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三种鳖线粒体DNA细胞色素b基因序列的比较分析


第 30 卷 第 4 期 2 0 06 年 7 月

水 生 生 物 学 报
ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA

Vol. 30, No . 4 July, 2 0 0 6

三种鳖线粒体 DNA 细胞色素 b 基因序列的比较分析
陈合格 刘文彬 李建中 张轩杰
4100

81)

( 湖南师范大学生命科学学院, 长沙

摘要: 对中华鳖、 砂鳖 和山 瑞 鳖线 粒 体 DNA 细胞 色 素 b 基 因进 行了 引 物 设计、 PCR 扩增、 序列 测 定和 PCR -PFLP ( Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism) 分 析。研究 结果 表明 中华 鳖、 鳖与 山瑞 鳖线 粒 体 砂 DNA Cytb 基因的序列全长相同, 均为 1140bp, 其 A、 G、 含量相似, 分别为 378 个( 33. 2% ) 、 个( 28. 2% ) 、 个 C、 T 322 122 ( 10. 7% ) 、 个( 27. 9% ) 、 个( 32. 7% ) 、 个( 28. 4% ) 、 个( 10. 9% ) 、 个( 28. 0% ) 、 个( 33. 3% ) 、 个 318 373 324 124 319 380 330 ( 28. 9% ) 、 个( 11. 1% ) 、 个( 26. 7% ) 。同源性及序列差异 率分析表明: 中华 鳖与砂鳖 b 基因序列的 同源性 为 127 303 92.3% , 中华鳖、 山瑞鳖的 为85. 0% , 砂鳖、 山瑞 鳖 的为 84. 1% ; 中 华 鳖与 砂 鳖 b 基 因 核苷 酸 序列 间 的 差异 率 为 7. 7% , 中华 鳖、 山瑞鳖间的序列差异率为 15. 0% , 砂鳖、 山瑞鳖 间的序 列差异 率为 15. 9% , 而 中华鳖、 砂鳖、 山瑞 鳖 各自 个体间的序列差异率分别为2. 37% 、 88% 和0. 18% , 种间差 异显著。用 内切酶 酶切分 析其扩 增产物, 结果 表 0. 明: 用内切酶 Nde 可准确鉴别砂鳖, 而用内切酶 BamH 则可准确鉴别山瑞鳖。内切酶 Nde 和 BamH 的联 用 分析 , 可使这三种鳖在分子水平都得到明确的 鉴定。从三 种鳖线 粒体 DNA Cytb 基因核 苷酸序列 的显著 差异和 酶 切位点的变化, 可以进一步证明砂鳖是不同于中 华鳖的鳖属一新种。 关键词: 中华鳖; 砂鳖; 山瑞鳖; 细胞色素 b; PCR RFLP 分析; 分子鉴定标记 中图分类号: Q173 文献标识码: A 文章编号: 1000 3207( 2006) 04 0380 06 -

中华鳖( Pelodiscus sinensis ) 是中国重要的特种经 济动物, 其隶属于龟鳖目( Testudinata) 、 鳖科( Triony [ 1] chidae) 、 属 ( Pelodiscus ) 。山 瑞 鳖 ( Palea stein 鳖 dachneri ) 俗称瑞鱼、 山瑞, 在国家重点保护野生动物 名录中被列为国家 级保护动物, 其一般形态与中 华鳖 极 为 相 似, 隶 属 于 龟 鳖 目、 科、 瑞 鳖 属 鳖 山 ( Palea) 。传统观点认为, 中国鳖属动物仅有中华鳖 一种。1991 年, 周工健等在对湖南省鳖资源进行实 地调查时, 发现了一种与现有鳖种资料介绍完全不 同的新种 砂鳖( Pelodiscus axenaria ) , 又称铁壳、 灰壳。其与中华鳖体形较相似, 但个体较小, 体重一 般为 100 300g, 且在外形、 骨骼、 繁殖习性和生活习 性, 以及生化遗传学指标等方面与中华鳖均存在明 显的差异, 并判定砂鳖为鳖属一新种 [ 2] 。如能从分 子水平进一步予以证实并找到一个准确可靠的鉴别 方法来有效区分中华鳖、 砂鳖与山瑞鳖, 对于这 3 个 不同种鳖的种苗区分、 资源保护及合理开发利用具 有重要意义。
收稿日期: 2005 -29; 修订日期: 2006 -14 -10 -01 基金项目: 农业部 中华鳖标准 ( 编号: 1999 -1603161) 项目资助 -Q 作者简介: 陈合格( 1979

动物线粒体 DNA( mtDNA) 呈严格的母性遗传方 式, 这样 1 个个体就能代表一个母系集团, 因而只需 少量材料就能反映群体的遗传结构, 便于进行群体 分析。随着分子生物学的发展, 动物线粒体 DNA 上 的细胞色素 b ( cytochrome b, Cytb ) 基因因其进化速 度适中被认为是探讨近缘种间和种内遗传分化程度 的良好指标, 近年来被广泛应用于两栖类、 爬行类、 鱼类等的系统发育、 种类鉴别等的研究 [ 3 5] 。本研 究以 中华 鳖、 鳖和 山 瑞鳖 为 研究 材 料, 进 行了 砂 mtDNA Cytb 基因的引物设计、 扩增及其序列测 PCR 定, 分析了 3 种鳖线粒体 DNA Cytb 基因核苷酸序列 间的差异及其酶切位点的差异情况, 为确定它们的 种间遗传关系和分子方法分类提供了实验依据, 获 得了 3 种鳖的分子鉴定标记。 1 材料与方法 1 1 材料来源 中华鳖 12 只取自湖南省中华鳖原 种场, 5 只购买于新一佳超市; 17 只野生砂鳖中的 7

) , 男, 湖南祁阳人, 硕士, 从事水生动物遗传与育种研究

通讯作者: 张轩杰, 男, 教授, 博导, Tel: 0731 -8872552, E -mail: zh603@ tom. com

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只取自常德市, 其余 10 只取自郴州市安仁县 永乐 江; 3 只野生山瑞鳖全部取自广西省南宁市。 1 2 引物设计 参照平鳖( Dogania subplana, 登录号 NC -002780) 、 海龟( Chelonia mydas, 登录号 AB012104) 及锦 龟 ( Chrysemys picta, 登 录号 AF069423) 线粒 体 DNA Cytb 基因 两侧 tRNA-Glu、 tRNA-T hr 基因序列, 选取其保守区设计用于扩增 3 种鳖 Cytb 基因的引 物 C F: GGACTYTAACCAAGACCAATG 和 C TCAA -R: TCTTTGGTTTACAAGACC, 由上海生物工程公司( San gon) 合成。 1 3 基因组 DNA 的提取及线粒体 DNA Cytb 基因的 PCR 扩增 将中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖放血后, 立 即取新鲜的肝脏进行基因组 DNA 的提取, 具体操作 参照张辉等[ 6] 的方法稍有改进, 测定浓度后 4 存放。 dNTP, Tap 酶及反应的 Buffer 和内切酶 Sal 、 Xbo 均购自北京华美生物工程公司( Sino American Biotech nology Company) , PCR 反应的体积为 25 L, 其中: Taq 酶 1U; 浓度为 1mmol/ L 的 dNTP 5 L; 20mol/ L 的上、 下 游引物各 1. 0 L; DNA 模板约 100ng。使用美国 AB 公 司的 GeneAmp PCR System2700 PCR 仪进行扩增, 循环 参数为: 94 预变性 5min, 然后进入如下 循环: 94 50s, 52 45s, 72 1min 20s, 循环 35 次, 循环结束后, 72 延 伸 10min, 于 4 保 存。取 5 L PCR 产 物 用 1. 2% 琼脂糖凝胶, 5V/ cm, 进行电泳检测。 1 4 连接、 转化反应及序列测定 将割胶纯化后的

脂糖凝胶, 5V/ cm 进行电泳分离约 1h, EB 染色, 然后 用凝 胶成 像系 统 扫描 并 保存 结 果。在 经 过 PCR RFLP 检测的中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖中, 各选取一只 进行 Cytb 基因的克隆测序, 以检测 PCR -RFLP 鉴定 标记的可靠性。 2 结果 2 1 中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖线粒体 DNA Cytb 基因 的 PCR 扩增 利用参照平鳖、 海龟、 锦龟线 粒体 DNA tRNA Glu、 -Thr 基因相应序列的保守区设计的引物进 tRNA 行中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖 mtDNA Cytb 全基因的 PCR 扩增, 得到了高效扩增的清晰的目的条带, 且空白对 照实验未 出现 扩增 ( 图 1) , 说明 利用 近 缘种 动物 mtDNA 的同源性, 可以设计龟鳖目动物的相应片段 引物, 且以此方法设计的引物应该具有普遍性, 从而 为本研究提供了分子基础。

图 1 mtDNA Cytb 基因 PCR 扩增结果

PCR 产物分别与 PMD 18 载体( 大连宝生物产品) -T 进行连接, 连接及转化反应均按 PMD 18 载体试剂 -T 盒的要求进行。碱裂解法提纯质粒, 用 PCR 方法和 Sal 、 Xbo 双酶切法确认片段的正确插入。挑选 插入正确的克隆送往上海生物工程公司( Sangon) 进 行序列测定。 1 5 限制性内切酶酶切位点分析与 PCR -RFLP 检 测 基于中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖 Cytb 基因间 的序列差异, 用 Jellyfish( version 1. 4) 软件分 析三种 鳖的酶切位点差异情况, 确定 Nde 是可用于 PCR RFLP 方法鉴别砂鳖的限制性内切酶, BamH 可被 用来鉴别山瑞鳖。并通过分析 限制性核酸内 切酶 Nde 、 BamH 的识别位点在各自序列中 所处的 位置, 分别 计算 3 种鳖 PCR 产物 酶切后 的片段 长 度。用内切酶 Nde BamH 分别对 17 只中华鳖、 17 只砂鳖和 3 只山瑞鳖扩增后的 PCR 产物进行酶 切分析, 酶切体系为 20 L, 其中: 10 Buffer 2 L, 乙 酰化 BSA 2 L, PCR 产物 5 L, 内切酶 5U, 余 用灭菌 ddH20 补足, 37 酶切 3 4h, 酶切产物用 1. 2% 的琼

Fig. 1 PCR amplification results of mitochondrial DNA Cytbgene
M: 200bp DNA 分子量标准 200bp DNA ladder marker; 1 2. 中华鳖 Pelodiscus sinensis; 3 4. 砂鳖 Pelodiscus axenaria; 5 6. 山瑞 鳖 Palea st eindachneri; 7. 空白对照 blank control

2 2 三种鳖线粒体 DNA Cytb 基因全序列的测定 及分析 经测序中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖线粒体 DNA Cytb 基因扩增序列长度相同, 均为 1253bp( base pair, 包括 tRNA -Glu、 -Thr 基因的部分序列和 Cytb 基因序 tRNA 列) , 其中 Cytb 基因全长均为 1140bp。统计结果显示 其 A、 G、 含量相似, 分别为 378 个( 33. 2% ) 、 个 C、 T 322 ( 28. 2% ) 、 个 ( 10. 7% ) 、 个 ( 27. 9% ) ; 373 个 122 318 ( 32. 7% ) 、 个 ( 28. 4% ) 、 个 ( 10. 9% ) 、 个 324 124 319 ( 28. 0% ) ; 380 个 ( 33. 3% ) 、 个 ( 28. 9% ) 、 个 330 127 ( 11. 1% ) 、 个( 26. 7% ) 。用 Jellyfish 软件分析三种 303 鳖线粒体 DNA Cytb 基因全序列的同源性、 种间及种 内个体间核苷酸的差异率, 结果显示: 中华鳖与砂鳖 此基因序列的同源性为92. 3% , 中华鳖、 山瑞鳖的为 85. 0% , 砂鳖、 山瑞鳖的为 84. 1% ; 中华鳖、 砂鳖序列

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间的差异率为 7. 7% , 中华鳖、 山瑞鳖间的序列差异 率为 15. 0% , 砂鳖、 山瑞鳖间的序列差异率为 15. 9% ; 而中华鳖、 砂鳖、 山瑞鳖各自个体间的序列差异率分 别为2. 37% 、 88% 和 0. 18% 。利 用 BLAST 与 Gen 0. Bank 中线粒体 DNA 序列进行比对, 结果表明其与其

他物种 Cytb 基因序列有很高的同源性。用 ClustalW ( 1. 82) 进行 Cytb 基因全序列间的在线比对( http: / / www. ebi. ac. uk/ clustalw/ index. html) , 比对结果见图 2。目前这三个序列已提交 GenBank( 登录号分别为: AY583692、 AY583693 和 AY743417) 。

图2 GGATCC 示 BamH

中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖线粒体 DNA Cytb 基因全序列( 1140bp) 的识别序列, CATATG 示 Nde 的识别序列, * 表示不同的核苷酸位点

a. 中华鳖 Pelodiscus sinensis; b. 砂鳖 Pelodiscus axenaria; c. 山瑞鳖 Palea st eindachneri

Fig. 2 The complete nucleotide sequence ( 1140bp) of mitochondrial DNA cytb gene of a, b and c GGATCC shows the recognize sequence of Msp enzyme, CATATG shows the recognize sequence of Nde enzyme, * shows different nucleotide sites

2 3

内切酶酶切扩增产物片段大小的计算和 PCR RFLP 检测 用 Jellyfish 软件对三种鳖 Cytb 基因的核苷酸序列

将分别为 1090bp、 163bp, 这有别于中华鳖、 砂鳖的相应 片段被酶切后的结果( 图 4) 。三种鳖的 PCR -RFLP 检测 结果( 图 3 和图 4, 最前面的带为引物二聚体) 显示, 这 和用 Jellyfish 软件预测的结果相一致。

进行限制性酶切分析, 预测结果显示在测定的 1253bp 片段中( 图 2) : 中华鳖、 山瑞鳖的序列中无 Nde 酶的识 别位点, 从而将在电泳图上仅能见到一个片段, 而砂鳖 的在 336 341bp 处有一个 Nde 酶的识别位点, 使得 砂鳖的 PCR 产物经 Nde 酶切后, 将会形成大小分别 为 916bp、 337bp 的 2 个片段( 图 3, 泳道 2 和 3 最后面的 条带为 PCR 产物未被完全酶切的结果) ; 中华鳖、 砂鳖 的序列中在 376 381bp 处均有一个 BamH 酶的识别 位点, 使得酶切后将会形成大小分别为 877bp、 376bp 的 2 个片段, 而山瑞鳖的 BamH 酶的识别位点位于其序 列的 163 168bp 处, 使酶切后形成的 2 个片段的大小

图 3 MtDNA Cytb 基因N de

酶切图

Fig. 3 Restriction results of Cytb gene by using Nde M: 100bp DNA 分 子量 标 准 100bp DNA ladder marker; 1. 中华 鳖的 PCR 产物 PCR amplification results of P . sinensis; 2 3. 砂鳖 P . axenaria; 4 5. 山瑞鳖 P . steindachneri; 6 8. 中华鳖 P . sinensis

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图 4 MtDNA Cytb 基因 BamH

酶切图

Fig. 4 Restriction results of Mt DNA Cytb gene by using BamH M : 100bp DNA 分子量标准 100bp DNA ladder marker; 1 6. 中华鳖 P . sinensis; 7 12. 砂鳖 P. axenaria; 13 14. 山瑞鳖 P. steindachneri

3 3 1

讨论 三种鳖线粒体 DNA Cytb 基因序列间 的比较 分析 对中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖线粒体 DNA Cytb 基因

个体 间 的 序 列 差 异 率 分 别 为 2. 37% 、 88% 和 0. 0. 18% , 这明显低于种间的序列差异率, 且种间差异 显著; 其差异程度和将中华鳖、 砂鳖归为一属, 而将 山瑞鳖归为另一属相一致。中华鳖个体间的序列差 异率较大( 2. 37% ) , 这可能与中华鳖分布的范围广、 存在不同的地方种群及部分中华鳖取自养殖群体等 有关。李思发等[ 7] 对华东地区中华鳖 3 个地方种群 的 mtDNA Cytb 基因进行分析时, 就发现浙江绍兴、 江苏南京和山东青岛中华鳖群体间存在显著的遗传 差异( P < 0. 05) ; 刘至治等 [ 8] 对 5 个不同水系的中 华鳖进行 RAPD 分析时, 亦发现不同种群之间存在 较丰富的遗传多样性。而砂鳖和山瑞鳖个体间的序 列差异率较小, 分别为0. 88% 和0. 18% , 这与它们的 分布范围相对 较窄和材料来源于相邻 或同一个地 方, 且这些资源遭大量捕杀而导致的遗传多样性贫 乏有关。

的测序结果表明, 其全长均为 1140bp。A+ T 含量的 统计结果显示, 三种鳖 mtDNA Cytb 基因序列中 A+ T 含量与本研究设计引物所用的平鳖、 海龟及锦龟 的相应序列 A+ T 含量相似, 均为 A+ T > G+ C( 表 1) 。这与其他物种有一致的结果, 这提示在今后若 进行线粒体 DNA 的限制性片段长度多态性( RFLP) 分析时有必要选用识别富 含 AT 序列的内切酶, 这 样更利于多态性的揭示。用 Jellyfish 软件分析三种 鳖线粒体 DNA Cytb 基因全序列的差异率, 结果表明 中华鳖、 砂鳖序列间的差异率为 7. 7% , 中华鳖、 山 瑞鳖间的序列差异率为 15. 0% , 砂鳖、 山瑞 鳖间的 序列差异率为 15. 9% ; 而中华鳖、 砂鳖、 山瑞鳖各自
表1

中华鳖、 砂鳖、 山瑞鳖、 平鳖、 海龟、 锦龟线粒体 DNA Cytb 基因的碱基组成( % )

Tab. 1 Nucleotide composition of mitochondrial DNA Cytb gene of T. sinensis , T. axenaria, P . steindachneri, D. subplana, C. mydas and C. picta
种名 species 中华鳖 P . si nensis 砂 平 海 锦 鳖 P . axenaria 鳖 D . subplana 龟 C . mydas 龟 C . picta 山瑞鳖 P . steindachneri 腺嘌呤 A adenine 33. 2 32. 7 33. 3 33. 5 31. 6 31. 0 胸腺嘧啶 T thymine 27. 9 28. 0 26. 7 24. 9 25. 5 27. 1 鸟嘌呤 G guanine 10. 7 10. 9 11. 1 10. 6 11. 5 11. 2 胞嘧啶 C cyt osine 28. 2 28. 4 28. 9 31. 0 31. 4 30. 7 A+ T 61. 1 60. 7 60. 0 58. 4 57. 1 58. 1 序列总计 bp Total 1140 1140 1140 1140 1143 1140

3 2

分子鉴定标记方法分析

和组织特异性, 会直接影 响到检测结果的 可靠性; RAPD 鉴别技术重复性较差, 对 DNA 模板的质量要 求很高, 待测样品之间模板质量的差异会直接影响 到检测结果的准确性。 基于物种间 DNA 序列的核苷酸多态性而发展

目前, 用于鉴定亲缘关系较近的不同种的方法 有形态学判别、 同工酶鉴别和 RAPD 鉴别等。但由 于技术等方面的原因, 这些方法在实际应用中都存 在一定的局限。如同工酶鉴定标记存在个体特异性

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起来的分子技术为种的鉴定提供了无限的遗传标记 资源。一旦目的 DNA 片段得以扩增, 就可以方便地 用限制性内切酶进行分析且易于获得酶切片段长度 多态性, 目前 mtDNA 在鱼类中已被广泛用作物种间 鉴别的遗传标记
[ 9 16]

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。建立在 PCR 基础上的 RFLP

标记( PCR -RFLP) , 可 以通过 PCR 方法方 便地控 制 DNA 片段的 大小, 从而有效地限定 酶切位点数; 又 可以扩大模板量, 适用于微量组织样品的分析。由 于检测所需的组织材料的量很少, 尤其适用于物种 早期发育阶段的鉴别研究。孙红英等[ 17] 利 用线粒 体 DNA 16S rRNA 部分片段的 PCR -RFLP 标记, 对中 华绒螯蟹和合浦绒螯蟹成功地进行了快速有效的鉴 别; Angel s comesa a 等 [ 18] 利用线粒体 DNA 12S rRNA 部分片段的 PCR RFLP 标记, 对商用比目鱼 5 个不 同种进行了准确的鉴别。 Carrera E 等[ 12] 和C spedes A 等 利用细胞色素 b 基因的 PCR RFLP 标记, 分 别对大西洋鲑、 虹鳟和不同种的比目鱼进行了准确 的鉴别。王加连等 [ 19] 在测定中国水域真海豚 mtD NA 细胞色素 b 基因和控制区 部分序列的基础上, 发现中国水域的真海豚在分类 上归属于长喙 真海 豚; 杨光等 在测定采自浙江瑞安市的一头须鲸类 标本 mtDNA 细胞色素 b 基因和控制区部分序列的 基础上, 发现其可能是所罗门群岛的小布氏鲸。但 是把线粒体 DNA Cytb 基因作为龟鳖类动物不同种 的分子鉴定标记的提供者来加以研究, 在国内还未 见公开报道。Nde 、 BamH 两种酶的并用分析, 可形成三种鳖线粒体 DNA Cytb 基因经 Nde 后片段多少及经 BamH 酶切
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酶切后片段大小的差异,

因而可对中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖进 行准确的鉴别。 用 PCR -RFLP 方法对三种鳖进行检 测, 结果显 示该 标记的鉴定结果准确可靠, 可重复性好且未发现有 个体特异性。由于扩增的片段长度为 1253bp, 因而 扩增反应对模板 DNA 分子大小的质量要求不高, 从 而使得这个标记为中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖间的快速 鉴别提供了一种准确、 可靠、 于操作的分子 鉴定 易 途径。 从中华鳖、 砂鳖和山瑞鳖线粒体 DNA Cytb 基因 全序列的碱基显著差异和内切酶 Nde 、 BamH 酶切位点的变化, 可以进一步证明砂鳖是不同于中 华鳖的鳖属一新种。 参考文献:
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Angel s Comesa a, Paz Abella, Andr s Sanjuan. Molecular ident ifi cat ion of f ive commercial flatfish species by PCR

COMPARATIVE ANALYSIS OF MITOCHONDRIAL DNA CYTB GENE AND THEIR MOLECULAR IDENTIFICATION MARKERS IN THREE SPECIES OF SOFT TURTLES CHEN He -Ge, LIU Wen Bin, LI Jian -Zhong and ZHANG Xuan -Jie
( College of L i e Science , Hunan Normal University, Changsha f 410081)

Abstract:The primers for Pelodiscus sinensis, Pelodiscus axenaria and Palea steindachneri were designed by using the sequences of mitochondrial DNA tRNA Glu, tRNA -Thr gene of Dogania subplana, Chrysemys picta and Chelonia mydas, 1140 base pairs of mitochondrial DNA cytb gene were amplified and sequenced. The results show that the length of their sequences is the same, A, C, G, T contents are similar, the number of A, C, G, T is 378( 33. 2% ) , 322( 28. 2% ) , 122 ( 10. 7% ) , 318( 27. 9% ) in Pelodiscus sinensis; 373( 32. 7% ) , 324( 28. 4% ) , 124( 10. 9% ) , 319( 28. 0% ) in Pelodiscus axenaria and 380( 33. 3% ) , 330 ( 28. 9% ) , 127( 11. 1% ) , 303( 26. 7% ) in Palea steindachneri. Based on their sequence data, analysis with the software of Jel lyfish, we can know: the nucleotide percentage homology is 92. 3% between Pelodiscus sinensis and Pelodiscus axenaria, 85. 0% between Pelodiscus sinensis and Palea steindachneri, 84. 1% between Pelodiscus axenaria and Palea steindachneri; the nucleotide percentage divergence is 7. 7% between Pelodiscus sinensis and Pelodiscus axenaria, 15. 0% between Pelodiscus sinensis and Palea steindachneri, 15. 9% between Pelodiscus axenaria and Palea steindachneri, whereas the individual nu cleotide percentage divergence is 2. 37% in Pelodiscus sinensis, 0. 88% in Pelodiscus axenaria and 0. 18% in Palea stein dachneri. Restrict ion endonuclease analysis based on sequence data of their DNA fragments revealed the presence of polymorphic sites for Nde and BamH endonucleases. The restriction profiles obtained by agarose gel electrophoresis when amplicons and BamH enzymes allowed the unequivocal molecular identification of Pelodiscus axenaria, were respectively cut with Nde morphic sites for Nde

Palea steindachneri and Pelodiscus sinensis. Based on their obvious nucleotide percentage divergence and the changes of poly and BamH endonucleases in their sequences, it from the molecular level suggests Pelodiscus axe naria is a new species in Pelodiscus. Key words:Pelodiscus sinensis; Pelodiscus axenaria; Palea steindachneri; Cytb gene; PCR -RFLP assay; Molecular identifica tion marker


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