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百合的组织培养


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中草药 Ch inese T rad itional and H erbal D rug s 2001 年第 32 卷第 7 期

百合的组织培养
( 南昌大学生命科学与食品工程学院, 江西 南昌 330047)

   (Co llege of L ife Sciences and Food E

ngineering, N anchang U n iversity, N anchang J iangx i 330047, Ch ina )

Abstract: O bject   To develop a best app roach fo r the rap id p rop aga t ion of L ilium brow n ii F 1E 1 B row n va r 1 v irid u lum B aker by t issue cu ltu re 1 M ethods D ifferen t p a rt s of the bu lb w ere t ried a s the ex 2 p lan t and cu ltu red on d ifferen t cu ltu re m ed ia w ith the add iton of d ifferen t po rt ion s of va riou s ho rm ones a t va riou s cu ltu ra l cond it ion s1 Results  T he best m ed ium fo r the cu ltu re of exp lan t bu lb w a sM S+ NAA 015 m g L and GA 3 210 m g L and the h ighest induct ion ra te w a s a t the low est p a rt of the sca le leaves, w h ich a t ta ined 9215% 1 T he sm a ll bud can fu rther d ifferen t ia te to fo rm seconda ry sm a ll bud s1 B y liqu id 2qu ivering cu ltu ring, the w eigh t increa se can be accelera ted 1 Conclus ion  T issue cu ltu re of L 1 brow n ii va r 1 v irid u 2 lum can ach ieve it s rap id p rop aga t ion, resu lt ing in the po ssib ility fo r it s indu st ria l p roduct ion 1 Key words: L ilium brow n ii F 1E 1B row n va r 1 v irid u lum B aker; t issue cu ltu re; ca llu s; liqu id 2qu ivering cu ltu re

  百合 L ilium brow n ii F 1E 1B row n va r 1 v irid u 2 lum B aker 为百合科百合属多年生草本植物, 原产 产成本过高、 市场风险大等问题, 极大地阻碍了百合 的大面积推广。 采用组织培养方法, 可快速获得大批 量遗传稳定的种球, 实现种苗工厂化生产, 提高百合 生产水平。 1 实验材料 百合鳞茎由江西万载县提供。
2 实验方法 211 鳞叶诱导小鳞茎的实验: 取贮藏在冰箱中的鳞
Ξ

亚洲。 其药用部分是干燥肉质鳞叶, 具有润肺、 健胃、 止咳、 促进血液循环等功效。 百合的来源除野生外, 也进行人工栽培。 百合为秋植, 次年夏季采收, 生产中一直存在繁 殖周期长、 系数低、 种球供应困难且价格贵, 造成生

摘 要: 目的 研究百合组培快繁的最佳途径。方法 在M S 培养基上添加不同的激素配比; 采用鳞叶不同部位作 为外植体; 改变培养方式。 结果 确定了外植体产生小鳞茎的最佳培养基为 M S + NAA 015 m g L + GA 3 210 m g L ; 鳞叶的下部小块分化率最高, 为 9215% ; 小鳞茎叶脱分化形成愈伤组织后再分化可获得多而健壮的次级小 鳞茎; 次级小鳞茎采用液体振荡培养可快速增重。结论 采用组织培养方式可进行百合的快速繁殖, 使百合种球的 工厂化生产成为可能。 关键词: 百合; 组织培养; 愈伤组织; 液体振荡培养 中图分类号: R 282. 13   文献标识码: B    文章编号: 0253 2670 ( 2001) 07 0640 03 ? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

收稿日期: 2000208202 基金项目: 江西省一级重点研究项目 作者简介: 罗丽萍 (19722) , 女, 讲师, 四川宜宾人。1995209 1998207 就学于南昌大学植物学专业, 获理学硕士学位。一直从事植物组织 ~ 培养方面的研究。

Stud ies on tissue culture of L ilium brown ii var 1 vir idu lum
LU O L i2 ing, YAN G B a i2yun, ZHAN G M in 2hua, CA I Q i2ying p

罗丽萍, 杨柏云, 章敏华, 蔡奇英Ξ

茎, 去泥沙和腐烂部位, 自来水充分冲洗, 分取鳞叶, 洗 衣 粉 浸 泡 2 h, 流 水 冲 洗 1 h, 75% 酒 精 浸 泡 1

m in, 011% 升汞处理 10 m in, 无菌水冲洗 4 次待用。

在超净工作台上, 将鳞叶切成 015 110 cm 2 的 ~ 小块, 然后随机接种于试管内, 每组 20 支, 每支 1 块。 置于组织培养室中培养, 培养条件为: 温度 ( 25± 2 ) ℃, 光照强度 3 000 lx, 光周期 12 h d 光照 + 12 h d 黑暗 ( 以下同) 。
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本实验以 M S 为基本培养基, 通过附加不同浓 度的 NAA 、 3 和 62 GA BA 设计了 10 组培养基。具体 编号、 成分及实验结果见表 1。 212  鳞叶的不同部位诱导小鳞茎能力的实验: 本实

验按培养材料来源不同设 3 个处理, 将百合鳞叶依照 上述方法消毒后, 将同一鳞叶按上、 下 3 个部位切 中、 割, 分别接种, 每一处理 10 瓶, 每瓶接 5 片。 统一采用

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M S+ NAA 015 m g L + GA 3 210 m g L 培养基。 115, 210, 310, 410 m g L 。 接种方法同 213。
编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NAA GA 3 (m g L ) 0 015 015 015 015 015 015 015 015 015 (m g L ) 0 0 (m g L ) 0 0 0 0 0 0 015 110 210 310 0 0 0 0 62 BA 015 110 210 310

小, 诱导率仅为 1811% , 且产生小鳞茎数少; 当培养 基中存在 NAA 、 2 6 BA 和 GA 3 时, 诱导作用明显加 强, 小鳞茎数目增加。 当 NAA 固定为 015 m g L , GA 3 浓度逐步提高时, 诱导率和小鳞茎数逐渐升 高, 但当 GA 3 达 210 m g L 后, 其升高幅度开始趋 缓, GA 3 为 210, 310 m g L 时, 诱导效果没有明显差 异。固定 NAA , 62 BA 逐渐提高时也呈现相似趋势, 62 BA 为 210 m g L 时, 诱导作用趋于稳定。 诱导率 和小鳞茎数的最高值都出现在 GA 3 为 210 m g L 的 处理中。 因此认为, 加入激素对小鳞茎的诱导是必要 的, 在一定范围内, 高的激素浓度促进鳞叶分化, 但 过高时, 促进作用减弱, 且有可能造成遗传变异。 所 以选择促进百合鳞叶诱导小鳞茎的最佳培养基为: M S+ NAA 015 m g L + GA 3 210 m g L 。 312 鳞叶不同部位对小鳞茎诱导的影响: 培养 60 d 后统计, 结果见表 2。

接 10 瓶, 每瓶 5 片。 214  小鳞茎叶经愈伤组织途径分化次级小鳞茎的 实验: 采用 M S 固体培养基, 62 BA 都定为 110 m g L , 通过改变 2, 42 浓度来研究小鳞茎叶产生愈伤 D 组织的最佳培养基, 2, 42 浓度依次为 0, 015, 110, D 择固体和液体二种状态作为次级小鳞茎的增殖培养 基, 培养基成分: M S + BA 110 m g L + 2, 42 015 D m g L + NAA 012 m g L , 蔗糖加至 8% , 用 100 mL 锥形瓶分装, 每瓶 25 mL ( 液体) 和 30 mL ( 固体) 。 每
接种数
20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

213 小鳞茎叶直接分化出次级小鳞茎的实验: 将上 215 培养基状态对次级小鳞茎增殖作用的实验: 选

一处理 10 瓶, 每瓶接 5 个初始状态一致的次级小鳞 茎。液体振荡培养光照、 温度同上, 转速 100 r m in。 培养 30 d 后, 电子天平称重和统计数目, 按下列公 式进行统计分析。 △ = △ n = ( 2W 2 - 2W 1 ) n W W 其中: △ 为平均每瓶增重; △ 为总增重; W W 2W 1 为接种后的初始重总和; 2W 2 为培养 30 d 后 的重量总和; n 为参与统计瓶数 ( 即: 接种瓶数与污 染瓶数之差) 。
3 实验结果与讨论 311  NAA 、 3 和 62 GA BA 不同浓度配比对鳞叶诱

述实验诱导出的小鳞茎在无菌条件下分取鳞叶, 所 得为小鳞茎叶 ( 诱导小鳞茎叶分化形成的鳞茎为次 级小鳞茎) [ 2 ]。 小鳞茎叶不经切割, 直接随机接种。 本实验以 M S 为基本培养基, 选择 5 种不同的 62 、 3 和 NAA 浓度配比 ( 见表 2 ) , 每种培养基 BA GA

导小鳞茎的影响: 培养 8 d 后, 从外植体近轴面基部 出现启动迹象, 形成一些淡绿色小突起; 随着培养时 间延长, 小突起增大为鳞茎样, 进一步膨大成小鳞 茎, 为绿色带褐斑, 族生, 形状较规则, 每个小块产生 数目不一, 少的 1 2 个, 多的可达 5 6 个。 60 天 ~ ~ 第 进行统计, 结果见表 1。   由表 1 可知 , 无激素的M S 培养基诱导作用最
污染数
4 3 5 2 3 6 2 3 4 5

表 1 几组从鳞叶诱导小鳞茎的培养基及诱导结果
诱导数
3 5 5 8 11 9 5 7 9 8

诱导率
(% ) 18175 29141 33133 44144 64170 64128 27178 41178 56125 53133

分化鳞叶上的平均小鳞茎数
113 118 211 218 315 312 117 213 313 310 3 8 37

表 2 鳞叶不同部位的诱导率
接种数
50 50 50

部位 上 中 下

污染数
5 10 10

诱导数

诱导率 (% )
610 2010 9215

  从表 2 可知, 同样在最佳培养基上, 鳞叶不同部 位的诱导率差异极大, 其中鳞叶下部诱导率最高, 为
9215% , 中部次之, 为 2010% , 上部最小, 为 610% ,
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这和鳞叶扦插时小鳞茎发生都集中在鳞叶近轴面基 部是一致的[ 3 ]。 分析原因有可能是同一鳞叶不同部 生理化特性不同[ 4 ] 或是不同部位细胞所含的营养物 质量不同。 处于鳞叶下部的细胞内源激素水平高、 贮 藏的营养物质丰富, 在同样条件下, 更易诱导出小鳞 茎。 由于上部材料诱导率太低, 造成人力、 培养基和 位细胞的内源激素水平不同, 或是不同部位细胞的

空间的浪费, 建议在以后大量生产时, 鳞叶上部不

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用, 或不与中部分离, 以较大块材料接种, 以充分利 用其贮藏营养。
313 不同激素组合与浓度对次级小鳞茎诱导与生长
编号
A B C D E (m g L ) 210 210 210 210 210

的影响: 小鳞茎叶在 5 种培养基上培养 7 d, 在部分小 鳞茎叶近轴面基部能诱导出多个淡黄色小突起, 小突 起可发育为次级小鳞茎; 50 d 后统计, 结果见表 3。
诱导率
(% ) 3313 4718 6512 5612 5813

表 3 5 种培养基上次级小鳞茎的诱导与生长状态
NAA (m g L ) 0 0 0

m g L + GA 3 310 m g L 。 从小鳞茎叶分化成淡绿色

  从表 3 可知, 小鳞茎叶的诱导率以 C 最高, 为 6512% , 所 以 最 适 分 化 培 养 基 为 M S + 62 BA 210 件稍有差异, D 的诱导率不及 C , 但长势优于 C, 所 基类型。 所致, 可对这方面进一步进行探讨。 较弱小。 75 d 后统计, 结果见表 4。
2, 42 浓度 D (m g L ) 0 015 110 115 210 310 410

的次级小鳞茎约需 40 45 d。D 培养基上诱导率为 ~ 5612% , 但长势很好, 次级小鳞茎数目也多于其他, 导率为 9512% 相差很大。这可能是由于经外植体分
表 4 2, 4-D 对小鳞茎叶愈伤组织的诱导
接种数 污染数
50 50 50 50 50 50 50 0 2 1 1 0 3 2

且生长最快。 说明小鳞茎叶最适分化条件和生长条

以在生产中, 应根据培养目的和实际情况选择培养 由于小鳞茎叶是直接分瓣, 未经切割, 所以它的

次级小鳞茎实际上全部来自鳞叶下部。 本实验中, 小 鳞茎叶的最高诱导率为 6512% , 这与表 2 中最高诱
产生愈伤组织 的小鳞茎叶
0 0 0 5 14 31 30

化来的小鳞茎细胞内源激素水平下降、 分化能力减 弱造成的; 也可能是小鳞茎内所含的贮藏物质减少
314 2, 42 对小鳞茎叶产生愈伤组织的影响: 小鳞 D
愈伤组织 诱导率 (% )
0 0 0 1012 2810 6519 6215

茎叶接种后, 基部出现淡黄色突起, 有的直接分化成 次生小鳞茎; 有的膨大成无特定形态结构、 颜色为淡 黄绿色、 表面呈瘤状突起的愈伤组织状。 愈伤组织状

结构在 35 40 d 以后, 表面形态开始发生变化, 一 ~ 些瘤状突起分化为次级小鳞茎, 一般可出现 3~ 5 个, 多的可达 10 个, 其中仅 2 3 个较健壮, 其余都 ~

62 BA

GA 3 110 210 310 0 0

接种数
50 50 50 50 50

污染数
2 4 4 2 2

诱导数
16 22 30 27 28

平均次级小鳞茎数
1130 2141 2197 3133 3105

(m g L )

  从上可知, 百合愈伤组织只有在 2, 42 浓度大 D

015 110

于 115 m g L 才发生, 随 2, 42 浓度增加, 愈伤组织 D

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诱导率升高, 当 2, 42 达 310 m g L 时, 诱导效果趋 D 于稳定, 所以以 M S+ 62 BA 110 m g L + 2, 42 310 D m g L 较好。与其他植物相比, 百合愈伤组织诱导要
30 d 后统计, 结果见表 5。
培养基状态 固体 液体 2W
1

求的外源激素水平较高。 观察其生长动态类似兰花 的原球茎发生, 经该途径再生次级小鳞茎的繁殖系 数一般为 5, 高于表 3 中的 3133, 且所得鳞茎更大, 如果对其它弱小者经液体振荡培养能快速增殖, 则 这种类原茎球途径是百合快繁的一种较佳途径。
表 5 培养基状态对次级小鳞茎增殖的影响 ( g )
60319 42211 61210 44919

215  培养基状态对次级小鳞茎增殖的影响: 培养
参考文献:
2W
2

△W

n ( 瓶)

△ W

  从表 5 可知, 液体振荡培养对次级小鳞茎的增 殖效果明显优于固体培养, 平均每瓶增重 3197 g, 是 固体培养基上的 414 倍。 分析原因是: 1 ) 液体培养 时, 培养基处于流动状态, 养分可以充分利用, 而固 体培养基的养分交换缓慢, 利用率相对较低; 2) 振荡 培养使培养物分泌的一些物质能迅速地分散到培养 基中, 而不是集中在培养物的四周, 使细胞代谢更活 跃, 分裂速度比固体培养基上更快。 但液体振荡培养 污染率为 30% , 高于固体培养的 10% , 且多为细菌 性污染, 重复一次后, 污染情况未改观。 原因主要是: 百合鳞茎长期生活在土壤中, 体内存在内生菌, 一般 情况下不表现, 而当细胞代谢活跃、 养分供应充分 时, 内生菌被激活, 造成细菌性污染。 所以, 采用液体 振荡培养应注意筛选无菌系, 也可以考虑用抗生素 来加以控制。
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[ 1 ]  吴国芳, 冯志坚, 马炜梁, 等 1 植物学 [M ] 1 北京: 高等教育出 版社, 19941 [ 2 ]  俞新大, 张国富, 李建萍, 等 1 细胞工程 [M ] 1 北京: 科学普及 出版社, 19881 [ 3 ]  哈特曼, D 1E 凯斯特 1 植物繁殖原理与技术 [M ] 1 北京: 中国 林业出版社, 19811 [ 4 ]  屈姝存, 刘选明, 周朴华, 等 1 百合鳞片细胞形态发生中生理生 化特性研究 [J ] 1 生命科学研究, 1988, 2 (4) : 28822941

811 2718

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