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第二章


第二章 酶的发酵生产

第一节 酶生物合成的基本理论

一、中心法则 1958年 Crick:
转录

DNA A T 3 4 =64 C G 遗传密码

RNA A U C G

翻译

蛋白质

氨基酸
折叠密码<

br />
二、RNA的生物合成——转录
(一)RNA的种类和主a要功能 dsRNA:某些病毒遗传信息载体 催化活性RNA:催化作用 RNA的种类 tRNA:氨基酸载体 rRNA:与蛋白质共同组成核糖体 mRNA:蛋白质合成模板

sRNA:分子修饰、代谢调节作用

(二)转录
以DNA为模板,以核苷三磷酸为底物,在 依赖DNA的RNA 聚合酶作用下,生成RNA的 过程。 nATP nGTP nCTP nUTP
DNA模板,Mg2+/Mn2+

RNA聚合酶

RNA+4nPPi

(三)RNA聚合酶
大肠杆菌RNA聚合酶:MW=5x105 全酶:由β β’ α ω σ组成,识别转录起始 位点,与DNA上的启动基因结合,使转 录开始。 核心酶:由β β’ α ω组成,进行核苷酸链 的延伸。

真核生物RNA聚合酶:三种
聚合酶种类 RNA聚合酶I RNA聚合酶II RNA聚合酶III

别名 存在位置

rRNA RNA 不均一RNA 小分子RNA 聚合酶 聚合酶 聚合酶 核仁 核仁 核之

相对分子质 量/103
催化反应产物

550
rRNA

600
mRNA

600
tRNA 5SrRNA

(四)转录的起始
RNA生物合成的起始位点在DNA的启动基因 (启动子)上 起始阶段的重要问题是RNA聚合酶与DNA 的启动基因的相互作用,起始阶段包括:

全酶的形成 酶与模板结合 酶与启动基因结合 模板DNA局部变性 转录开始

(五)转录的延伸
转录泡,17bp
解旋

重旋 5’ DNA 3’

3’

RNA 5’
RNA-DNA杂交体,8bp 酶的移动方向

活性中心

(六)转录的终止
模板DNA分子上每个基因或每个操纵子都含有一个 终止信号——终止子。当RNA聚合酶转录到达这个 信号时,合成的RNA分子以及聚合酶与模板DNA分 离,RNA链的合成便被终止。 ATP→ADP+Pi 5’
ρ RNA聚合酶 终止子

(七)RNA前体的加工
1.剪切反应 2.剪接反应 3.末端连接反应:

tRNA3’-末端加上CCA-OH尾巴 在mRNA的5’-末端加上“帽子”结构5’-m7GpppNmpNp 在mRNA 的3’-末端连接polyA尾巴 tRNA5’-末端加上甲基鸟苷酸 核苷修饰反应

二、蛋白质的生物合成——翻译
以mRNA为模板,以各种氨基酸为底物,在核糖体 上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用,合成多肽链 的过程,称为翻译。 转录

DNA
A T C G

aRNA
A U C G

翻译

蛋白质

43=64

遗传密码

氨基酸

遗传密码的简并性:61种密码——20种氨基酸
遗传密码的通用性 密码子与反密码子的相互作用:
mRNA

密码子 反密码子

5’-X Y Z-3’ 3’-X’ Y’ Z’-5’ tRNA

Crick根据立体化学原理,于1966年提出了摆动假说: 密码子与反密码子的配对中,前两对严格按照碱基配 对原则,而第三对碱基则可以有一定自由度地摆动,所 以,某些tRNA的反密码子可以识别一个以上的密码子。

1.氨基酸活化生成氨酰-tRNA
氨酰-tRAN合成酶

aa+tRNA+ATP

aa-tRNA+AMP+PPi

大肠杆菌,肽链合成的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸:

Met+tRNAF+ATP → Met-tRNAF+AMP+PPi
甲酰转移酶

fMet-tRNA

2.肽链的合成起始
IF-3 mRNA GTP-IF-2-fMet-tRNA fMRA 50s亚基
fMet

30s亚基

mRNA
IF-1+IF-2+IF-3 GDP+Pi

3.肽链的延伸
EF-T GTP*
fMet

aa1
fMet aa1

EF-T GDP+Pi
fMet

aa1
+EF-G +GTP

mRNA aa1
aa2 fMet fMet

aa1 aa2

tRNA1 EF-G GDP+Pi

fMet aa1 aa2

fMet aa1

tRNA2 +EF-G +GDP+Pi

+EF-G +GTP

+EF-T +GDP+Pi

aa2 +EF-T
+GTP

4.肽链的终止
终止密码子:UAA, UAG, UGA 释放因子(Release Factor): RF-1:UAA, UAG RF-2:UAA, UGA

5.翻译后加工
去除甲酰基 去除N-末端的氨基酸 肽链折叠

三、酶生物合成的调节

酶的类型

组成酶:DNA酶,RNA酶, 糖酵解途径的酶 调节酶:适应酶,β-半乳糖苷酶(诱导 酶)

酶合成的调节控制

转录水平的调节 转录产物的加工调节 翻译水平的调节 翻译产物的加工调节 酶降解调节

(一)操纵子学说 1960年Jacob和Monod提出的操纵子学说 调节基因:产生阻遏蛋白 启动基因 1.RNA聚合酶结合位点
2.cAMP及其受体蛋白复合物

操纵子

(cAMP-CRP)结合位点

操纵基因:与阻遏蛋白结合
结构基因:蛋白多肽链产物

操纵子
调节 基因 启动 操纵 基因 基因 结构 基因



R

P

O

S1

S2 … … DNA

mRNA 与阻遏蛋白结合
1.RNA聚合酶结合位点 2.cAMP及其受体蛋白复合物 (cAMP-CRP)结合位点

产生阻遏蛋白

原核生物中操纵子的类型

1.诱导型操纵子:乳糖操纵子

2.阻遏型操纵子:色氨酸操纵子

(二)原核生物中酶生物合成的调节机制 1.分解代谢物阻遏作用 2.酶生物合成的诱导作用 3.酶生物合成的反馈阻遏作用

1.分解代谢物阻遏作用
是指容易利用的碳源 阻遏某些酶(主要是 诱导酶)生物合成的 现象。
例:葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生 物合成

葡萄糖过 量降解

ATP
ADP, AMP

cAMP ↓ + H2O
cAMP-CRP↓

磷酸二酯酶

AMP↓

启动基因上没有 cAMP-CRP结合

酶合成↓

2.酶生物合成的诱导作用
加进某种物质, 无诱导物时: … R P O S1 S2 … DNA 使酶的生物合 成开始或加速 进行的过程。 简称为诱导作 添加诱导物时: 用,起诱导作 … R P O S1 S2 … DNA 用的物质,称 为诱导剂。
诱导物 转录

举例: 乳糖诱导β-半 乳糖苷酶的合成

翻译 酶

mRNA

乳糖

别乳糖

3.酶生物合成的反馈阻遏作用(产物阻遏作用)
是指酶催化作用的 产物或代谢途径的 末端产物使该酶的 生物合成受阻的过 程。引起反馈阻遏 的物质,称为共阻 遏物。
举例:无机磷酸阻 遏碱性磷酸酶

无阻遏物时: … R P

O S1 S2 … DNA
mRNA

翻译

添加阻遏物时: … R P O S1 S2 … DNA

共阻遏物
磷酸单酯 碱性磷酸酶 磷酸+醇

(三)真核生物中酶生物合成的调节机制 1.细胞分化改变酶的生物合成 2.基因扩增加速酶的生物合成 3.增强子促进酶的生物合成 4.抗原诱导抗体酶的生物合成

1.细胞分化改变酶的生物合成
(1)结合 DNA 3’ 5’ (2)延伸 DNA 3’ 5’ (3)移位 DNA 3’ 5’ 5’
TTGGGGTTGGGG3’ CCAACCCC

5’

3’

5’端粒酶RNA

TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’ CCAACCCC

3’

5’端粒酶RNA

5’
TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’ CCAACCCC

端粒酶催化端粒的延伸

3’

5’端粒酶RNA

2.基因扩增加速酶的生物合成
基因扩增:是通过增加基因的数量来调节基因表 达的一种方式。
例:CHO在含有氨甲蝶呤的培养基上培养 编码二氢叶酸还原酶的基因大量扩增,二氢叶 酸还原酶合成速度加快。

3.增强子促进酶的生物合成
增强子:又称调变子,是一段能够高效增强或

促进基因转录的DNA序列。增强子的重要特性是
能够促进同源或异源启动基因的转录活性,其增 强效果有时可达1000倍。

4.抗原诱导抗体酶的生物合成
1948年Pauling提出过渡态理论 1975年Kohler合Milstein发明单克隆抗体技术 1986年Lerner合Schultz分别独立获得具有 催化活性的抗体

第二节 酶的生物合成法生产

一、基本概念
? 酶的生物合成:所有的生物体在一定条件 下都能够产生多种多样的酶。酶在生物体 内的产生过程,称为酶的生物合成。

? 酶的生物合成法生产:经过预先设计,
通过人工操作控制,利用细胞(包括微生 物细胞、植物细胞和动物细胞)的生命活 动,产生人们所需要的酶的过程。

二、酶的生物合成法生产种类
?微生物发酵产酶 ?植物细胞培养产酶 ?动物细胞培养产酶

优良的产酶细胞应具备的条件

? 1.繁殖快,产酶量高,有利于缩短生产周期。 ? 2. 能在便宜的底物上良好生长。 ? 3. 产酶性能稳定,菌株不易退化,不易受 噬菌体侵袭。 ? 4. 产生的酶容易分离纯化。 ? 5. 不是致病菌及产生有毒物质或其他生理 活性物质的微生物,才能确保酶生产和应 用的安全。

三、酶发酵生产常用的微生物
1. 大肠杆菌
特征: 细胞成杆状,0.5μm*(1~3) μm,无芽孢,G-,菌落从 白色到黄色,光滑闪光,扩 展。 产酶种类:一般生产胞内酶 谷氨酸脱羧酶,天冬氨酸酶, 苄青霉素酰化酶,基因工程 研究用酶等

2. 枯草芽孢杆菌

特征: 细胞成杆状,(0.7~0.8) μm*(2~3) μm,单个, 无荚膜,周生鞭毛,运动, G+,菌落粗糙,不透明。 污白色或微带黄色。 产酶种类: α-淀粉酶、蛋白酶、β葡聚糖酶、碱性磷酸酶等

3. 链霉菌

特征: 最高等的放线菌。有发育良好 的分枝菌丝,菌丝无横隔,分化 为营养菌丝、气生菌丝、65孢子 丝。孢子丝再形成分生孢子。孢 子丝和孢子的形态、颜色因种而 异,是分种的主要识别性状之一。 产酶种类: α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚 糖酶、碱性磷酸酶等

4. 黑曲霉

特征: 属于半知菌亚门, 菌丝有隔, 细胞多核;部分气生菌丝细胞 形成特化的厚壁、膨大的足细 胞,由足细胞的中间稍呈垂直 地向上延长,形成分生孢子梗。 产酶种类: 糖化酶、α-淀粉酶、酸 性蛋白酶、果胶酶、葡萄 糖氧化酶等

5. 青霉

特征: 属于半知菌亚门,分生孢子 梗基部无足细胞,孢子梗 顶端不膨大成囊,而是多 次分枝形成扫帚状,小梗 末端形成分生孢子。 产酶种类: 葡萄糖氧化酶、果胶酶、 纤维素酶等

四、产酶菌种的筛选方法
胞内酶:含菌样品的采集→菌种分离→产酶性能
测定→复筛
①固体培养法:把菌种接人固体培养基中,保温 数天,用水或缓冲液浸泡培养基,将酶抽提,测 胞外酶: 定酶活力,这种方法主要适用于霉菌. ②液体培养法:将菌种接人液体培养基后,静置 或在摇床上振荡培养一段时间(视菌种而异), 再测定培养物中酶的活力,通过比较,筛选

五、酶的发酵生产方式
1.固体培养发酵
2. 液体深层发酵

3. 固定化细胞
4. 固定化原生质体发酵

第四节 发酵工艺的条件及控制

酶发酵生产的一般工艺流程
保藏细胞

细胞活化
原生质体

固定化原生质体 培养基

细胞扩大培养

固定化细胞 预培养

发酵
无菌空气 分离纯化 酶

一、细胞活化与扩大培养
细胞活化:保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜 面培养基上,在一定条件下进行培养,以恢复细胞的 生命活力,这就叫细胞的活化。 种子培养基:用于细胞扩大培养的培养基。 氮源丰富 碳源少 温度、pH、溶解氧 接种量:1~10%

二、培养基的配制
培养基:是指人工配制的用于细胞培养和 发酵的各种营养物质的混合物。
碳源 氮源 无机盐 生长因素

三、pH调节
1.细胞发酵产酶的最适pH与生长最适pH值往往

不同,通常接近于该酶反应的最适pH。
2.有些细胞可以同时产生多种酶,通过控制培

养基的pH,往往可以改变各种酶之间的产量
比例。

3.培养基的pH在细胞生长繁殖和代谢物产生的
过程中往往会发生变化。

四、温度的调节控制
1.细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有

所不同,而且往往低于最适生长温度。
2.有些酶的发酵生产,要在不同阶段控制不同

的温度条件。

五、溶解氧的调节控制
调节溶解氧的方法:

(1)调节通气量
(2)调节氧的分压

(3)调节气液接触时间
(4)调节气液接触面积

(5)改变培养基的性质

六、微生物产酶的方式及特点
1.固体培养发酵 优点:设备简单、操作方便、麸曲中酶浓度 较高、适合霉菌培养发酵 缺点:劳动强度大、原料利用率低、生产周 期长

2.液体深层发酵
3.固定化细胞

4.固定化原生质体

七、提高酶产量的措施
葡萄糖:1个 酶的作用底物: β-半乳糖苷酶 乳糖:3000个 半乳糖醛酸诱导果胶酶 酶的反应产物: 纤维二糖诱导纤维素酶

1.添加诱导物

酶的底物类似物: 异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)

对β-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖 高几百倍

2.控制阻遏物的浓度:无机磷是碱性磷酸酶的阻 遏物

3.添加表面活性剂:增加细胞的通透性
4.添加产酶促进剂:聚乙烯醇提高糖化酶的产量 机理尚不清楚

八、酶发酵动力学
发酵动力学是研究发酵过程中细胞生 长速度、产物生成速度、基质消耗速 度以及环境因素对这些速度的影响的 学科

(一)酶生物合成模式
细胞浓度/(mg/mL) 细胞浓度/(mg/mL) 酶浓度/(单位/ml)

I

II

O A

B 时间/h

C D

III 时间/h

IV

O-A调整期 A-B生长期 I-同步合成型 II-延续合成型 B-C平衡期 C-D衰退期 III-中期合成型 IV-滞后合成型

(二)各种酶生物合成模式的特点
1.同步合成型 例:单宁诱导米曲霉合成单宁酶
细胞浓度/(mg/mL) 酶浓度/(单位/mL)

特点: 1.生物合成可以诱导, 但不受分解代谢阻 遏物和反应产物阻 遏。 2.酶所对应的mRNA很 不稳定。

0

20

40

60

时间/h

细胞浓度 总酶浓度 胞外酶浓度 胞内酶浓度

2. 延续合成型 例:果胶诱导黑曲霉合成聚半乳糖酸酶
细胞浓度/(mg/mL) 酶浓度/(单位/mL)

特点: 1.生物合成可以诱导, 但不受分解代谢阻 遏物和反应产物阻 遏。 2.酶所对应的mRNA很 稳定。

0

20

40

60

时间/h

细胞浓度

总酶浓度

3.中期合成型 例:枯草杆菌合成碱性磷酸酶
细胞浓度/(mg/mL) 酶浓度/(单位/mL)

特点: 1.生物合成受反馈抑 制。 2.酶所对应的mRNA不 稳定。

0

20

40

60

时间/h

细胞浓度

酶浓度

4. 滞后合成型 例:黑曲霉合成酸性蛋白酶
细胞浓度/(mg/mL)
酶浓度/(单位/mL)
0 20 40 60

特点: 1.酶在对数期不合成。 2.酶所对应的mRNA稳定。

时间/h

细胞浓度

酶浓度

第五节 动、植物细胞发酵产酶

一、动植物细胞的特点
微生物细胞
细胞大小/μm 倍增时间 营养要求 对剪切力 主要产物 1~10 0.3~6 简单

动物细胞
20~300 〉12 简单

植物细胞
10~100 〉15 复杂 敏感 激素、疫 苗、单克 隆抗体、 酶

大多数不敏感 敏感 醇类、有机酸、色素、香精、 氨基酸、抗生 药物、酶、 素、酶、核苷 次级代谢产 酸 物

二、植物细胞发酵
(一)植物细胞发酵特点 1.产率高 2. 周期端 3.易于管理、减轻劳动强度

4. 产品质量高

(二)植物发酵产酶的工艺条件控制
1.温度的控制:25℃ 2. pH的控制:微酸pH5-6 3.溶解氧的调节控制:相对少 4.光照的控制:生长及次级代谢产物

5.前体的添加:
6.刺激剂的应用:

三、动物细胞的发酵
(一)动物细胞培养产生的主要功能蛋白 1.疫苗 2. 激素 3.多肽生长因子 4.酶 5.单克隆抗体 6.各种细胞因子

(二)动物细胞的特性

1.没有细胞壁
2. 体积比微生物细胞大几千倍 3.群体效应、锚地依赖性、接触抑制、 功能全能性 4.营养要求复杂

(三)动物细胞培养的特点

1.生长较慢,细胞倍增时间15~100小时
2. 较容易污染 3.体积大、无细胞壁保护,对各种外界因 素敏感 4.需贴壁培养 5.培养基成分复杂 6.原代细胞培养后会退化死亡

(四)动物细胞发酵产酶的工艺条件

1.温度:36.5℃
2. pH=7.0~7.6 3.渗透压:700~850kPa 4.溶解氧

动物细胞 连续培养


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