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胶体金标记免疫层析法检测大肠杆菌O157


疾病监测 2007 年 7 月 30 日第 22 卷第 7 期 Disease Surveillance , July 30 , 2007 , Vol.22 , No.7

? 论

著 ?

胶体金标记免疫层析法检测大肠杆菌 O 157
刁琳琪 1,
摘 要: 目的

王 伟 3,

徐建国 2,

廖兴广 1,

王 芸3

应 用 抗 大 肠 杆 菌 O157(E.coli O157)单 克 隆 抗 体 , 制 备 一 种 简 便 快 速 的 胶 体 金 标 记 免 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒, 标记

疫层析( GICA) 条用于检测标本中 E.coli O157 。 方法

抗 E.coli O157 单克隆抗体, 以硝酸纤维膜作为抗 E.coli O157 单克隆抗体的包被载体, 制成 GICA 检 测条。 标本中 E.coli O157 与检测条上金标记抗体 (Au- Ab)结合后, 利用硝酸纤维膜的层析作用移动, 与膜上的固相抗体结合形成可见的红色条带。结果

GICA 检测条灵敏度可达 105 cfu/ml。用 GICA

检测了 1750 份不同食品和人畜粪便标本中 E.coli O157 , GICA 检测条阳性份数 43 份, 后经分离 培 结 养 检 出 29 株 大 肠 杆 菌 O157 ; 另 14 份 标 本 经 鉴 定 , 其 中 12 份 标 本 可 疑 为 弗 劳 地 枸 橼 酸 杆 菌 。 论

GICA 条检测标本的 E.coli O157 , 特异性较高, 不需任何仪器设备, 较简便快速, 易于判断结果, 故可
对标本进行快速筛查, 适合各级疾控中心和临床检验部门使用。 关键词 : 大肠杆菌 O157 ; 胶体金; 免疫层析 文献标识码 : A 文章编号 : 1003- 9961 (2007) 0438- 03 07- 中图分类号 : R378.2

Gold - immunochr omatogr aphy assay for Escherichia coli O1 57 DIAO Lin-qi, WANG Wei, XU Jian-guo, LIAO Xing-guang, et al. Henan Provincial CDC, Zhengzhou 450003, China Corresponding Author: DIAO Lin-qi, Email: diaolq@hncdc.com.cn Abstr act: Objective The present study was conducted to establish a sensitive, rapid, and The trisodium citrate reduction method was used to prepare convenient gold immunochromatography assay (GICA) by using monoclonal anti-E.coli O157 for the detection of E.coli O157. Methods colloidal golds, which were coupled with monoclonal anti-E.coli O157. These antibodies were immobilized on nitrocellulose (N.C) membrane to prepare a GICA card device. The gold- antibodies (Au- Ab) conjugates reacted with E.coli 0157 in the samples and migrated up the N.C membrane to produce a optical red strip. Results The sensitivity of GICA was 105 cfu/ml. 1750 different food and stool samples were detected by GICA for E.coli 0157 and 43 samples were found to be GICA positive. E.coli O157 were isolated from 29 of the 43 positive samples with 12 C.freundii identified in the remaining 14 positive samples. Conclusion GICA is a specific, rapid and simple assay for the detection of E.coli O157, applicable to performing the tests in centers for disease control and prevention and clinical laboratories at various levels. Key wor ds: CLC: R378.2 Escherichia coli O157; colloidal gold; immunochromatography Document code: A Article ID: 1003- 9961(2007)07- 0438- 03

肠出血性大肠埃希菌( EHEC) O157 : H7 引起的 肠道感染性疾病已成为一个严重的全球性公共卫 生 问 题 , 在 许 多 国 家 导 致 多 起 爆 发 流 行 。 EHEC

( WHO) 已把 EHEC O157 : H7 出血性肠炎列为新发 传染病。目前, 对该病原体的鉴定依靠细菌培养, 耗 时较长, 费用较高, 不能满足临床快速诊断的要求。 为此 , 利用杂 交瘤技术 , 制备了抗 E.coli O157 单 克 隆抗体 (MAbs)并利 用胶体金免 疫层析技术 , 制成直 接检测标本 中 E.coli O157 的胶体金 免 疫 层 析 检 测 条。用该条检测标本中 E.coli O157 具有特异性强, 灵敏度高; 简便、 快速, 不需任何仪器设备等优点。

O157 : H7 可引起出血性肠炎, 约有 10% 的患者发展 为溶血性尿毒综合征( HUS) 及血栓性血小板减少性
紫癜( TTP) , 死亡率高达 30% 以上
[1, 2]

。世界卫生组织

作 者 单 位 :1. 河南省疾病预防控制中心, 河南 450003 ; 2. 中国疾病预防 控制中心传染病预防控制所; 3.郑州万泰生物科技有限公司 作者简介 :刁琳琪( 1967- ) , 男, 河南省南阳市人, 副主任医师, 主要从 事疾病预防控制和免疫规划管理工作 通讯作者 :刁琳琪, Tel: 0371- 68089016 , Email: diaolq@hncdc.com.cn 收稿日期 :2006- 09- 25

1 1.1

材料与方法 材料 大肠杆菌 O157: H7 标准株 ( 中国疾病

预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室保存菌

? ? 438

疾病监测 2007 年 7 月 30 日第 22 卷第 7 期 Disease Surveillance , July 30 , 2007 , Vol.22 , No.7

株) 。 大肠埃希菌( 44102 ) ; 伤寒沙门菌( 50097) 、 甲型 副伤寒沙门菌( 50001 ) 、 乙型副伤寒沙门菌( 50004) ; 痢疾杆菌( 51252) ; 普通变形杆菌( 49001 ) 、 奇异变形 杆菌( 49005) ; 粘质沙雷菌( 41002) ; 肺炎克雷伯杆菌 ( 46117) ; 粪链球菌( 32221) 、 乙型链球菌( 32210 ) 、 肺 炎链球菌( 31001) ; 铜绿假单胞菌( 10211 ) ; 单核细胞 增多性李斯特菌( 54003) ; 金黄色葡萄球菌( 58534) 、 表皮葡萄球菌( 26069) 均购于中国医学细菌保藏管 理中心。 产肠毒素性大肠杆菌( ETEC) 、 肠侵袭性大肠 杆菌( EIEC) 、 致病性 大肠杆 菌 ( EPEC) ; 小 肠 结 肠 炎 耶尔森菌; 弗劳 地枸橼酸杆 菌( Citrobater Freundii) ; 霍乱弧菌 O1 群和 O139 群、 副溶血弧菌为中国疾病 预防控制中心( CDC) 传染病预防控制所腹泻病室保 存菌株。 抗 E.coli O157 单克隆抗体及兔抗鼠多抗 Ig: 为 中国 CDC 传染病预防控制所制备。 氯 金 酸 ( HAuCl4 ) :AR, Sigma 公 司 , 其 他 所 用 配 制试剂均为 A 级。硝酸纤维膜( N.C) : 美国 Millipore 公司。食品和人畜粪便标本: 1750 份标本来自河南 省 CDC。

后封闭, 烘干备用。

1.2.5

GICA 检测 条 的 制 备 取 一 块 洁 净 PVC 板 , 将包被的 NC 膜固定在适当的位置上。将引水材料
的上端, 胶体金结合物玻璃纤维置于引水材料下与

连接在 NC 膜下端( 进样端) , 吸水材料连接在 NC 膜

NC 膜衔接。用切割机将组装的测试板纵向切条, 即
为大肠杆菌 O157 胶体金免疫层析检测条。加干燥 剂密封保存。

1.2.6

E.coli O157 检测 以新鲜标本为好 , 将 标本 接种于 mEC 肉汤进行增菌培养 6 h 。
在 GICA 检 测 条 的 加 样 端 滴 加 150 μ 增 菌 样 l 品, 此时样品向检测条的另一端爬行, 将金标记抗

O157 抗体溶解并一起移动, 如果样品中含有 E.coli O157, 则硝酸纤维膜上包被抗 O157 抗体区带显示
胶 体 金 的 红 色 , 如 样 品 中 无 E.coli O157, 则 此 区 带 不 显 色 。 兔 抗 鼠 IgG 区 带 无 论 样 品 中 有 无 E.coli

O157 均显示红色, 它作为检测条失效与否的判断标 志。强阳性标本( 108 cfu/ml ) 在 2 min 内即可在检测 线见到红色条带; 弱阳性标本 (105 cfu/ml)约需 10~ 15 min 判读结果。 E.coli O157 分离培养: 将阳性样品进行 IMS 集 菌 , 然后, 将其分离于 CHROMagar O157 显色培养
[5]

1.2

方法

1.2.1 单克隆抗体的制备 参照文献用灭活 E.coli O157:H7 免疫小鼠, 共 4~ 次 [3]。细胞融合后用间接 5 酶联免疫吸附试验( ELISA) 筛选产生抗体的杂交瘤
细胞, 将阳性株通过克隆等扩大培养后制备腹水。

基分离, 鉴定。

2 2.1

结果

1.2.2

胶体金溶液的制备

参照文献并改进 [4]。 用甲

基硅油硅化所使用的玻璃器皿, 将 100 ml 去离子水 溶解氯金酸使其终浓度为 0.01% 。煮沸后, 加入 1% 柠檬酸三钠 1.8 ml, 快速混合 20 min , 呈 现深红色, 凉至 15~ ℃, 加入 PEG 1 ml, 调 pH 至 7.5 , 即所需 30 胶体金颗粒。在电镜下观察胶体金颗粒为圆形、 均 一、 无聚集。

GICA 条 检 测 E.coli O157 的 特 异 性 用 该 条 检测 108 cfu/ml 菌量的大肠埃希菌、 伤寒沙门菌、 甲

型副伤寒沙门菌、 乙型副伤寒沙门菌、 痢疾杆菌、 普 通 变 形 杆 菌 、 奇 异 变 形 杆 菌 、 霍 乱 弧 菌 O1 群 和 副溶血弧菌、 粘质沙雷菌、 小肠结肠炎耶尔 O139 群、 森菌、 粪链球菌、 乙型链球菌、 肺炎链球菌、 肺炎克雷 伯杆菌、 金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌、 单核细胞 增多性李斯特菌、 铜绿假单胞菌、 产肠毒素性大肠杆 菌( ETEC) 、 肠侵袭性大肠 杆菌( EIEC) 、 肠致病 性大 肠杆菌( EPEC) 等细菌均为阴性。 而与弗劳地枸橼酸 杆菌有交叉。

1.2.3

胶体金结合物的制备 (Au- Ab)

上述胶体金

溶液在搅拌下, 加入纯化的抗 E.coli O157 单克隆抗 体 2.5 mg, 室 温 搅 拌 20 min ; 加 入 一 定 量 的 终 止 蛋 白, 使后者的终浓度为 1% , 继续搅拌 15 min 。将上 述标记物以 3000 r/min 的转速离心 15 min, 弃沉淀, 上清液以 15 000 r/min 的转速离心 30 min, 弃上清, 将沉淀以原体积 0.01 mol/L pH8.2 PBS 溶解, 如上 重复离心 2 次。 最后沉淀物用 0.01 mol/L pH8.2 PBS 悬 浮 , 恢 复 至 原 体 积 的 40% , 即 纯 化 的 胶 体 金 结 合 物。均匀分散在玻璃纤维上, 使其干燥备用。

2.2 灵 敏 度 使 标 本 中 E.coli O157:H7 菌 量 为 103~ 8 cfu/ml, 经 3 批检测显示, 最低检出菌量为 10 5 10 cfu/ml。 2.3 稳定性 将 GICA 检测条置 37 ℃、 8 ℃做稳定 2~
性试验。用 3 批不同批号的检测条置 37 ℃保存, 每天 抽查观察至第 10 d, 与放置 2~ ℃的检测条对照检测 8 强阳性、 弱阳性、 阴性标本结果无明显差异 , 均在质 控标准内。用 3 批不同批号的检测条置 2~ ℃保存 8 ? ? 439

1.2.4

N.C 膜的包被 将抗 E.coli O157 单抗( 检测 线) 和兔抗鼠 Ig( 质控线) 包被于 N.C 膜上, 室温干燥

疾病监测 2007 年 7 月 30 日第 22 卷第 7 期 Disease Surveillance , July 30 , 2007 , Vol.22 , No.7

12 个月, 每月抽查, 结果均在质控标准内。 2.4 1750 份 食 品 和 人 畜 粪 便 标 本 检 测 结 果 用 GICA 条检测了 1750 份食品和人畜粪便标本, 结果
阳性者再用免疫磁珠 ( IMS) 捕获进行细菌分离鉴 定。结果发现: GICA 检测条阳性为 43 份, 经分离鉴 定 29 份为大肠杆菌 O157, 其中有 14 份标本检测结 果不符, 见表 1, 29 株 O157 经多重 PCR 检测, 其中

本经鉴定其中 12 份标本可疑为弗劳地枸橼酸杆菌。 由于 E.coli O157 抗原决定簇与弗劳地枸橼酸杆菌的 抗原决定簇相似, 使得该检测条与弗劳地枸橼酸杆 菌有一定程度的交叉反应。弗劳地枸橼酸杆菌与大 肠杆菌可通过简单的生化试验很容易的区分开来。 采用 GICA 检测条对标本进行初筛, 初筛阳性 的 标 本 , 进 行 IMS 捕 获 法 获 得 分 离 菌 株 , 为 大 肠 杆 直接用 IMS 捕 菌 O157: H7 病原学检测的最佳程序。 获法作为 EHEC O157 : H7 感染者的病原学诊断, 灵 敏度虽高, 但操作方法十分繁琐耗时, 且试剂价格 昂贵, 需耗外汇资金购置辅助设备, 不易推广和检 测大量标本。试验结果表明, GICA 条检测标本中的 灵 快 E.coli O157 特 异 性 强 、 敏 度 高 , 操 作 简 便 、 速 ,
Freundii
阳性

8 株 O157 含有 stx2、 和 eae 毒力基因, 未检测到 hly stx1 毒力基因。 份标本经鉴定其中 12 份标本可疑 14
为弗劳地枸橼酸杆菌。
表1

1750 份标本大肠杆菌 O157 金标检测及菌株分离情况 Pr ofile of gold- labeled antibody assay and isolation of E.coli O157 fr om 1750 samples

Table 1

标本数

O157 金标
阳性

O157 : H7
阳性 阳性率( % )

不需任何仪器设备, 结果易于判断, 可对标本进行快 速筛查, 这样可降低 IMS 的用量, 节约试验成本, 减 少工作量, 有助于及时诊断并确定治疗方案。 尤其适 合各级疾控中心和临床检验部门使用。
参 考 文 献

1750

43

29

1.66

12



讨论 目前检测 E.coli O157 常规采用山梨醇 - 麥康凯

琼 脂 ( SMAC) 培 养 基 , 选 择 山 梨 醇 发 酵 阴 性 的 大 肠 杆菌, 进一步用生化和血清学试验做鉴定, 需要 24~

流 [1] 徐建国, 祁国明 . 出血性大肠杆菌的微生物 学 、 行 病 学 和 临 床 特征 [J]. 中华流行病学杂志, 1988 , 9(特刊 ): 174- 176.

48 h。对于山梨醇阳性株无法识别[2]。Park 等用免疫 荧光法检测 EHEC O157, 可在 2 h 内完成 [6]。徐建国 等采用 PCR 方法 进行检测 [7], 但 这些方法需 要较昂
贵的仪器, 费用高, 不易于基层单位推广。

[2] 徐建国, 祁国明 . O157:H7 和肠出血性大肠杆菌 [J]. 疾病检测, 1996 , 11(8): 305- 308. [3] Westerman RB,He YS, Keen JE, et al .Production and characteri- zation of monoclonal antibodies specific for the lipolysaccharide of Escherichia coli O157[J].J Clin Microbiol,1997,35:679- 684. [4] [5]
沈关心, 周汝麟 . 现代 免 疫 学 实 验 技 术 [M]. 武 汉 : 湖 北 科 学 技 术 出版社, 1998 : 5 , 131.

GICA 检测条采用胶体金标记免疫层析双 抗体
夹心法, 检测标本中 E.coli O157。该方法集免疫反 应与色谱层 析于一体, 使 标 本 中 的 E.coli O157 与

Bennett AR, MacPhee S, Betts RP.The isolation and detection of Escherichia coli O157 by use of immunomagnetic separation and immunoassay procedures[J]. Lett Appl Microbiol,1996,22:237- 243.

Au- Ab 不 断 结 合 , 形 成 复 合 物 , 再 通 过 层 析 作 用 与
膜上抗 E.coli O157 抗体结合。 实际上对被测物起到 了浓缩作用, 从而使胶体金免疫层析检测条具有较 高的灵敏度和特异性。 作者用胶体金免疫层析 检测条检测 了 1750 份 食品和人畜粪便标本, GICA 检测条阳性份数 43 份, 后经分离培养检出 29 株大肠杆菌 O157, 另 14 份标
[7]

[6] Park CH, Hixon DL, MorrisonWL, et al. Rapid diagnosis of entero- hemorrhagic Escherichia coli O157:H7 directly from fecal speci- mens using immun ofluorescence stain [J]. Am J Clin Pathol, 1994,101:91- 94.
徐建国, 黄力保, 吴纪民 . 聚合酶链反应检 测 出 血 性 大 肠 埃 希 氏 菌 [J]. 中华医学检验杂志, 1995 , 18 : 225- 228.

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