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利用RAPD标记研究部分葡萄品种的亲缘关系


果 树 学 报 2008 ,25 (6 ): 932~936

Journal of Fruit Science

利用 RAPD 标记研究部分葡萄品种的亲缘关系
吴 红 1,2,常永义 1*,郝
3

燕 3,吴玉霞 1

(1 甘肃农业大学农学院,兰州 730070 ; 2 江

苏畜牧兽医职业技术学院园林园艺系,江苏泰州 225300 ; 甘肃农业科学院果树研究所,兰州 730070 )



要:对 47 个 葡 萄 品 种 进 行 RAPD 分 析 。 从 100 条 随 机 引 物 中 筛 选 出 30 个 多 态 性 引 物 用 于 DNA 扩 增 ,共 扩 出

216 条 DNA 带, 121 条具有多态性,多态性比例为 56.01% 。 通过聚类分析结果表明,供试品种分成 5 大类, 巨峰、红
瑞宝、龙宝等巨峰系品种聚为一类。 其中龙宝和红瑞宝优先聚在一起。 表明葡萄品种间的遗传多样性有明显差异,即 使父母本相同的品种, 利用 RAPD 技术也可以分开。 聚类图显示,品种间遗传一致度与品种的遗传背景有关,如高妻 与红井川,红瑞宝与龙宝优先聚在 一 起 ;有 的 品 种 虽 属 同 一 杂 交 组 合 却 未 能 表 现 最 大 遗 传 一 致 度 ,如 京 玉 与 奥 古 斯 特,在聚类图中处于相邻的位置,说明无性繁殖的葡萄在双亲基因型杂合条件下,有性杂交通过基因重组,杂种后代 也可呈现出有较大遗传差异。 关键词: 葡萄; RAPD ; 亲缘关系 中图分类号:S663.1 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2008)06-932-05

Identifying grape cultivars and evaluating their genetic relationship by RAPD markers
WU Hong1,2,CHANG Yong-yi1*, HAO Yan3, WU Yu-xia1
(1College of Agronomy , Gansu Agricultural University , Lanzhou , Gansu 730070 China ; 2Iandscape and Horticultural Department , Jiangsu Husbandry and Veterinary College , Taizhou , Jiangsu 225300 China ; 3Gansu Fruit Research Institute , Lanzhou , Gansu 730070 China)

Abstract: Forty-seven genotypes of grape (Vitis L.) were analyzed with RAPD. 30 primers screened from 100 primers could amplify clearly and stably 216 bands. 121Bands were examined for random amplified polymorphic DNA , which occupied 56.01% . The relationships among the 47 cultivars based on their genetic distances were clustered into5 groups , Kyoto , Benizuiho , Ryo Ho and so on were clustered together. The results showed that the genetic polymorphism of grape was obvious , the cultivars , even having the same cross parentage , could be divided by RAPD. The relationships among the 47 cultivars also showed that genetic consistence of cultivar were related with genetic background. For example , Takatsuma and Beniikawa were clustered together ; some cultivars originated from the same hybridization combination couldn ’t display their genetic consistence , for example Jingyu and Augusta were clustered on the other side position. It is suggested that on the condition of hybrid parentage , the crossed progeny could be of genetic difference. Key words: Grape ; RAPD ; Genetic relationship

RAPD 技术自诞生以来 , 以需要样品 DNA 量
小、耗时少、程序较其它分子生物学方法简便 ,可检 测整个基因组 DNA 等优点 ,得到了广泛应用。 在葡 萄的应用研究上许多学者做了极具成效的工作,如 王跃进等 用 RAPD 技术分析了葡萄属(Vitis )圆叶
[1]

杂交组合为试材, 获得了 1 个与中国野生葡萄副梢 长度基因连锁的 RAPD 标记。 我们利用 RAPD 技术 对不同的葡萄品种进行分子水平的比较分析, 通过 试验设计及其相应的统计分析来做出聚类分析,探 讨葡萄栽培品种的分类和未知品种亲缘关系判别, 为育种工作奠定基础。

葡萄亚属(Muscadinia )及真葡萄亚属(Euvtis )美洲种 的相关性。 张立平等 [2]对葡萄属 20 个种、4 个变种、5 个品种及 4 个不同类型进行 RAPD 分析。 在葡萄基 因标记方面,李华等 [3] 以葡萄短梢 × 长梢的葡萄种间
收稿日期: 2008-03-20 接受日期 : 2008-08-19

1
1.1

材料和方法
材料

作者简介: 吴红,女,硕士。 Tel: 13815967309 ,E-mail : wh02gs@126.com

觹 通讯作者。 Author for correspondence. Tel: 13893357298 ,E-mail : changyy@gsau.edu.cn

6期



红等 : 利用 RAPD 标记研究部分葡萄品种的亲缘关系

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本试验所用葡萄材料分别采自中国科学院植物 研 究 所 植 物 园 (44-46 )、甘 肃 省 农 业 科 学 院 (1-43 ) 和甘肃农业 大 学 基 地 (47 ),共 计 47 份 (表 1 ),选 取

健壮、无病害的嫩叶,每份样品以保鲜薄膜袋包装, 置于冰壶中带回,放在 -70 ℃冰箱中保存。

1.2

方法

表 1 用于 RAPD 分析的葡萄品种 Table 1 Grape cultivars used in RAPD analyses
序号 材料名称 采集地 序号 材料名称 采集地

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Name of material
京秀 Jingxiu 红旗特早 Hongqiteza 达米娜 Tamina 玫瑰香 Muscat Hamburg 凤凰 51 Fenghuang 51 早玛瑙 Agate early 巨星 Juxing 超早娜 Chao zaona 秦龙大穗 Qinlongdasui 红地球 Red Globe 京玉 Jingyu 奥古斯特 Augusta 红高 Benitaka 红茧 Red Cocoon 美人指 Manicure Finger 秋红 Autumn red 龙眼 Longyan 瑞必尔 Ribier 黑大粒 Exotic 矢富罗莎 Yatomi Rosa 无核紫 Black Mounkka 奇妙无核 Fantasy Seedless 独角兽 Dujiaoshou 黑蜜 Black honey 京超 Jingchao

Place of collection
甘肃省农业科学院

No. 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47

Name of material
巨峰 Kyoho 早生高墨 Early Takasumi 户太 8 号 Hutai-8 高妻 Takatsuma 红井川 Beniikawa 藤稔 Fujimnori 超藤 Chaoteng 森田尼无核 Centenial Seedless 红瑞宝 Benizuibo 龙宝 Ryubo 京优 Jingyou 黄金指 Gold Finger 京亚 Jingya 优无核 Superior Seedless 黑爱莫 Emerald Seedless 奥迪亚无核 Otilia Seedless 克瑞森无核 Crimson Seedless 鲁贝无核 Ruby Seedless 康可 Concord 尼佳拉 Nigara 卡托巴 Catawba 白香蕉 Baixiangjiao

Place of collection
甘肃省农业科学院

Gansu Academy of Agriculture Science

Gansu Academy of Agriculture Science

中国科学院植物园

The Institute of plant,china science Academy
甘肃农业大学基地

The Base of Gansu Agriculture University

1.2.1 DNA 提取 葡萄基因组 DNA 提取参考文献 [4] 的方法,有改动。 0.5 g 幼嫩叶片置于预冷研钵中, 用液氮研磨至粉末。 转入一个 2 mL 离心管中,加入 750 μL 65℃ 预 热 的 CTAB 提 取 缓 冲 液 (2% (W/V) CTAB ,1.4 mol/L NaCl , 3% (V/V)β - 巯 基 乙 醇 ,100 mmol/L Tris-Hcl,pH 8.0,20 mmol/L EDTA ,20 mmol/L
偏重亚硫酸钠)和 150 μL PVP(20%),温和混匀。 65 ℃ 保温 60 min (每隔 15 min 混 匀 1 次 ),取 出 后 ,降 至 室温。 加入等体积(900 μL)的氯仿 / 异戊醇(24/1 )抽 提,温和而彻底的混合均匀,在室 温 下 离 心 (12 000

提,温和而彻底的混合均匀,在室温下离心(12 000 r/

min10 min )。 取 上 清 液 加 入 1/10 体 积 的 3 mol/L NaAc 和 2 倍体积预冷无水乙醇(-20 ℃ )轻轻混匀, -20 ℃静置 60 min 。 10 000 r/min 4 ℃离心 10 min ,沉 淀用 75% 乙醇,无水乙醇洗涤 2 次。 吹干样品并溶 解 20 μL 的高盐 TE 中备用。 1.2.2 RAPD 反 应 体 系 的 优 化 DNA 扩 增 用 MyGenie32 Thermal Block PCR 热循环仪(Bioneer 公
司)上进行,设计反应体系为:总反应体积为 25 μL, 内含 500 mmol/L KCl ,100 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0,

r/min 10 min )。 抽取上清液至另一离心管,加入等体 积 氯 仿 / 异 戊 醇 (24/1 ), 混 合 均 匀 , 在 室 温 下 离 心 (12 000 r/min 10 min )。 上 相 转 移 至 一 洁 净 的 离 心
管,加入 2/3 倍体积的预冷(-20 ℃ )异丙醇,温和混 匀,可见絮状沉淀,用灭菌牙签挑出置于另一离心管 中,用 75%乙醇,无水乙醇洗涤 2 次。 小心去上相,将 沉淀物在室温下短暂吹干。 将沉淀物溶于 500 μL 高 盐 TE (10 mmol/L Tris-Hcl, 1 mmol/L EDTA pH 8.0 ,1

25 ℃ ), dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 各 250 μmol/L , 1 mmol/L MgCl2,0.15 μmol/L 的 引 物 ,28 ng 的 模 板 DNA ,1 U TagDNA 聚 合 酶 (PromegaCo.Madison ,WI , USA )。 RAPD 反应扩增程序为:94 ℃ 预变性 4 min , 94 ℃变性 45 s ,37 ℃退火 55 s ,72 ℃ 延伸 80 s ,40 个
循环,72 ℃ 延伸 10 min 。

mol NaCl )。 加入 RNase A 至终浓度 10 mg/L , 并于 37 ℃保温 90 min。 加入等体积的氯仿 / 异戊醇(24/1)抽

1.2.3 RAPD 产 物 观 察 反 应 结 束 后 ,PCR 产 物 置 4 ℃ 冰 箱 中 保 存 备 用 , 或 直 接 用 1.0% 琼 脂 糖 凝 胶 (1% normal molecular grade agarose plus 1% NaSiere GTG agarose ,FMC )电泳分离,电极缓冲液为 1×TAE

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电泳缓冲液 (50×TAE 缓冲液:2 mmol/L Tris-Acetic

groups linkage 法进行聚类分析 [6]。

acid ,50 mmol/L EDTA pH 8.0 ), 在电压 110V , 电泳 40~60 min ,然后将凝胶在 5 g/L 溴化乙锭中染色 30 min ,在紫外灯下观察照相,每个 PCR 反应至少重复 3 次 , 反 应 产 物 凝 胶 电 泳 时 用 购 自 GIBCOBRL 的 100 bp 梯度的标准 DNA 作分子量参照 [5]。 1.3
数据记录及统计 根 据 电 泳 图 谱 中 带 的 有 无 ( 有 Present=1 , 无

2
2.1

结果与分析
葡萄基因组 DNA 的提取 实验在传统 CTAB 法基础上附加了适量的 PVP

和 β-巯基乙醇两种重要的稳定剂和抗氧化剂,使得 所提的 DNA 呈无色透明絮状沉淀, 在 1.0% 琼脂糖 电泳胶上呈现 1 条完整谱带,表明所提的 DNA 片段 大而完整,无 RNA 污染,也未发生明显的降解现象, 适合于对基因组的分子检测分析。 部分葡萄的基因 组 DNA 的电泳检测结果如图 1 。

Absent=0 )记载得到数据。 对供试品种应用 SPSS10.0
统 计 软 件 分 析 , 按 照 欧 几 里 德 距 离 平 方 (Squared

Euclidean Distance ),计算得到所有供试葡萄品种间 欧 氏 不 相 似 性 系 数 平 方 矩 阵 ; 并 按 照 Between 1 DNA 2 3 4 5 6 7 8

2.2
12

引物筛选及扩增结果
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

9 10 11

图1

用改良 CTAB 法获得的部分葡萄基因组 DNA

1. 京秀; 2. 玫瑰香; 3. 早玛瑙; 4. 超早娜; 5. 红地球; 6. 京玉;7. 奥古斯特; 8. 秦龙大穗; 9. 早生高墨; 10. 红井川; 11. 藤稔; 12. 超藤;13. 美人 指;14. 红瑞宝;15. 龙宝; 16. 京优;17. 京亚; 18. 户太 8 号;19. 高妻; 20. 森田尼无核; 21. 优无核; 22. 康可

Fig. 1 The genomic DNA of some grape extracted by improved CTAB method
1. Jingxiu ;2. Muscat Hamburg ; 3. Agate early ; 4. Chaozaona ; 5. Red Globe ; 6. Jingyu ; 7. Augusta ; 8. Qinlongdasui ; 9. Early Takasumi ;10. Beniikawa ; 11. Fujimnori ; 12. Chaoteng ; 13 Manicure Finger ; 14. Benizuibo ; 15. Ryubo ; 16. Jingyou ; 17. Jingya ; 18. Hutai-8 ; 19. Takatsuma ; 20. Centenial Seedless ; 21. Superior Seedless ; 22. Concord

以红地球为试材, 对选用的 100 个随机引物进 行筛选,大多引物能扩增出若干条带。 从中选出 30 个扩增条带清晰、 多态性好的随机引物作为 RAPD 分析引物, 而没有扩增产物或扩增条带很少以及重 复性差的随机引物均被淘汰。

用筛选出的 30 个引物对 47 份葡萄品种一一进 行扩增反应, 结果共扩增出 216 条带, 其中多态性

DNA 带 121 条,占总数的 56.01% 。 每个引物扩增的 条带数目为 4~10 ,平均 1 个引物扩出 7.2 条带,扩出 的 DNA 带大小在 100 bp~2.0 kp (表 2)。

表 2 供试材料 DNA 随机扩增所用引物及 RAPD 标记数 Table 2 RAPD primer used for amplification and the RAPD markers
引物编号

Primer code AU-02 AO-15 AM-10 AO-09 AO-01 AO-11 AM-02 AM-09 AX-08 AA-15 AX-06 AA-16 AM-11 AU-03 AU-18

5 ’-3 ’序列 5 ’-3 ’sequence CCAACCCGCA GAAGGCTCCC CAGACCGACC CCAGATGGGG AAGACGACGG GGGGGCTTGA ACTTGACGGG TGCCGGTTCA AGTATGGCGG ACGGAAGCCC AGGCATCGTG GGAACCCACA AGATGCGCGG ACGAAACGGG CACCACTAGG

RAPD 标记数 RAPD markers 8 8 8 6 5 5 10 6 4 8 7 7 7 8 7

引物编号

Primer code AO-03 AM-06 AU-08 AA-06 AX-10 AA-04 AX-03 AA-18 AX-20 AX-05 AA-10 AO-02 AA-05 AU-10 AX-02
总和

5 ’-3 ’序列 5 ’-3 ’sequence AGTCGGCCCA CTCGGGATGT CACCGATCCA GTGGGTGCCA CCAGGCTGAC AGGACTGCTC CCAAGAGGCT TGGTCCAGCC ACACTCGGCA AGTGCACACC TGGTCGGGTG AATCCGCTGG GGCTTTAGCC GACATCGTCC GGGAGGCAAA

RAPD 标记数 RAPD markers 10 6 7 9 6 8 5 10 7 9 8 6 8 7 6 216

6期



红等 : 利用 RAPD 标记研究部分葡萄品种的亲缘关系

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这 30 个引物间的检测效率相差很大,每个引物 所扩增出产物的多态性在各品种中分布数量不同, 各引物扩增产物电泳图谱表明, 有些位点仅在个别 品种中表现出多态性, 而有些位点只在个别品种中 能检测到。 位点 AO-15-2300 bp 只有在京秀葡萄品 种中检测到; 位点 AA-18 -1200 bp 只有在玫瑰香、 凤凰 51 和红地球中检测到;位点 AA-18-700 bp 在 京秀、红旗特早和京玉中表现出多态。 引物 Au-02 、

一致度最大,而 11 (京玉)与 12 (奥古斯特),均为同 父母本的杂交后代, 但 2 者未能表现最大遗传一致 度,在聚类图中处于相邻的位置,说明无性繁殖的葡 萄在双亲基因型杂合条件下, 有性杂交通过基因重 组,杂种后代也可呈现出有较大遗传差异的个体。

AO-15 和 AA-16 扩增电泳图谱见图 2。

卡 托 巴 Catawba

图2

引物 AU-02 、AA-16 、AO-15 对 47 个葡萄基因型的扩 增产物的琼脂糖电泳结果
M. DNA 分子质量; 1~47 对应品种名同表 1 。

奥 迪 亚 无 核 Otilia seedless

图3

47 个葡萄品种的 RAPD 聚类分析树状图 on RAPD marker

Fig. 3 Tree diagram of 47 cultivars based

Fig. 2 Amplification products from genomic DNAs of 47 grape gernotype using AU-02 ,AA-16 and AO-15 separated on 1.0% agrose gel
M. DNA mark ; cultivar name of 1 to 47 same as Table 1.

3
3.1





葡萄基因组 DNA 的提取 由于葡萄叶内含有较多的色素、 酚类以及多糖

2.3

葡萄 RAPD 标记的聚类分析 在 13.5 阈值下可将 47 个品种划分为 5 类。第 1

等次生物质,用传统的 CTAB 法所提取的 DNA 质量 不高,不能作为 PCR 扩增的模板及进行酶切分析 [7]。

类包括巨峰、红瑞宝、龙宝、红井川、高妻、京优、京亚 等,主要是巨峰系品种;第 2 类包括玫瑰香、红旗特 早、达米娜、凤凰 51、早玛瑙、京秀,主要是早中熟的 欧亚种品种;第 3 类包括美人指、瑞必尔、黑大粒、红 地球、黑爱莫、秋红等,主要是晚熟的欧亚种品种;第

PVP 最好以固体的形式加入,不能事先配成储存液,
否则会与空气中的氧作用而失去效果。 同时在 DNA 提取过程中要得到高质 量 的 DNA 还 需 注 意 : 1) 就 取材时期而言,幼嫩叶片含较少的色素、酚类以及多 糖等次生物质,所提取的 DNA 的质量和纯度比其它 时期叶片 DNA 的质量和纯度高。 幼嫩叶片提取的

4 类包括康可、尼加拉、白香蕉、卡塔洼、黄金指,主 要由欧美杂种品种组成;第 5 类包括无核紫、奇妙无
核、克瑞森无核、鲁贝无核、森田尼无核、优无核、无 核奥迪亚,由一些无核品种组成(图 3) 。其中 28 (高 妻)与 29 (红井川),34 (红瑞宝)与 35 (龙宝)的遗传

DNA 颜色为白色,D260 nm/D280 nm 达 2.0,产量也较高,其 它各时期叶片 D260 nm/D280 nm 在 1.8 以 下 , 产 量 较 低 。 2) 从 RNase 的酶解实践摸索上发现,对葡萄幼嫩叶

936









25 卷

片而言,RNase 酶解时间在 1~2 h , 这样才能更大的 发挥 RNase 的效用和除净 RNA , 试验中以采用 1.5

的结果,而不是形态特征或表现形式的分类 [15]。 参考文献 References:
[1] WANG Yue-jin ,LU Jiang. Identification of hybrids derived fromVitis rotundifolia×Vitis viniferaby RAPD analysis[J]. Acta Univ Agric Boreali-occidentalis ,1997 ,(3 ): 17-20. 王 跃 进 ,卢 江 . 用 RAPD 分 析 鉴 定 葡 萄 属 远 缘 杂 种 [J]. 西 北 农 业 大学学报,1997 ,(3 ): 17-20. [2] ZHANG Li-ping ,LIN Bo-nian ,SHEN De-xu ,WU Ping. Taxonomy of Vitis by RAPD[J]. Acta Horticulturae Sinica ,1998 ,25 (2 ): 191194. 张立平, 林伯年,沈德绪,吴平 . 葡萄属 RAPD 分 类 研 究 [J]. 园 艺 学报,1998 ,25 (2 ): 191-194. [3] LI Hua ,CHEN Yu-wen ,LI Pei-hong ,WANG Hua. RAPD markers of axillary shoot length of Chinese wild grapes[J]. Journal of Fruit Science,2007 ,24 (5 ): 595-599. 李华,程玉文,李佩洪,王华 . 中国野生葡萄副梢长度的 RAPD 标 记 [J]. 果树学报,2007 ,24 (5 ): 595-599. [4] STAUB J , BACHER J , POETTER K. Sources of potential errors in the application of random amplified polymorphism DNAs in cucumber[J]. HorScience , 1996 , 31 (2 ): 262-266. [5] WANG Guan-lin ,FANG Hong-jun. The principle and technology in gene engineering of plants[M]. Beijing: Science Press , 1998: 370372. 王 关 林 ,方 宏 筠 . 植 物 基 因 工 程 原 理 与 技 术 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,1998: 370-372. [6] XIA Ming ,LUAN Fei-shi. LI Jing-peng. Study on influencing factors of RAPD and optimization of RAPD experiment conditions[J]. Bulletin of Botanical Research ,1999 ,19 (2 ): 56-59. 夏 铭 ,栾 非 时 ,李 景 鹏 . RAPD 影 响 因 素 的 研 究 及 实 验 条 件 的 优 化 [J]. 木本植物研究,1999 ,19 (2 ): 56-59. [7] ZHAO Huai-bao ,FENG Jian-rong , JIANG Di-jun ,LIU Huai-feng , FAN Xin-min. A comparing study on methods of Vitis DNA extraction[J]. Journal of Shihezi University: Natural Science ,2000 ,4 (2 ): 117-121. 赵怀宝,冯建荣,蒋迪军,刘怀锋,樊新民 . 葡萄 DNA 提取与纯化 方法的比较研究 [J]. 石河子大学学报 : 自然科学版,2000 ,4 (2 ): 117-121. [8] WEEDEN N F ,TIMMERMAN G M , HEMMAT M. Inheritance and reliability of RAPD markers[J]. Joint Plant Breeding Symposia Series , November 1992. Minneapolis , Minnesota. Applications of RAPD Technology to Plant Breeding , 1992 (1 ): 12-16. [9] WANG Yue-jin ,LU Jiang. The research on RAPD genetic markers of grape seedlessness gene[J]. Journal of Northwest A & F University Nat. Sci. Ed. ,1996 ,5 (24 ): 10-20. 王 跃 进 ,卢 江 . 葡 萄 无 核 基 因 的 RAPD 遗 传 标 记 的 研 究 [J]. 西 北 农业大学学报 : 自然科学版,1996 ,5 (24 ): 10-20. [10] DONG Ji-xin ,LIN Bo-nian ,HE Zu-hua. Studies on polymorphisms of genomic DNA in vitis [J]. Journal of Zhejiang Agricultural University ,1998 ,24 (2 ): 219-220. 董继新,林伯年,何祖华 . 葡萄属植物基因组 DNA 的多态性分析 [J]. 浙江农业大学学报,1998 ,24 (2 ): 219-220. [11] VIDAL J R ,MORENO S ,GOGOGCENA Y. On the genetic relationships and origins of six grape cultivar of Galicia (Spain ) using RAPD markers[J]. Amer J of Enology and Viticulture ,1999 ,50 (1 ): 69-75. [12] GOGORCENA Y. Evaluation of RAPD marker consistency for detection of polymorphism on apricot[J]. Scie ntic Horticultural ,1994 , 59: 163-167. [13] LOUREIRO M D ,MARTINEZ M C. Molecular marker analysis of vitis vinifera Albarino and some similar grapevine cultivars[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science,1998 ,125 (5): 842 -848. [14] ZUO Da -xun ,YUAN Yi -wei. The geographic distribution and utilization of vitis plant[C]. The Research Selected Works of Nanjing Botanical Garden Mem. Sun Yat -Sen. phoenix science pres ,1981: 25-31. 左大勋,袁以苇 . 我国葡萄属植物的地理 分 布 及 利 用 [C]. 南 京 中 山植物园研究论文集,南京 : 江苏科学技术出版社,1981: 25-31. [15] WANG Xiao -quan ,ZOU Yu -ping ,ZHANG Da -ming. The issue of RAPD analysis in studies of genetic diversity and systematics [J]. Journal of Plant ,1996 , 38 (12 ): 954-962. 汪 小 全 ,邹 喻 苹 ,张 大 明 . RAPD 应 用 于 遗 传 多 样 性 和 系 统 学 研 究中的问题 [J]. 植物学报,1996 , 38 (12 ): 954-962.

h 为宜。 本试验采用 0.5、1、1.5、2、2.5 h 为酶解时间, DNA 的 产 量 分 别 为 47、53、57、57.1、57 μg/g 鲜 质
量。 表明如时间过短,Rnase 酶作用不完全,如过长,

Rnase 酶已无酶解能力。 进行 DNA 沉淀时,若既要
节约时间,又想获得高纯度的 DNA 样品,则可加入 2/3 倍体积预冷异丙醇进行沉淀。 用此法所获得的 DNA 质量和纯度与用无水乙醇沉淀所获得的 DNA 没有多大差别。

3.2

RAPD 技 术 在 葡 萄 遗 传 多 样 性 和 品 种 鉴 定 中 RAPD 技术被广泛的应用于遗传多样性研究是

的应用 由于它具有丰富的多态性和易操作性, 它适合于检 测种及其以下水平的多样性 [8],包括野生植物天然居 群的结构分析 [9],种质资源的评估 [10],栽培植物品种 的鉴定等 [11]。 Gogorcena[12]先后对 31 个栽培葡萄品种 进行 RAPD 分析,从中选出可重复带型,可正确区分 所有品种的无性系等。 Loureiro 等 [13]对来自 18 个不 同地区的欧洲葡萄 Albarino ,4 个与 Albarino 有亲缘 关系的品种,2 个错误命名的品种, 用 20 个 RAPD 引物和 6 个微卫星位点进行分析, 结果证明了这些 异名的品种都是 Albarino 。 本研究结果表明:葡萄品 种间的遗传多态性有明显差异, 即使父母本相同的 品种(姊妹系品种),也能分开。如京玉和奥古斯特同 为意大利和葡萄园皇后的杂交后代; 红瑞宝和龙宝 同为金玫瑰和黑潮的杂交后代, 利用 RAPD 技术很 容易分开。 从聚类分析结果来看, 大部分品种的结果与植 物学传统分类相吻合, 能清晰看到各品种间的遗传 差距和亲缘关系 [14]。 具有亲缘关系近、遗传差异小的 品种很早就聚在一起,如 28 (高妻)与 29 (红井川),

34 (红瑞宝)与 35 (龙宝)的遗传一致度最大,这与两
品种的遗传背景极为相符有关, 高妻与红井川亲本 均为先锋 ×森田尼无核;红瑞宝与龙宝亲本均为金玫 瑰(4×)×黑潮,故遗传一致度高。 有的品种也表现出 遗 传 一 致 度 较 大 , 其 中 的 11 ( 京 玉 ) 与 12 ( 奥 古 斯 特),均为同父母本的杂交后代, 但 2 者未能表现最 大遗传一致度, 在聚类图中处于相邻的位置, 从而 说明有性杂交的基因重组,呈现出不同的基因型。说 明 RAPD 用于种质资源的鉴定具有独特的优点,实 验中建立的 RAPD 扩增体系用于葡萄的分类和品种 鉴定,是较为可靠的,这是因为 RAPD 分类的依据是 以 DNA 模扳扩增的多态性 DNA 片断进行聚类分析


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刘新芝等利用RAPD 标记首次对我国玉米自交系进行了杂种优势群 划分。 2.2 亲缘关系和遗传多样性的研究 基因型不同的品种或不同亲缘关系的物种, 基因组内核苷酸...
中国大葱育种研究概况
利用RAPD技术标记能够 在分子水平上进行物种品种的鉴定及亲缘关系分析,方法简便、...孙合军研究了大葱在完 全隔离授粉的条件下,大葱部分单株上发生了无融合生殖,...
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