正常细胞, 由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动, 这种现象称接触抑制 (Contact Inhibition) 。 而恶性细胞则无接触抑制现象, 因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。 肿瘤细胞由于 无接触抑制能继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(Piled up) 。细胞接 触汇合成片后,虽发生接触抑制,只要营养充分,细胞仍然能够进行增殖分裂,因此细胞数量仍 在增多。但当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养的枯 竭和代谢物的影响,则发生密度抑制(Density Inhibition) ,导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑 制和密度抑制是两个不同的概念,不应混淆。

3.停滞期(Stagnate Phase) :细胞数量达饱和密度后,细胞遂停止增殖,进入停滞期。此时细胞 数量不再增加,故也称平顶期(Plateau) 。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,继而培养液 中营养渐趋耗尽,代谢产物积累、pH 降低。此时需做分离培养即传代,否则细胞会中毒,发生 形态改变,重则从底物脱落死亡,故传代应越早越好。传代过晚(已有中毒迹象)能影响下一代 细胞的机能状态。在这种情况下,虽进行了传代,因细胞已受损,需要恢复,至少还要再传 1~ 2 两代,通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后,才能再用。结果反而耽误了时 间,这是在实验中应特别注意的。 四、原代培养:即第一次培养,是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养,中途不分割培养 物的培养过程。有几方面含义: ●培养物一经接种到培养器皿(瓶)中就不在分割,任其生长繁殖; ●原代培养中的“代”并非细胞的“代”数,因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细 胞; ●原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液,也不等于不更换培养器皿。 正常细胞培养的世代数有限, 只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。 所谓转化即是指 正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。 目前世界上许多实验室所广泛传用的 HeLa 细胞系就是 1951 年从一位名叫 Henrietta Lacks 的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。 此 细胞系一直延用至今。 原代培养的细胞一般传至 10 代左右就不易传下去了,细胞的生长就会出现停滞,大部分细胞衰 老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去,这些存活的细胞一般能够传到 40~50 代,这种传代细胞叫做细胞株。细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始 终保持。当细胞株传至 50 代以后又会出现“危机” ,不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质 发生了改变,并且带有癌变的特点,有可能在培养条件下无限制地传代下去,这种传代细胞称为 细胞系。 原代培养是建立各种细胞系(株)必经的阶段,其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技 术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。由于原代培养的细胞转化性极小,对病毒敏感性 好,因此适应制备疫苗等生物制品;但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年 龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪 肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。 原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤, 在所有的操作过程中,都必须保持培养物及生长环境的无菌。 多数情况下,分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞,就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而 形成细胞单层,这种培养方式称为单层细胞培养(monolayer culture) ,又叫贴壁培养(adherent culture) 。少数情况下,培养的细胞没有贴壁依赖性,可通过专门设备使细胞始终处于悬状态而 在体外生长,这种形式称为悬浮培养(suspension culture) 。如何让接种的细胞尽快贴壁,是决定 培养成功的关键步骤:

●取决于适当的生长基质表面; ●可降低接种后培养液对细胞的浮力, 如先少补加少量培养液, 待细胞贴壁后再补足营养液继续 培养; ●注意适当的细胞接种密度,一般 105 个/ml 左右。 五、传代培养:当原代培养成功以后,随着培养时间的延长和细胞不断分裂,一则细胞之间相互 接触而发生接触性抑制, 生长速度减慢甚至停止; 另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不 利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶) 内,再进行培养。这个过程就称为传代(passage)或者再培养(subculture) 。对单层培养而言, 80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。 体外培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代” 的概念。传代培养的实质就是分割后再一次培养,可以相对地衡量培养物的培养年龄。 六、生长曲线:细胞接种入培养瓶后,先进入 2-24h 的延迟期(lag period) ,然后进入指数生长期 (即对数期) (log phase) ,汇合成单层进入缓慢生长或停滞期(即平台期) (plateau lhase) 。每种 细胞系(cell line)的这些生长期(growth phase)都是特征性的,只要环境条件保持恒定,每一 次测定结果应该是可重复的。


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