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猪干扰素


第 15 卷第 8 期 2007 年 8 月

中国医学工程

China Medical Engineering
1672- 2019 2007) 08- 0628- 04 (

Vol. 15 No. 8 Aug. 2007

文章编号:

论著 ? ?
<

br />猪干扰素 - γ 基因在大肠杆菌中的克隆 表达及其活性测定
王 丽 1, 刘金波 2, 何 涛 1, 郑小莉 1, 梅志强 1, 李 洪1
( 1 . 四川泸州医学院 医学分子生物学实验室, 四川 泸州 646000; 2. 郑州大学第一附属医院 肛肠外科, 河南 郑州 450052)
摘要: 目的 在 大 肠 杆 菌 中 高 效 表 达 重 组 猪 干 扰 素 γ( porcine interferon gamma, poIFN- γ ) , 并 对 其 抗 选择大肠杆菌偏爱密码子人工 合成了猪干扰素 - γ 成熟蛋白编码基因, 克隆 目的蛋

病毒活性进行初步研究。方法

至原核表达载体 pQE30 中, IPTG 诱导表达, 表达产物经变性、 复性、 纯化后, 测定其抗病毒活性。 结果

白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达 , 表达量占总菌体蛋白的 84.5% , 纯化后的纯度达到 95% 以上, 在

PK15 细胞上抗滤泡性口炎 病毒比活性为 6.2×105 U/ mg。结论
达, 表达产物具有抗病毒活性。 关键词: 猪 IFN- γ 基因; 原核表达; 抗病毒活性 中图分类号:

PoIFN- γ 基因在大 肠 杆 菌 中 得 到 了 高 效 表

Q786

文献标识码:



Clone, expr ession and activity analysis of the por cine inter fer on gamma in E. coli
WANG Li1, LIU Jin- bo2, HE Tao1, ZHENG Xiao- li1, MEI Zhi- qiang1, LI Hong1 (1.Laboratory of Medical Molecular Biology, Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan 646000, P.R.China; 2.Department of Coloanorectal Surgery, the First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450052, P.R.China)
) Abstr act: 【 Objective 】To express recombinant porcine interferon- gamma ( PoIFN- γ in E. coli and to study its Methods】By selecting the biased codon in E. coli, the porcine IFN- γgene was designed, syn- antiviral activities. 【 thesized and cloned into expression vector pQE30. After pQE30/PoIFN- γwas induced with isopropy- β D- thio- - galactoside ( IPTG) , the expressed product was purified using Ni- NTA agarose and its antiviral activity was tested. 【 Results】The target protein existed in form of inclusion body was expressed highly in E. coli and amounted to 84.5 % by total protein. The purified protein reached about 95%. Its specific antiviral activity was about 6.2× 5 U/mg on 10 PK15/VSV test system. 【 Conclusion 】Recombinant porcine interferon- gamma has been expressed in E. coli suc- cessfully. The purified product showed antiviral activity. Key wor ds: porcine interferon- gamma; procaryotic expression; antiviral activity

猪 干 扰 素 - γ ( porcine interferon gamma,

自 1990 年 DIJIKMANS 等 首 先 对 PoIFN- γ 基 因进行研究以来, 猪干扰素 - γ 基因已在大肠杆 菌、 昆虫细胞、 兔肾细胞、 酵母和仓鼠卵细胞中获得 了不同程度的表达 [2~4]。 大肠杆菌较其他表达细胞具 有生长快, 培养基价廉等优势, 目前仍然在基因工程 表达外源蛋白中发挥重要作用。为了研究和开发新

poIFN- γ) 是一类由 T 淋巴细胞、巨噬细胞和 NK
细胞等分泌的细胞因子。全基因为 501 个碱基, 编 码 166 个 氨基酸, 前 23 个 氨基酸为 信 号 肽 , 后 143 个氨基酸为活性成熟蛋白。 poIFN- γ 因具有显著抗 病毒和免疫调节功能而成为近年来研究的热点 。
收稿日期: 2007- 03- 12
[1]

? 628 ?

第8期



丽, 等: 猪干扰素 - γ 基因在大肠杆菌中的克隆表达及其活性测定

型的疫苗佐剂和相关生物制剂, 有效控制一些严重 危害养猪业的传染病, 本研究根据大肠杆菌密码子 的偏嗜性将 PoIFN- γ 成熟肽基因序列改造后人工 合成, 并克隆入原核表达载体 pQE30 中进行了高效 表达。

扩增条件为: 94℃预变性 2 min, 然后进行 94℃ 30 s,

52℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共 30 个 循 环 , 最 后 72℃ 延
伸 5 min。


1.1

材料与方法
材料

滤 克 PK15 细 胞 、 泡 性 口 炎 病 毒 (VSV)、 隆 载 体 表 大 PGEM- 3Z、 达 载 体 pQE30、 肠 杆 菌 TG1 和 M15 为 本 实 验 室 保 存 ; 标 准 核 酸 相 对 分 子 质 量( DNA
图1

poIFN- γ 基因合成示意图

Marker DL2000) 购自北京天为时代公司; 限制性内 切 酶 BamH I 和 Hind Ш 购 自 华 美 生 物 公 司 ; pfu DNA 聚 合 酶 和 T4 DNA ligase 购 自 大 连 宝 生 物 公 司; 异丙基硫代 - β- D- 半乳糖苷( IPTG) 与 5- 溴 - 4- 氯 - 3- 吲哚 - β- D- 半乳糖苷 ( X- ga1) 购于 Promega 公司; DNA 片 段快速 回 收 试 剂 盒 购 于 北 京 鼎 国 公 司 ; Ni—NTA sepharose 蛋 白 纯 化 系 统 购 于 QIAGEN 公司。 1.2 方法 1.2.1 猪 干 扰 素 - γ 基 因 的 合 成 寡 核 苷 酸 片 段 的优化与合成: 参照 GenBank 上的 poIFN- γ 基因 序列 (Accession No. DQ666352), 将去除信号肽后长 度为 432 bp 目的基因中的大肠杆菌稀有密码子, 根
据 在 线 设 计 软 件 http://gcua.schoedl.de/ 改 为 大 肠 杆 菌偏爱密码子。在其 5' 端添加 BamH I 酶切位点及 保护碱基 CG, 3' 端添加 Hind Ш 酶切位点、保护碱 基 CCC 和终止密码子 TGA 后, 整个序列全长为 450

Second PCR: Assembly PCR 产物经琼脂糖凝胶
电泳后, 参照 DNA 片段快速回收试剂盒说明书, 纯 化回收特异的 DNA 条带作为 Second PCR 的模板, 以 Up1 和 D1 为 上 下 游 引 物 , 量 均 为 0.4μL, 10×

PCR buffer 2μL, dNTP 1.6μL, pfu DNA 聚 合 酶
扩增条件为: 94℃预变性 0.2μL, 加水补足至 20μL。 1 min, 然后进行 94℃ 40 s, 55℃ 40 s, 72℃ 45 s, 共 30 个循环, 最后 72℃延伸 5 min。 1.2.2 基因的克隆与测序 PCR 产物经 1% 琼脂糖 凝胶电泳后 , 回收 450 bp 处 DNA 带 , 与 3Z 载 体 连 接。参考 《分子克隆实验指南》 采用氯化钙法制备 ,

TG1 感受态细胞。连接产物转化 TG1 感受态细胞, 筛选白斑, 碱法小量提取质粒, PCR 鉴定及 BamH I 和 Hind Ш 双酶切鉴定后, 阳性克隆送上海生物工
程有限公司测序。

1.2.3
鉴定

重 组 表 达 载 体 pQE30/ poIFN- γ 的 构 建 与 用 BamH I 和 Hind Ш 分别双酶切测序正确

bp。将整个基因分为 20 个相互重叠的寡核苷酸片 段, 正义链和反义链分别标记为 Up1 到 Up10 、 到 D1 D10。设计时 Up1 和 D1 两个片段相对较小, 分别为 32 bp 和 35 bp, 作为全长片段的两端引物, 其余寡核 苷酸片段约 48 bp, 委托北京奥科公司合成。
重叠 PCR 法合成 poIFN- γ 基因: poIFN- γ 基 因合成示意图如图 1 所示。 参 照 JEAN- MARIE ROUILLARD[5]文 献 并 进 行 一定修改, 通过二次重叠 PCR 法扩增 poIFN- γ 目 的基因。

的 3Z/poIFN- γ 载体和 pQE30 载体, 构建重组表达 载体 pQE30/poIFN- γ , 转化 E.coli TG1 中。筛选重 组质粒的转化子并提取重组质粒, PCR 和酶切鉴定 后, 阳性克隆送上海生物工程有限公司进行序列分 析。

1.2.4


表达 poIFN- γ 基因的工程菌构建及诱导表 取 阳 性 重 组 质 粒 pQE30/poIFN- γ 转 化 E.coli

Assembly PCR: 基 因 片 段 合 成 后 , 加 双 蒸 水 稀 释成 10 pmol/μL。 Up1 和 D1 各取 5μL, 其 他寡核 苷酸 片段各取 10μL, 混匀后 取 1μL 作 为 混 和 模 板, 反应体系为 50μL, 10×PCR buffer 5μL, dNTP 4μL, pfu DNA 聚合酶 0.5μL, 加水补足至 50μL。

M15, 挑取单 菌落 , 接 种 于 新 鲜 的 LB 培 养 基( 含 氨 苄 青 霉 素 50μg/mL, 卡 那 霉 素 10μg/mL) 中 , 37 ℃ 培养过夜。次日按 1∶100 接种于 3 mL 新鲜的 LB 培 养 基 ( 含 氨 苄 青 霉 素 50μg/mL, 卡 那 霉 素 10 μg/mL) 中, 37 ℃ 振荡培养至对数 生长期 OD600= 0.5~0.8 时, 加 IPTG 至终浓度为 0.025 mM, 分别于 25℃、 30℃、 32℃、 37℃诱导 6 h。 将 1.2.5 表 达 产 物 的 蛋 白 质 电 泳( SDS- PAGE)

? 629 ?

中国医学工程

第 15 卷

诱导的产物 12 000 r/min 离心 1 min 后, 收集菌体, 加 入 600μL 0.02 M PB 悬 起 , 超 声 破 菌 (200 W 每 次超声 2 s 间隔 2 s)。取 80μL 上清备用。沉淀用等 量 PB 悬起, 取 80μL 备用。所取上清及沉淀中加入

2.1.1

猪干扰素 - γ 基因的优化与合成

影响外

源基因表达水平的因素很多, 目的基因中含过多的 稀有密码子被认为是低水平表达或产生不完全产物 的一个重要原因。 poIFN- γ 基因序列含有大量的大 肠杆菌稀有密码子, 运用 E.coli 常用密码子替换稀 有密码子, 有望提高重组蛋白的表达水平。

SDS- PAGE Loading Buffer, 煮沸 3~5 min 后, 直接
用于 15% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.2.6 提取包涵体

取大量诱导表达菌液, 4℃ 5 000

poIFN- γ 合成基 因推导的 氨 基 酸 序 列 与 成 熟 蛋 白
氨基酸序列完全相同。

r/min、离心 10 min 后收集 菌体, 重悬于 A 液( pH 7.8 0.02 mol/L Tris- HCl, 0.5 mol/L 氯化钠) 中, 超声 破菌 (300~400 W, 每次超声 10 s 间隔 10 s, 工作次 离 数 95 次 , 运 行 2 次 ) 后 , 4℃ 、 000 r/min、 心 10 10 min, 沉淀用 1% TritonX- 100 洗涤, 再次超声( 200~ 300 W, 每 次 超 声 10 s 间 隔 10 s, 工 作 次 数 5 次 , 运 行 1 次) 后, 4℃、 000 r/min、 离心 10 min, 收集包涵 10 体, 于 B 液 ( pH 7.8 0.02 mol/L Tris- HCl, 0.5 mol/L
氯化钠 , pH 7.8 8 mol/L 尿素) 中融解 , 4℃ 、 000 10 离心 10 min 收集上清。 r/min、 1.2.7 表达蛋白的纯化 将 Ni- NTA 树脂装入合适 的层析柱, 用不少于 10 倍 NTA 体积的 PB 平衡柱 子, 裂解液上清上柱, 分步洗脱, 收集各洗脱液,

2.1.2

猪干扰素 - γ 基因的合成与克隆
1 2

bp 2000- - 1000- - 750- - 500- - 250- - 100- -

1.DNA 分子量标准( 2 000 bp ) ; 2.PCR 合成 poINF- γ 目的片段

图2

poINF- γ 基因合成

由图 2 可见, PCR 扩增后相对于 500 bp marker 稍 远 处 有 一 DNA 特 异 带 , 与 目 的 基 因 poIFN- γ 450 bp 大小相符。

SDS- PAGE 分析蛋白纯化结果。 1.2.8 poIFN- γ 体外抗病毒活性测定

将 8 mol/L

尿素变性的包涵体移到透析袋中, 依次在 6、 、 和 4 2

2.2

原核表达载体的构建和测序 挑单菌落于 LB 新鲜培养基中摇过夜, 经菌落

0 mol/L 尿 素 复 性 缓 冲 液 (0.02 mol/L Tris- HC1, 0.5 mol/L 氯化钠)中透析复性 6 h。 000 r/min 离心后取 12
上清, 抽滤除菌, 采用 PK15- VSV 系统, 以微量细胞 病变抑制法测定复性蛋白的抗病毒活性。按文献资 料介绍的常规方法 [6]制备 PK15 细胞悬液, 以 1×105 细胞 /mL 接种 96 孔细胞培养板。待 PK15 在 96 孔 板上生长成 单层后, 倾去 营养液, 每孔 加入 100μL 系列稀释的干扰素样品 ( 10~106 梯度稀释, 6 个平 行 孔 ) , 置 于 37 ℃ , 5% 二 氧 化 碳 细 胞 培 养 箱 中 培 养。5 h 后倾去培养液, 维持液洗 1 遍 后加入

PCR 鉴定 3Z/poINF- γ , 如图 3 所示, 扩增出来的 INF- γ 基因片段约 450 bp 大小。 BamHⅠ和 HindⅢ 双酶切 3Z/poINF- γ , 出现约 3.1 kb 与 450 bp 大小
的 2 条片段, 分 别为 3Z 载 体 和 poINF- γ 片 段( 如 图 3 所 示 ) 。 pQE- 30/poINF- γ 用 BamHⅠ 和 Hind

Ⅲ双酶切后也得到相似结果, 可初步鉴定此克隆为
阳性。
1 2 3 4 5 6

100μL 100 TCID50 的 VSV 进 行 病 毒 接 种 , 37℃ 继 续培养约 1、 d , 同时设立阳性对照孔 (不加干扰素, 2 阴性对照( 只加干扰素, 不加病毒) 和空 只加病毒 )、
白对照( 不加干扰素, 不加病毒) 。待病毒对照孔细 胞 全 部 发 生 明 显 的 细 胞 病 变 (75% CPE)时 , 在 倒 置 显微镜下观察结果。将抑制 50% 细胞病变 (CPE)的 干扰素的最高稀释度定为 1 个干扰素单位。

2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp

图3

重组子的鉴定

1:DNA 分子量标准( 2 000 bp) ; 2:3Z/poINF- γ 菌落 PCR 扩增鉴
定 ; 3:3Z 质 粒 经 BamH I 和 Hind Ш 双 酶 切 ; 4:3Z/poINF- γ 质 粒 经


2.1

结果
猪干扰素 - γ 基因的人工合成

BamH I 和 Hind Ш 双酶切鉴定; 5:pQE30 质粒经 BamH I 和 Hind Ш
双酶切; 6:pQE30/poINF- γ 质粒经 BamH I 和 Hind Ш 双酶切鉴定

双 酶 切 鉴 定 阳 性 克 隆 pQE- 30/poINF- γ 送 上 ? 630 ?

第8期



丽, 等: 猪干扰素 - γ 基因在大肠杆菌中的克隆表达及其活性测定

海生物工程有限公司测序, 测序结果显示与实验设 计完全一致: 目的基因碱基序列按照预期方式定向 插入表达载体, 未发现碱基突变, 且接口处序列正 确, 未改变读码框架。

性, 活性检测结果显示, 加入 VSV 病毒 24 h 后, 6 排 孔中, 加入低于或等于 104 稀释的干扰素的细胞孔 细胞状态良好, 看不到典型的病变, 而加入 106 稀释 的干扰素孔 中, 细胞出现 90% 以上的病 变, 阳 性 对 照孔完全出现 100% 的 VSV 病变, 阴性对照孔与空 白对照孔的细胞均生长良好。表明复性后的重组蛋 白在 PK15 细胞上表现出较高的抗病毒活性, 生物 学活性约为 6.2×105 U/mg, 可有效抑制 VSV 病毒对 细胞的破坏作用。

2.3

poIFN- γ 基因表达产物的 S DS - P AGE 分析
诱导过的菌液超声破菌、 离心后, 分别取 25℃ 、

30℃、 32℃和 37℃的上清和沉淀进行 SDS- PAGE 电
泳, 以未诱导的菌液和 19.5 kD 蛋白做对照。结果显 示, 在诱导菌的包涵体内出现一特异条带, 位置较

19.5 kD marker 稍远一点, 与目的蛋白 18 kD 分子
量相符合。凝胶图像分析系统分析表明, 不同温度 下特异带占菌体总蛋白的量不同, 其中 30℃ 和 32℃ 表达量相近, 约 84.5% , 37℃最低, 约 66.2% 。 25℃为



讨论
近年来我国养猪业多次暴发多种疫病, 寻求特

效治疗方案, 促进人畜禽疾病防治技术的发展已成 为亟待解决的问题。猪干扰素 - γ 对猪繁殖与呼吸 障碍综合征病毒、亚洲猪瘟病毒以及猪传染性胃肠 炎等病毒具有较好效果, 与疫苗联用还可加强免疫 应答, 改善染毒动物的生长性能 [7]。随着基因工程、 蛋白质工程和发酵与细胞工程的深入发展,

78.3% 。初步鉴定此特异带为目的蛋白, 而上清中没 有目的蛋白出现, 见图 4。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

PoIFN- γ 的研究越来越受到国内外学者的重视。
→19.5 kD marker

早在 1991 年 VANDENBROECK K 等便利用常 规基因工程技术, 克隆了 PoIFN- γ 基因并在大肠 杆菌中成功表达。但研究多采用取外周血或脾淋巴 细 胞 提 取 总 RNA, 通 过 RT- PCR 方 法 获 得 费力, 且获得的目 PoIFN- γ cDNA, 步骤繁琐, 费时、 的蛋白表达量一般介于 15% 到 35% 之间 [8]。通过研 究现已明确, 外源蛋白在大肠杆菌中的表达水平与 多种因素有关, 如启动子和终止子的强弱、 序列、 SD 密码子的偏爱性、基因二级结构、宿主菌的遗传背 景、 培养条件等等[9]。其中密码子的选择和分布与基 因表达效率间存在密切关系, 通过对外源基因上的 密码子序列进行优化可提高其表达水平。本研究以 此为出发点, 根据大肠杆菌偏好性, 借助计算机软件 分析, 替换掉全部大肠杆菌稀有密码子, 重新设计合 成基因 poIFN- γ , 并使各寡核苷酸片段之间重叠碱 基数为 20 bp 左右以保证足够的退火温度。通过重 叠 PCR 法, 成功合成了 poIFN- γ 基因, 并在原核表 达系统中以包涵体形式高效表达。表达量占细菌总 蛋白的 84.5% 左右且纯度较高。 此方法简便、 快速而 成本也明显降低, 很好地解决了在大肠杆菌中高表 达 PoIFN- γ 蛋白的限制因素。 由于蛋白的疏水性, 诱导菌所表达的 poIFN- γ 以包涵体形式存在。通过 pQE- 30 表达载体中携带 的 6×His 亲合标签, 采用 Ni- NTA 亲和纯化后的目 ? 631 ?

图4

表达的重组 poINF- γ 蛋白的 S DS - P AGE 分析

注 : 1:M15/pQE- 30/poINF- γ 诱 导 前 全 菌 ; 2:M15/pQE- 30/

poINF- γ 25℃诱导表达碎菌上清; 3:M15/pQE- 30/poINF- γ 25℃诱导
表达碎菌沉淀; 4:M15/pQE- 30/poINF- γ 30℃诱导表达碎菌上清; 5: M15/

pQE- 30/poINF- γ 30℃ 诱 导 表 达 碎 菌 沉 淀 ; 6:M15/pQE- 30/poINF- γ 32℃诱导表达碎菌上清; 7:M15/pQE- 30/poINF- γ32℃诱导表达碎菌沉
淀 ; 8:M15/pQE- 30/poINF- γ37℃ 诱 导 表 达 碎 菌 上 清 ; 9:M15/

pQE- 30/poINF- γ37℃诱导表达碎菌沉淀; 10:蛋白分子量 Marker

2.4

目的蛋白亲和纯化及 S DS - P AGE 检测 表达载体 PQE30 带有 6 个组氨酸标签, 可利用

Ni- NTA 树脂对重组蛋白进行亲和纯化。由图 5 可 见, 目的蛋白纯度达到 95% 以上。
1 2 3 4 5 6 7 97.4 kDa 66.2 kDa 43 kDa 31 kDa poIFN- γ 20.1 kDa 14.1 kDa

图5

镍亲和层析纯化 poINF- γ 蛋白的 S DS - P AGE 电泳

1 : IPTG 诱 导 全 菌 ; 2 : poINF- γ 上 Ni 柱 后 的 流 出 液 ; 3 : PB 液 冲 Ni 柱 后 的 流 出 液 ; 4 、 、 : 经 20 mmol/L、 mmol/L、 mmol/L 咪 唑 5 6 50 200
洗脱收集液; 7 : 蛋白分子量 Marker

2.5

表达蛋白的活性检测

Ni- NTA sepharose 纯 化 的 poINF- γ 经 透 析 复

中国医学工程

第 15 卷

的蛋白占细菌总蛋白的 95% 以上, 有效避免了杂蛋 白对后续实验的影响。复性后检测 poIFN- γ 抗病 毒活性, 在猪肾细胞系 PK15 上抗 VSV 比活性达到

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( 张 蕾 编辑)

Chinese

6.2×105 U/mg 左右, 具有抗病毒和抑制细胞增殖等
功能 , 但低 于曹瑞兵 等 [10]研究发现 的 4.5×106 U/mg 水平, 可能与细胞系种类不同有关。对于同种干扰 素在不同细胞系上的活性差异是否具有显著性意 义, 以及其确切机制还有待于进一步研究证实。 本实验成功 构建 pQE30/poIFN- γ 表达 载体并 在大肠杆菌中获得高效表达, 为进一步对 poIFN- γ 的研究和开发奠定了基础, 而抗病毒活性的分析, 则 为重组猪干扰素 γ 的临床应用提供了实验依据。
参 考 文 献:

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!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Chinese Science Bulletin, 2003, 48(10): 941- 948. ( 上接第 627 页)

段, 都表明 Bat SARS coronavirus HKU3- 1 不太可 能是从人 SARS- CoV 传播过来的。另外, Bat SARS

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coronavirus 与 civet SARS- CoV 可 能 具 有 共 同 的 祖 先, 使得中国菊头蝠 SARS 病毒株同样具有感染人
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参 考 文 献:

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( 张 蕾 编辑)

? 632 ?


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