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植物油体表达体系的研究进展Microsoft Word 文档


摘要:介绍了植物种子中油体和油体蛋白(oleosin)的结构特征及其编码基因的调控,阐 述了用植物油体表达体系这一新型植物生物反应器生产目的蛋白的研究进展和前景。 关键词:油体;油体蛋白;表达体系;植物生物反应器;目的蛋白 现有外源基因表达系统主要包括:细菌、丝状真菌、酵母、哺乳动物细胞、动物乳腺、昆虫 (昆虫细胞、昆虫杆状病毒和昆虫整体) 和植物表达系统 (植物整体、病毒载体和

油体) 等。 这些外源基因表达系统在表达量、表达产物的分离纯化及活性、成本等方面各有优缺点。从 近年的研究进展看, 利用植物表达系统大规模生产各种目的蛋白还受到诸多因素的限制, 表 达量低、 提取和纯化成本高是主要的限制因素。 植物油体表达体系将目的蛋白的编码基因插 入油体蛋白(oleosin)编码基因的 3`端,以 oleosin 启动子驱动目的蛋白与 oleosin 一起在 转基因植物的油体中特异表达,获得转基因植物种子后,将种子粉碎, 利用油体的疏水性, 离心将油相和水相分开,回收上层油体部分,即可去除种子中大部分的非目标成分,从而显 著降低目的蛋白的分离纯化成本,因此近年来倍受关注。作为一种新型的植物生物反应器, 为最终利用转基因植物生产外源蛋白提供了新的途径。 1 油体(oil body) 植物种子中贮存的营养物质主要包括蛋白质、 脂肪和碳水化合物。 其中脂类物质一般以三酰 甘油 (triacylglycerols,tag)的形式存在, 荷荷芭 (jojoba)例外,它贮存蜡酯 (wax esters)。 种子中的 tag 分子之间不是彼此聚合的,而是分散成许多小的稳定的亚细胞微滴,被称为油 体。油体作为生物体中最小的细胞器有其自身的结构和特征。 1.1 油体大小 油体为直径 0.5-2.5μm 的球体,其大小因植物种类的不同而不同,且受营养和环境的影响。 即使同一粒种子,不同组织中的油体大小也不相同。从生物学角度讲,油体的大小主要决定 于两个因素:(1)种子发芽时为脂酶催化 tag 提供最大的作用表面;(2)消耗最少量的油 体蛋白和磷脂(phospholipids, pl)。如果油体的直径小于 0.2μm,虽可为脂酶的催化提供 更大的作用表面,但却需耗费大量 pl 和 oleosin。相反,如果油体直径大于 2.5μm,虽节省 了 pl 和 oleosin 的用量,但由于作用表面过小,在种子发芽及幼苗生长时,脂酶不以迅速水 解脂类为植物提供生长所需的能量。 1.2 油体成分 油体的成分包括: (1) 92%-98%的中性脂类: 主要为 tag, 约占 95%, 少量的二酰甘油 (dag) 和自由脂肪酸;(2)1%-4%的磷脂(pl):主要为磷脂酰胆碱,约占 60%-70%,少量的 为磷脂酰丝氨酸、 磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇; (3) 1%-4%油体蛋白: 其中 90%为 oleosin, 少量的为 caleosin、细胞色素 c 还原酶等。某些植物(如蓖麻和大豆)成熟种子的油体膜上 还有脂酶和酰基脂酶存在。花粉粒油体中未检测到 oleosin,橄榄和鳄梨果实中皮层油体中 也没有 oleosin。由于这些油体中的脂类物质不是用于长期贮存,因此 murphy 和 vance 提 出 oleosin 可能仅为储藏器官油体所特有,但 n? sted 等发现根尖油体中有 oleosin 存在。

1.3 油体的基本结构 根据 tzen 等提出的油体结构模型, 油体内部为液态 tag, 外部是由单层磷脂分子及其镶嵌蛋 白-oleosin 组成的半单位膜,这个半单位膜的基本单位是由 13 个 pl 分子和 1 个 oleosin 分 子组成(图 1)。pl 占油体表面的 80%,其余 20%是 oleosin。每个 pl 分子的 2 个疏水酰 基朝向内部疏水的 tag 基质,与 tag 分子相互作用;pl 亲水的头部基团朝向胞浆。oleosin 分子中间的疏水区域形成一个约 11nm 的柄状结构占 oleosin 分子的 2/5,伸入 pl 的疏水酰 基部分及油体内部的 tag 中, 该部分为由 68-74 个氨基酸组成的发夹结构, 发夹结构的顶端 是由 3 个脯氨酸和一个丝氨酸构成的“脯氨酸结”(图 1)。oleosin 分子其余的 3/5 部分则覆 盖在油体表面,阻止外部的磷脂酶作用于磷脂半单位膜。等电聚焦结果显示,油体的等电点 为 5.7-6.6,即在 ph 值为中性时,油体表面带负电荷。植物种子经长期贮存,油体结构仍保 持稳定,彼此之间不会相互聚合,普遍认为油体表面电荷和 oleosin 蛋白的存在是维持油体 结构稳定的主要因素。最近的研究结果显示,油体表面除主要镶嵌有 oleosin 外,还镶嵌少 量其它蛋白,如 caleosin,因此油体作为植物中最小的细胞器,其结构可能较上述模型更加 复杂。oleosin 和 caleosin 是迄今为止研究得较多的两种油体蛋白。

2 油体蛋白 2.1 oelosin 及其结构特点 oleosin 最早是从芥菜中发现的,目前许多种植物(如芝麻、油菜、向日葵、胡萝卜、玉米、 大豆、拟南芥和棉花)的 oleosin 基因序列和氨基酸序列均已报道。oleosin 是高度疏水的 碱性小分子量蛋白,分子量为 15-26kd,主要在种子中特异表达。一般认为 oelosin 为油体 所特有, 最近发现约有 5%的 oelosin 存在于靠近油体的内质网上,另外在根尖油体中也发 现有 oelosin 存在。 oelosin 是在内质网上合成的, 由与内质网结合的核糖体负责合成。 oelosin 镶嵌在油体表面,对维持油体的稳定极为重要,一方面在空间上阻碍油体分子间相互聚合, 另一方面在种子发芽时,oleosin 被认为是脂酶与油体间的结合位点。某一植物中含量最高 的 oleosin 的抗体也能识别同科植物中分子量相近的 oleosin,如十字花科的 19-20kd、 菊科 的 20kd 和豆科的 24kdoleosin;不仅如此,不同科间的 oleosin 也可发生这种交互反应。 不同植物来源的 oleosin 蛋白具有相同的结构特性,都具有 3 个基本的结构域,即(1)n 端 40-60 个氨基酸组成的两亲性区域(兼具亲水性和亲脂性)。这一区域分布于油体朝向 胞浆的一面。 (2)中间 68-74 个氨基酸组成的高度疏水区域。tzen 和 huang 根据这一区域 中氨基酸残基极性的分布, 推测其为伸入 tag 基质中的反式平行的 β-折叠结构, 其顶部具有 由 3 个脯氨酸和 1 个丝氨酸组成的“脯氨酸结”。这一区域尤其是“脯氨酸结”在不同来源的 oleosin 中高度保守,因此从进化上讲,该区域可能对植物有重要意义。(3)c 端的 33-40 个氨基酸组成 α-螺旋结构域。该结构域兼具亲水和亲脂性,其带正电荷的基团朝向 pl 层带 负电荷的部分(磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、自由脂肪酸等),带负电荷的部分朝向油体表 面(图 2)。对每个 oleosin 蛋白分子而言,约 20%的氨基酸残基镶嵌在 pl 层上,30%浸在

tag 中,其余 50%暴露在油体表面。 oleosin 二级结构进行的生化分析支持 tzen 的这一模 对 型。lacey 等提出新的 oleosin 二级结构模型:即 oleosin 中部疏水区域是由“脯氨酸结”连接 的两个分开的 α-螺旋结构,并由这个“脯氨酸结”形成 180 度转角;n 端为 β-折叠结构;c 端 是兼具亲水和亲脂性的 α-螺旋结构,上述两种模型均有待进一步的实验验证。

2.2 oleosin 基因及其表达调控 研究发现裸子植物中只有一种 oleosin,被子植物中的 oleosin 基因常以基因家族的形式存 在,一种植物中常有几个 oleosin 异构体(表 1)。各异构体在植物中的表达量、表达部位 及表达速度均不相同。如玉米中 18kdoleosin 的表达量仅为 16kd 的 10%-20%,油菜油体 中 24kdoleosin 仅为 20kd 的 10%。

oleosin 基因表达调控的特点: (1)oleosin 基因主要受发育调控,在种子成熟过程中表达。oleosin 基因受水分逆境、茉 莉酮酸、aba 和渗透稳定剂(如山梨糖醇)诱导表达,如油菜的 20kdoleosin 基因受 aba 诱 导后 0-4h 检测到 mrna 和蛋白质积累; 渗透稳定剂 (如山梨醇) 处理 1h 可测到 mrna, 3-6h 检测到 oleosin 蛋白的积累。在油菜和拟南芥 oleosin 基因的启动子区均存在 abre (aba-responsive element)基元序列(t/c acgtggc),特异地受 aba 诱导。(2)oleosin 基因的表达具有组织特异性,主要在种子的胚(盾片和胚轴)及糊粉层中表达,de-oliveira 等、robert 等报道在花粉中发现有一类特殊的 oleosin。油菜小孢子培养来源的球形胚和心 形胚中可测出 20kd 的 oleosin,心形胚中可测到相应的 mrna,说明 oleosin 在种子发育的 早期就有表达。(3)oleosin 基因 5`端上游区域还具有其它调控序列,如在水稻 oleosin 基 因上游存在谷物贮藏蛋白基因的调控元件 catgcang。 油菜 oleosin 启动子上存在的 aatgcatg 序列,与控制豆科植物基因种子特异表达的保守序列 ry 基元序列(catgcatg)高度同源。 拟南芥 oleosin 基因启动子上存在豆科植物种子蛋白普遍具有的 caca (taacaca) 序列。 (4) oleosin 基因虽为组织特异表达,但其 5`端却没有信号肽序列存在,与此相应的是 oleosin 蛋白 n 端也没有剪切信号序列,推测 oleosin 基因内部可能有某些序列,或者 oleosin 蛋白 能够形成某种构象使其定位到油体表面,例如 oleosin 中部缺失,严重影响其在油体上的定 位,而 n 端或 c 端缺失则影响较小或根本无影响。“脯氨酸结”中的 3 个脯氨酸突变为亮氨酸 的实验, 证明“脯氨酸结”为 oleosin 定位于油体所必须。 oleosin 中部疏水区域可能是 oleosin 的内质网定位信号,但在体外实验中,“脯氨酸结”突变不影响 oleosin 内质网上的定位。 2.3 caleosin 用不同方法分离多种植物油体蛋白, 发现除 oleosin 外, 还含有少量其它蛋白。 1998 年 chen 等首次以免疫标记法确定了芝麻油体中的另外 3 个种蛋白 sop1、sop2 和 sop3。sop1 经氨 基酸序列测定,发现它与水稻的一个钙结合蛋白同源,因此将这类蛋白命名为 caleosin。

caleosin 在高等植物中广泛存在,藻类和真菌中也有类似蛋白。不同来源的 caleosin 表达 特性不同。如水稻 caleosin 主要在胚形成后期表达,受 aba 或水分逆境诱导可在幼苗和营 养生长组织中表达。与水稻 caleosin 水同,芝麻 caleosin 似乎仅为种子特异表达。干旱状 态下, 拟南芥受 aba 诱导可检测到 caleosin 同源蛋白 mrna。 已知高等植物 caleosin 蛋白分 为 3 个结构域:1) 端亲水区, ( n 含有一个与 ca2+结合的 ef-hand。 大肠杆菌中表达的 ef-hand 融合蛋白,在体外实验中可与 ca2+结合。从芝麻油体中分离得到的 caleosin1 也能与 ca2+ 结合。 (2)中部疏水区,该区包括 n 端的一个胞外膜定位区和与之相邻的一个富脯氨酸区。 已知这一结构仅存在于某些高等植物如芝麻、水稻和拟南芥的 caleosin。(3)c 端亲水区。 多数植物 caleosin 的 c 端亲水区一般都包括 4 个激酶磷酸化位点。不同来源 caleosin 的结 构和生物学功能尚不清楚,推测可能参与油体生物合成、脂类的胞内运输和代谢。 3 植物油体表达体系 3.1 oleosin 目的蛋白表达载体的构建 如前所述,所有 oleosin 均有 3 个结构域,3 个结构域加起来约 15kd,但 oleosin 分子量的 判别却很大 (15-26kd) 多出的 1-11kd 以 c-端或 n-端的延伸形式存在。 , 不同来源的 oleosin 除中部疏水区域高度保守外,n 端和 c 端核苷酸序列差异很大。这使人们想到,将外源小分 子量蛋白编码基因插入 oleosin 基因的 5`端或 3`端,构建由 oleosin 启动子驱动的“oleosin 目的蛋白”植物表达载体, 转化受体植物, 不会影响 oleosin 在植物油体上的定位。 由于 oleosin 为种子特异表达,并镶嵌在油体表面,目的蛋白在转基因植物中是以融合蛋白的形式与 oleosin 一起在油体中特异表达。 3.2 植物油体表达体系的优点 3.2.1 融合蛋白易于分离 oleosin 为种子特异蛋白表达,并镶嵌在油体表面。外源基因插入 oleosin 的 n 端和 c 端,构成融合蛋白并未改变 oleosin 的特性。因此利用油体亲脂疏水的 特性, 将转基因植物种子经粉碎→液体抽提→离心处理, 回收上层油相即可将融合蛋白与细 胞内其它组分分开,可去除 90%以上的种子蛋白。当融合蛋白中插入的目的蛋白为酶时, oleosin-融合蛋白可直接作为酶使用, 酶催化反应结束后还可回收, 用于下一次酶促反应 (作 为固定化酶),一般重复使用 2-3 次后,仍保持较强的酶活力。若融合蛋白不具活性,则需 将目的蛋白从 oleosin 上切下来。为此,需在目的蛋白和 oleosin 基因之间引入一个蛋白酶 酶切位点,比较常用的是溶血酶(thrombin),融合蛋白经酶切后,再设法将两者分开。 3.2.2 融合蛋白在种子中可长期稳定贮存 成熟种子中水解酶活性降低, 因此融合蛋白可在种 子中长期稳定贮存而不会被降解。据 van rooijen 和 moloney 报道,oleosin-gus(β-葡糖醛 酸苷酶)融合蛋白在转基因油菜种子中 4℃贮存 1 年以上,也不降解。 3.2.3 种子易于运输,有利于工业化生产 种子成熟过程中 95%以上的水分被蒸发,较植物 的其它部分更易于运输,为大规模生产目的蛋白带来方便。

3.2.4 现在加工机械适用于种子粉碎和油体的分离 例如谷物的加工粉碎用水磨, 而乳制品工 业中用于分离奶制品的设备可用于液体抽提后油体的离心分离。 3.2.5 增加农产品的附加值 分离目的蛋白后的油体仍可作为食用油或工业用油, 目的蛋白则 可大大增加农产品的附加值。 3.3 用植物油体表达体系已表达的外源蛋白 1991 年 lee 等首次报道将玉米的 oleosin 基因转入油菜,玉米 oleosin 的 mrna 仅在转基因 植物成熟种子中存在,表达量为种子总蛋白的 1%,表达产物 90%定位在油体上。单子叶植 物玉米的 oleosin 基因在转基因油菜油体上的正确转录、翻译和定位,说明单子叶来源的 oleosin 基因上有足够的信息可以使它在双子叶植物中起作用。1996 年 holbrook 等用基因 枪轰击油菜种胚,在短暂表达检测中发现 oleosin-gus 融合蛋白在油体上正确定位,进一步 验证了 lee 等的实验结论果。 vanrooijen 和 moloney 将 gus 基因插入拟南芥 oleosin 基因的 3`端,构建以 oleosin 启动子驱动的植物表达载体,以农杆菌介导法转化油菜,在转基因植 株中 80%的 gus 活性在油体上。该实验还发现 oleosin-gus 融合蛋白本身就具有 β-葡糖醛 酸苷酶的活性,而不必将 gus 从 oleosin 上切下来。由于融合蛋白结合在油体上,因此可作 为固定化酶多次重复使用。1995 年 parmenter 等构建了由拟南芥 oleosin 启动子驱动的 oleosin-水蛭素融合蛋白表达载体,转化油菜,经免疫荧光检测,融合蛋白定位在油体表面, 表达量占种子总蛋白的 1%。将水蛭素与 oleosin 蛋白酶切分离后,得到具有生物学活性的 水蛭素。该实验发现虽然 oleosin-gus 融合蛋白具有生物学活性,但 oleosin-水蛭素融合蛋 白却没有水蛭素特有的抗凝血酶活性, 必需将其从融合蛋白上酶切下来。 1997 年 liu 等利用 植物油体表达体系在转基因油菜中成功地表达了来自瘤胃真菌的木聚糖酶。 3.4 受体作物和目的蛋白的选择 受体作物应选择油脂含量高、遗传转化容易的作物。目的蛋白的选择应考虑:(1)分子量 不宜太大, 以防影响融合蛋白在油体表面的正确定位。 目前利用油体表达的目的蛋白最大的 是 67kd 的 gus;(2)目的蛋白应有一定的亲水性,尤其当需将目的蛋白从融合蛋白上切 下时;(3)功能清楚,基因序列已知;(4)价格昂贵,有良好的商业价值,可显著提高 农产品的附加值。 基于以上考虑,我们实验室选择以油菜、棉花为受体。为研究植物油体表达体系的适用性, 我们选择以 c 端需酰胺化才有生物学活性的降钙素作为目的蛋白, 目前已获得转基因棉花第 4 代株系和转基因油菜植株。转基因油菜经 pcr 检测,证明降钙素基因已整合到油菜基因组 中。转基因棉花经 pcr-southern 和 western 检测,证明目的基因已在棉花中整合并在油体 中表达。转基因植株中目的蛋白的表达量和生物学活性检测正在进行中。“一种新型鲑鱼降 钙素类似物及利用植物油体表达体系生产外源蛋白的方法”已申请国家专利(另文报道)。 4 前景和问题

用油体表达体系成功地表达 gus、水蛭素、木聚糖酶、降钙素等外源蛋白,尤其

是与固定化酶技术结合, 无疑使人们看到了其在工业化生产目的蛋白方面的应用 前景, 但作为一种新型植物生物反应器, 还有许多问题需要进一步的研究和探讨, 包括:(1)如何进一步提高蛋白表达量和降低目的蛋白的分离纯化成本。当 oleosin-融合蛋白不具生物活性时,这一问题就更加突出,目的蛋白酶切、分离 和纯化成本高,将严重影响这一体系的实际应用。(2)已知有些蛋白糖基化、 酰胺化后才具有生物活性, 油体表达体系中目的蛋白能否糖基化和酰胺化以及糖 基化、酰胺化程度如何,还有待更多的实验研究。油体表达体系的局限性还表现 在对目的蛋白的分子量、 亲水和疏水性有一定的要求。没有一种表达体系是万能 的,如何扬长避短,充分利用不同表达体系的优点,表达适当的目的蛋白以造福 人类,这是今后需要深入研究的课题。


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