当前位置:首页 >> 理化生 >>

生物物理实验二


生物物理大实验 实验报告
专业:生物科学 指导老师:*** 学生姓名:百家* 学号:u201012*** 班级:10**

目录:
实验一 实验二 膜片钳实验 高时空分辨细胞激活实验

2013-07

实验一
一、实验目的
1. 了解膜片钳的工作原理; 2. 掌握膜片钳系统的构

成及应用;

膜片钳实验

3. 掌握细胞封接技术及通道电流的记录;

二、膜片钳原理
膜片钳技术(patch clamp recording technique)是德国马普生物物理研究所 Neher 和 Sakmann 在1976年创建的。膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子 电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术,该技术是由电压钳 (voltageclamp)发展而来的。它和基因克隆技术(gene cloning)并架齐驱,给 生命科学研究带来了巨大的前进动力。 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、 面积为几个平方微米的 细胞膜通过负压吸引封接起来,由于电极尖端与细胞膜的高阻封接,在电极尖端笼 罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离,因此,此片膜内开放所产生的 电流流进玻璃吸管,用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强 度,该电流强度就代表单一离子通道电流。

离子通道

图一 离子通道

图二 钾离子通道
膜片钳技术的基本思想是通过负反馈使得膜电位与指令电压相等,在电压钳制 的条件下记录膜电流。 利用尖端直径0.5-1um的玻璃电极吸附到细胞膜表面, 通过负 压吸引使电极尖端和细胞膜形成紧密封接,使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区 域(patch)与其周围在电学上绝缘,在此基础上固定膜电位(clamp),然后对电极 尖端下面积仅为几平方微米的细胞膜片上一个或几个离子通道的电流进行记录。从 而将电生理学技术提高到记录和研究单个蛋白质的分子水平。
Rf

A1

A2

图三 膜片钳系统
上面是电阻反馈式膜片钳放大器的电路示意图。A1为一极高输入阻抗、极低噪

声的场效应管运算放大器, 由于 A1极高的开环增益使得两个输入端的电压几乎完全 相等,从而实现电压钳制。Rf 为一数值可切换的反馈电阻,分别对应于不同的电 流记录范围,其中高值反馈电阻具有极高的电阻和极低的杂散电容,是决定放大器 单通道记录性能的基本元件。 A2为一差分放大器, 它的输出即为电极电流和反馈电阻的乘积。 由放大器 A1和 A2构成 的 回 路 称 为 电 流 —电 压 转 换 器 , 是 膜片钳 放 大 器 前 级 (headstage)的核心。

三、膜片钳系统

电容反馈式放大器 200B

图四 膜片钳系统 3.1 膜片钳系统的构成
电子学部件:放大器;计算机接口,数据采集、分析系统。 光学部件和光电接口:显微镜;监视器等。 机械系统:防震台等。

辅助系统:电极拉制器;切片机;孵育槽;灌流系统等 软件系统: 目前的数据采集和分析软件系统主要是 Axon 公司的 Pclamp 软件和 HEKA 公司的 Patch Master 软件。

3.2 膜片钳实验的基本过程
1、液体配制:主要根据研究通道的不同,配制相应的液体,基本原则是保持两个平 衡:渗透压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤。 2.标本制备:实验中使用的细胞材料是 hek293,是一种皮肤上皮细胞,需要在试验 前的一到两天对其做传代培养,使细胞能够贴壁生长,从而方便后面 的操作,细胞的培养使用 DMEM 加 20%的灭火小牛血清的培养基。 3.膜片钳微电极制作:使用毛细玻璃管,通过电极拉制器和抛光仪加工制作成膜片 钳微电极制作; 4.膜片钳封装:使用已经制作好的膜片钳微电极制作对细胞进行封装 5.记录: 通过计算机检测软件记录细胞电流和电阻的变化

四、膜片钳封装实验
4.1 千兆欧姆封接
取一皿培养有 hek293 细胞的培养皿,滴换细胞外液,将浮游的死细胞冲走,对 培养皿中贴壁的细胞即可进行封接吸引。通过 PCLAMP 软件或电子刺激器,给予 一个 20mV,10~50ms 的矩形波刺激,当电极进入培养皿时,记录电流的直线变成 与矩形波电压脉冲相对应的矩形波曲线,将电极尖轻轻压在细胞膜表面,此时电流 曲线的高度变低,给电极以负压吸引,由于电极尖与细胞膜逐渐密接,细胞膜与电 极间的电阻逐渐增加,电流曲线逐渐减小直至变成一条直线,则形成了千兆欧姆封 接。

4.2 细胞封接过程及相应的补偿
电极进入培养皿中的细胞外液前先加一约 10cmH2O 的正压,用粗调把电极定位

到细胞附近,选一个细胞比较宽的地方,小心调节微调,用微调将电极压向细 胞,观察测量的电流波形,当方波下降约 1/3 即可,放掉正压,给予一个轻柔 的负压,约 20-30cmH2O 即可,细胞封接便可以形成。

图五 细胞封接 [注意事项]在电极移动的时候,首先使用粗调在三维方向移动玻璃电极,当电极
入水之后,将细胞与电极调至同一视野中,使用微调,慢慢移动电极,当电极和细 胞处在同一焦距时,将电极移动速度放到最慢,以免电极错过细胞,碰到培养皿底 部,使玻璃电极封口破坏。

五、膜电导测量实验
5.1 膜电流 Im 的计算

图六 膜片钳计算原理
如上图所示,通过玻璃微电极测得的电流是 Im ,而 Im=Ic+IX,其中 IX 是由离子

X 移动产生的电流,Ic 是由膜电容引起的电流,

,利用反馈式膜片钳

放大器控制细胞膜两侧的电压不变,即 ?u=0 ,故 Ic=0, 因此通过玻璃微电极测得的 电流是 Im=IX,这样测出的电流就是离子 X 的膜电流。

5.2 膜片钳微电极制作
5.2.1电极的拉制 电极的拉制分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状,第二次拉制 窄细部位断成二根,其尖端直径一般在1~5μ m,充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ 为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度,即可得到所需要的电极尖 端直径。电极必须保持干净,应现用现拉制。

5.2.2热抛光(heat polish) 一般在玻璃研磨器下对电极尖端进行热抛光,抛光后可使电极尖平滑并烧去过 多的硅酮树酯薄膜,有利于千兆封接的形成。目前大多数实验室在作全细胞模式记 录时,不涂硅酮树酯也不进行热抛光,也可形成很好的千兆封接。

图七

电极拉制器(左)和抛光仪(右)

5.3 内液灌注
细胞内灌流是在全细胞式状态下利用电极内灌流法形成的。电极内灌流法的装 置是由电极固定部、灌流液槽、注入管、流出管、电极记录用琼脂桥所组成。注入 管是用直径 2.5 mm 的塑料管经加热拉细制成,使其尖端能插到接近电极的尖顶部。 灌流液槽注满实验用溶液,插入注入管,当千兆封接形成后,由于负压吸引的作用 电极内液从流出管流入排液槽的同时,实验用溶液由流入管注入到电极内,电极充 满实验用溶液后关闭注入管,完成了液体的交换。这种方法应用在“内面向外式” 时,可同时改变细胞内液和细胞外液的组成;应用在“全细胞式”时就形成了细胞 内灌流方法,直接改变了细胞内液。

5.4 细胞的准备
实验中使用的细胞材料是 hek293,是一种皮肤上皮细胞,需要在试验前的一到 两天对其做传代培养,使细胞能够贴壁生长,细胞的培养使用 DMEM 加 20%的灭火小 牛血清的培养基。在试验前出去,除去培养基,并用细胞外液轻轻冲洗,洗去未贴 壁以及贴壁不牢固的细胞,这是为了在封装时能够将细胞膜成功吸破,防止细胞脱 离培养皿,造成封装失败。

图八 HEK293 细胞 5.5 膜电导的计算
由电脑测试软件上可以直接读出细胞的电阻 Rm,从而细胞的膜电导 Gm=1/Rm。

实验二 一、实验目的

高时空分辨细胞激活实验

1. 了解神经细胞调控的常用方法; 2. 掌握最新神经调控技术-光遗传学;

二、背景知识
人类大脑中成百上千亿个神经元细胞形成错综复杂的神经网络,完成各种复杂 的思维、行为活动。破解人类大脑之迷是科学家一直努力的目标,也是当前科学研 究的热门话题。然而,大脑的复杂性和广深性使科学界面临巨大的挑战。1979 年, 著名分子生物学家,DNA 双螺旋结构共同发现者、1962 年诺贝尔生理与医学奖获得 者 Francis Crick 在《Scientific American》杂志上描述了神经科学面临的挑战, 指出需要一种能够调控一类细胞而不影响或较少影响周围其它细胞功能的技术。这 种设想代表当时科学界的想法,希望能够精确调节某一类神经元的放电,好比电源 开关那样可方便控制神经元电信号的发放,借助当时已有的电生理手段记录其它神

经元的状态或记录动物的行为,就可直接研究大脑内部神经元之间的联系及功能。 事实上,人们从未停止过尝试各种办法来实现以上目标。药物刺激应用而生, 但是其刺激区域大,将影响到整个大脑,而且发挥药效所需时间长,有较大的副作 用,这限制它的应用。电极刺激比药物刺激有效,具有非常高的时间分辨率和可控 性,但刺激区域仍然有 1 mm3 大,所有与微电极有物理接触的及其周围神经元都可 能受到刺激,因此电刺激缺乏特异性和空间选择性。正如 Francis Crick 所言,电 刺激不能满足这个要求,因为电极不是一件精细的工具,它会刺激被植入区域内所 有的细胞。药物也不够特异性,而且它们起效的时间会远远慢于大脑神经元活动的 速度。与此同时,Francis Crick 预测光有可能成为特异性调控某一类型神经元活 动的工具。 的确基于光学方法控制神经元活性的试验一直在尝试。 1978 年, Kaplan 第一次 实现了生物活性分子细胞内的包笼。Adams、Callavay 等通过光学手段照射包笼的 化合物,使得包笼的神经递质与第二信使 ATP 得到释放,从而实现了多个神经元的 控制。这种光刺激技术已发展成熟,具有一定的空间分辨率和时间分辨率,可以实 现多点、任意形式的单光子激发解笼锁与双光子激发解笼锁。然而解笼锁的神经递 质无法特异性的结合到某类神经元上,从而会把所有与之结合的神经元都激活;解 笼锁需要能量大,通常采用紫外激光器,这会对生物样品产生较大的毒性;实验还 需添加笼锁化合物,无法在体实验,从而限制了它的应用。光开关蛋白的出现为光 控神经元活动又提供了一种可能性,然而光开关蛋白在神经元上的表达量很难精确 控制,不仅需要表达光开关蛋白,也需要添加偶氮苯基团,也限制了其广泛应用。 2003 年,德国法兰克福大学的 Nagely 研究小组第一次发现,从绿色藻类 Chlamydomonas reinhardtii 中, 可提取一种光控制的、 二价阳离子通道膜蛋白 ChR2。 它在蓝光照射下,可使细胞去极化。2005 年,美国 Standford 大学的 Boyden 等用 蓝光照射表达有 ChR2 的神经元, 可以产生毫秒精度的动作电位。 这些发现预示一项 新的技术-光遗传技术(Optogenetics)的诞生,它是光学与分子遗传学融合的产 物。光敏通道可以特异性的表达在特定细胞上,并借助光学手段,达到很高时空分 辨率,可以实现单细胞激活。经过短短几年发展,光遗传技术已经对神经科学领域

产生革命性的影响,为研究大脑及疾病诊断提供了新的途径,将在神经环路、疾病 诊断及神经疾病的治疗中发挥更大的作用。2011 年初,Nature Methods 杂志对过去 一年进行了年终回顾,选出了 2010 年最受关注的技术成果就是光遗传技术,正如 Deisseroth 说,光遗传技术可以达到 Francis Crick 的设想。 光遗传技术的出现,为实现特定亚细胞群或特定神经元的激活提供了一种切实 可行方案,将有望实现 Francis Crick 的愿望,可以调控一类细胞而不影响或很少 影响其它细胞功能。然而,通常激活光敏通道采用的光源是宽场光源如高压汞灯, 这样就会把整个样品或整个神经环路都激活,无法实现单个细胞的激活,因此无法 实现特定细胞或环路的选择性激活,进而无法研究单个神经元及其环路特性。 要实现多个特定细胞的激活,需要相应的光学调制技术。基于检流计驱动的扫 描镜是一种通用的控制器件, 常用于共聚焦光学成像。 通过 X、 方向扫描镜的偏转, Y 它可以实现整个视野的扫描。 由于它采用顺利扫描方式, 扫描速度慢 (一般 10 f/s) , 无法实现多点快速激活的需求。 声光偏转器是一种典型的光束扫描器件,主要用于激光打标、复印扫描、扫描 成像上,由于它是无惯性扫描,从一个点到另一个点只需要几个微秒时间,因此能 够实现激光光束快速扫描。声光偏转器通过在其换能器上施加正弦信号,可以使其 晶体折射率形成周期分布,从而构成一个光栅,因而可以改变入射光的角度。在反 常布拉格条件下,衍射光主要集中在+1 级(或-1 级)衍射光上,因此通过改变输入 信号的频率,就可改变衍射角度,实现光束的扫描。要实现二维平面扫描,需要二 块声光偏转器正交放置,第一块声光偏转器在水平方向(或垂直方向)扫描光束, 第二块在其垂直方向(或水平方向)扫描。可以把二维声光偏转器放置在一起,构 成二维光束的扫描。要实现不同位置扫描,只需要改变两块声光偏转器的驱动信号 即可,因此它是一种无惯性的光学器件,可以高速扫描光束。采用两块 AOD 正交放 置,既能保证光束扫描质量,又可大大减少系统体积,使得系统构建紧凑。 AOD 属于串行光束扫描器件,改变其驱动信号频率即可改变扫描位置,因此能 够快速扫描样品,满足光敏蛋白激活所需时间要求;另外,它可以集中光束到样品 任一点处,可以更有效激活光敏蛋白表达的细胞,所需激光光源功率也比较低。因

此,采用 AOD 可以快速的控制光束移动,实现多种模式的照明,可以实现多个细胞 快速选择性激活。

三、实验系统
如图 1 所示,建立了随机光刺激系统,它包括激光光纤耦合单元、激光扫描单 元、电路控制单元三部分。图 1(A)是分离式刺激系统,随机光刺激器与显微镜分 别独立安装在光学平台上,图 1(B)是集成式刺激系统,随机光刺激器与显微镜融 合为一体。 1) 在光路结构设计中, 采用二维声光偏转器实现激光光束的二维扫描, 并采用 通用光学器件、光学调节架实现与显微镜系统耦合,实现生物样品显微放大、可视 化处理,引导激光刺激期望的细胞或神经元,如图 2 所示; 2) 在机械设计中,采用模块化设计思想,使得系统结构紧凑,方便与各种商用 显微镜系统耦合,如图 3 所示; 3) 为控制声光偏转器工作,设计了驱动电路,它包括标准的数据采集卡、开关 电源和控制电路,用于数据传输和与其它外设通信,如图 4 所示; 4) 基于 LabVIEW 应用软件, 开发一套独立的应用控制软件, 拥有多种刺激模式, 软件可读性好,操作方便,如图 5 所示。

图九 随机光刺激系统

图十 刺激系统光路图

图十一 激光扫描单元。 (A)mechanical design of scaning box; (B)扫描箱内部结构; (C)扫描箱外观;

图十二 电路控制单元

图十三 程序操作界面

四、实验结果
1. 视野中任意位置的光刺激实验 (1).在载物台上放上荧光纸,打开激光器,电脑等设备 (2).依次打开两个仪器设备以及专用软件,关闭系统时,应按照先关软件再 关电脑的顺序进行,切勿未退出软件便直接关闭电脑; (3).在基于 labview 图形化软件界面中输入坐标 X5600-6800,Y5600-6800, 间隔均为 393,按下开始按钮,进行观察; (4).可以在显微镜视野中看到如下的结果:

图十四 单点激光图(X5600-6800,Y5600-6800)

图十五 单点激光图(X5600-6800,Y5600-6800)

2. 神经元激活实验 (1).按照上一实验的方法,拉制玻璃电极; (2).在试验开始之前,用手触摸铜质屏照,去除静电; (3).将盛有贴壁海马神经元得培养皿倒置于显微镜的载物台上; (4).进行细胞的封接和电路补偿; (5).打开数据收集窗口; (6).调节随即光刺激系统上的参数,使光斑对准封接好的细胞; (7).点击信号记录按钮; (8).打开随即光刺激系统的开关,对细胞进行光刺激,同时记录电位变化的 情况。

图十六 表达 ChR2 的海马神经元

图十七 实验所得的数据

五、思考题
1. 如何判别激活细胞(或实现对细胞的调控)? 答:给细胞持续施加一定时间的一系列去极化(多为去极化)脉冲来激活离子
通道,记录通道电流峰值,细胞电流不为零,细胞即被激活。

2. 光遗传学技术是如何调控细胞的?

答:事前要向细胞内注射一种植物基因,这种基因能够对不同颜色光的刺激作
出敏感的反应,还能通过自生特性感染类似的细胞。不同频率的光可以调控不同的 靶细胞上表达的离子通道的开关,从而产生不同的动作电位;同种频率不同强度的 光则可以调控产生不同强度幅度的动作电位,从而产生不同的细胞调控结果。

[实验感想]
膜片钳目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法,和克隆技术并 驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力,对于生物学的研究是一 项非常有帮助的技术,对自身能力的提高很有帮助。在本次实验中,我 们遇到了各种困难,但通过仔细分析和自我状态调整后解决了问题,在 这个过程中我们深刻体会到了共同协作和团队精神的重要,在与人合作 和独立思考中提高了自己解决问题的能力。 本次实验中,细胞的培养非常重要,很多同学的技术不过硬,会导 致后面实验不能顺利进行,为了能够得到一个好的实验结果,必须注意 每一个细节。本次实验的过程中,我们能够及时并充分的认识到自己的 不足,今后我们会更加的努力丰富自己的知识,挖掘潜能,提高动手能 力,锻炼独立思考的习惯以及团队合作精神,学会做人、做事、做学问。


相关文章:
生物物理实验二
生物物理实验二_理化生_高中教育_教育专区。生物物理大实验实验报告二,华中科技大学生命科学与技术学院适用(同文档包括生物物理大实验实验报告一)生物...
生物物理学实验指导
生物物理学实验指导 生物物理学实验室 1 生物物理学实验室简介生物物理学是物理学、生命科学、化学、数学、计算机科学等交叉融合产生的新兴学 科,有着深厚的理论...
0808221生物物理学实验
2页 免费 类胡萝卜素的分析测定 5页 免费 生物物理实验报告——生... 3页...实验一 乙醇、甲醇的拉曼光谱测定 实验一 乙醇、甲醇的拉曼光谱测定一、实验目的...
生物物理实验技术与方法复习资料
生物物理实验技术与方法 一、紫外光谱 1、红外、紫外和可见光谱的划分 红外吸收...750 nm。 2、能级跃迁与光谱 (1)转动能级间的能量差ΔEr:0.005~0.050eV...
生物物理实验报告——生物膜的通透性分析
生物物理实验报告——生物膜的通透性分析_生物学_自然科学_专业资料。今日推荐 180份文档 2014证券从业资格考试 2014证券资格证券交易高分突破试卷及答案 2014年证券考...
高中化学、生物、物理实验汇总
高中化学、生物物理实验汇总 隐藏>> 一、化学部分 考点 1 常见仪器的分类、...实验二: 物质鉴定 还原糖 + 斐林试剂 砖红色沉淀 脂肪 + 苏丹 III 橘黄色 ...
生物物理学实验教案3
1.植物叶片叶绿素的提取; 2.扫描植物叶片叶绿素的光谱; 3.计算叶绿素 a、叶绿素 b 的含量。 教学内容提要 教学环 节安排 时间分配 实验室名称:生物物理学 教师...
生物物理作业简要
生物物理作业简要_工学_高等教育_教育专区。1、液态红外光谱是否需要水做溶剂?...2、解析一个未知蛋白质空间结构的实验过程。 1、为什么说蛋白质是生命活动最...
生物物理学总结
生物物理学总结_学习总结_总结/汇报_实用文档。前三章总结,生物物理学 ...根据不同生物对象、材料活性和实验测量分析的需要,有几种模式,P69,图 3-2 ...
更多相关标签:
高二物理电学实验 | 高二物理实验教学计划 | 大学物理实验第二版 | 大学物理实验二 | 高二物理实验计划 | 高二物理实验教学总结 | 高中生物必修二实验 | 大二物理实验报告大全 |