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CTAB法提取植物叶片的RNA


CTAB 法提取白桦 RNA 方法 法提取白桦
实验原理: 最终浓度为 2 mol/L 0.8 mol/L 直接沉淀大分子 RNA LiCl (包括 rRNA 和 mRNA)
需要注意的是 Li 离子对反转录酶有抑制作用,而 Cl 离子能抑制蛋白质合成的起始步骤,所 以在 mRNA 反转录和体外翻译实验前不要使用 LiCl 沉淀 DNA 和 RNA NaAc

最终浓度为 0.3mol/L(Ph5.0)

①所用所有试剂: Tris- CTAB:与 RNA 结合
β-巯基乙醇:防止被氧化 Tris 饱和酚、氯仿:去蛋白质 5L LiCl、无水乙醇、70%乙醇、3 mol/L NaAc:使 RNA 沉淀 1×TAE、 BW:配制凝胶 Gol-rad 或 gold-view 和 6×loading buffer :前沿指示剂 ddH2O ②所有材料 用具 试剂瓶 、250 烧杯 玻璃棒 250 容量瓶 记号笔 天平 一次性手套 钥匙、 液氮 研钵、冰、线手套、枪、枪头、高压锅、电泳照相系统 离心机 、混摇机、恒温水浴、电泳仪、电泳槽 ③实验准备: 1、CTAB 5g 直接加入试剂瓶(防止起泡) 2、NaCl 20.44g + 0.5M EDTA 12.5ml 用 ddH2O 定容至 225ml 3、 空瓶贴标签加适量 (100 或 50ml) ddH2O LiCl NaAc 70%乙醇 氯仿 的 ddH2O 4、6 个瓶 + 0.1%DEPC 在通风橱里戴双层手套,充分摇匀,气泡不很快消失 5、37 度保温过夜 注意事项: 1、 试剂瓶用洗洁精水浸泡一个小时,然后清水冲到不起泡,壁上不挂水珠,再用 ddH2O 冲两次,量筒等量器清洗后都用 ddH2O 冲洗两次 2、 Tris 不可用 0.1%DEPC 处理,等其他组分处理完再加到 CTAB 中 3、 所有瓶子用 0.1%DEPC 处理, 除了 β-巯基乙醇, Tris 饱和酚 (购买时小瓶装, 直接用即可) 所有水溶试剂用 ddH2O 配置 4、 加样器 100-1000 规格的,小于 100 则不准确 ④灭菌 1、将 25ml Tris-HCl 加入 CTAB 中, 2、瓶留一个缝,灭菌锅的桶中加适量水 3、枪头一层袋,离心管两层袋 4、共八个瓶 5、时间大概为一个半到两个小时 ⑤实验前准备 小研钵,杵,小钥匙中倒适量酒精,点燃,自灭后凉透(大概得 30min) 。 准备:液氮、材料(负 40 度) 、垫纸(研钵下用) 、手套(里外一层一次性手套,中间线手套) 、 冰(252) 、恒温机(65 度) 、桌上多放一只一次性手套(放钥匙和杵) 、将叶片放在手可触的 地方

开始实验

1、 3-5 倍体积(650ul Tris-CTAB 提取缓冲液,50ulβ-巯基乙醇)的 65 度预热的提取缓冲液, 混匀 2、 根据实验需要,取每管 0.1-0.5g 叶片置液氮中冷冻,研磨成粉末。首先将研钵、杵和钥匙 充分冷冻(浇 3-4 次) ,加入叶片,加液氮,不超过五次。液氮多的时候轻磨,快没时用 劲快磨,至白色为止。 3、 粉末加入准备好的离心管中,大概 2 匙柄,充分混匀,放在 65 度恒温浴中 15min,每隔 2-3min 摇一次,研钵和杵放水下冲,氯仿瓶放在冰中。 4、 加入一倍体积(700ul)的氯仿,用混摇机摇匀,12000rpm,离心 10min,取上清。 5、 在冰中准备好离心管和氯仿,重复两次。 6、 准备好 500+60ul 5mol/L LiCl,200+150 ul 冷无水乙醇,60ul 3 mol/L NaAc, 加入 430ul 上清液,静置 15-30min,沉淀 RNA 7、 12000 rpm 离心 10min,注意放的方向,抽去上清,RNA 沉淀为无色胶体状 8、 用 70%乙醇漂洗两次,切忌快速抽打,开口在通风橱里风干(大概 15min) ,再加入 20ul 的 ddH2O,反复抽打混匀,置于冰中备用。

电泳检测

多准备一只一次性手套,带小枪

1、 配胶,1×TAE20 ml(稍多一点)、BW 0.8-1.0% g/ml(0.2g)于小锥形瓶中,轻摇(防 止气泡)加热完全融化,待降到 60 度(手摸不烫)时加 6-10ul gold-view 即可,倒 在插好梳子的胶盒中,待凝(大概 15min) 2、 电泳 恒压 60V 左右(66) 或横流 45mA 左右 30min 负极跑向正极 将电泳盒放入电泳槽中,加 1×TAE 没过胶面,将样品(1-4ul)和 6×Loading buffer(2 ul)在一次性手套上混匀加入到胶孔中,盖好盖电泳。 3、 将胶盒拿出到 252,把胶放到检测室中检测照相。

样品保存

-40 摄氏度或与无水乙醇以 3:1 充分混合后-40 摄氏度保存

注:1、或者前沿指示剂只用 gol-rad 最后只与样品混匀即可 2、70%乙醇配置无水酒精按纯酒精即可。 3、整个实验过程禁止说话,即在没有条件的情况下,尽量创造一个无 RNA 酶的环境 4、实验提取过程尽量缩短时间,尽可能放在冰上 5、RNA 沉淀为无色胶体状,白色明显沉淀是蛋白质等杂质 6、清洗 RNA 沉淀时确保沉淀不被冲走,确定其溶解在水中 7、电泳点样一定要迅速,准确,均匀 6、实验中遇到的问题: 1、只有一条带跑出来,且很清晰? 2、有拖尾或者是向前延伸? 降解,应对方法是:实验中样品尽量放在冰上进行 3、降解与震荡有无关系? 没有太大关系 4、电泳结果只在相对点样孔的一侧或是两侧有 RNA 显示? 点样不均匀 5、电泳结果显示点样孔处有明斑? 样品中存在杂质,应对方法:实验步骤加氯仿去杂时应注意两点 1、混合充分 2、离 心后取上清应缓慢,尽量避免蛋白层上的胶状杂质

6、电泳结果在 28S 和 18S 之后还有一条不太明显的条带? 是 DNA 或者是 5SRNA,应对方法: 7、电泳结果显示,两条带都有但是不明显? 点样量少,一般为 4ul,或者是样品浓度低,注意取叶大小和各步骤中的损失 8、电泳结果,没有条带? 实验过程中 RNA 已经降解,应注意保持实验的低温和无 RNA 酶环境;或者是叶片 储存条件不够 9、电泳中有融胶现象? 调节电压或者电流,不可太大 10、样品第一次跑电泳结果只有一点显示,第二次则结果合格? 校正点样 11、在沉淀 RNA 时有白色杂质沉淀怎么处理? 12、叶片未充分磨碎? 没有太大影响 13、叶片磨碎加样后发现离心管盖与壁之间夹着少量的绿色样品?

以上实验是本人在百度文库下载的,具体问题具体分析。 。


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