当前位置:首页 >> 农林牧渔 >>

转基因水稻定性PCR检测体系的建立


2008年11月

中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association

V01.23.No.6 Nov.2008

第23卷第6期

转基因水稻定性PCR检测体系的建立
王小琦
张名昌 任志强 冯瑞云 张

维锋

(山西省农业科学院作物遗传研究所,太原03003i) 摘要采用PCR技术检测CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因,判断水稻样品中是否含转基因成分,

建立了稳定快速的转基因水稻定性PCR检测体系。PCR检测的灵敏度达到0.1%,稳定性良好。结果表明:
PCR技术检测外源基因是灵敏和准确的,可以广泛地应用到转基因作物及其加工产品的转基因成分检测中。 此外,进一步讨论了转基因成分检测中存在的问题、转基因产品标识的必要性和目前转基因检测技术在检测 中的问题。 关键词 水稻转基因 定性检测 内源检测极限 测体系。

随着现代生物技术的发展,抗虫、抗病、抗除草 剂、抗逆、高产优质性状的转基因水稻品系不断培育 成功,转基因植物在全球范围内广泛种植,转基因植 物及其产品已从农田遍及到餐桌,转基因植物及其 产品的安全性已经引起了全球公众的重视和担 忧…。为此,各国政府和主要国际组织纷纷加强了 转基因植物及其产品的安全性评价和研究。到目前 为止,全球已有四十多个国家颁布了转基因食品的 标识制度,并且明确规定了转基因食品的标识极限 和方法。如:欧盟规定食品中转基因成分的阈值为 O.9%l引,日本的转基因标识阈值为5%l 3i,韩国为 3%[4l,美国和加拿大实施自愿标识制度b J,我国政 府规定了转基因食品的零阈值…6。 目前,转基因生物检测技术主要分为两大 类[7-9],一类是基于蛋白质检测的蛋白检测技术,另 一类是基于核酸检测的检测技术。由于核酸分子具 有很高的稳定性,核酸检测方法具有简单、高效、特 异性高等优点,核酸检测技术成为了转基因生物检 测的主要技术。其中,聚合酶链式反应(Polyrnerase
Chain



材料与方法
转基因抗虫水稻品系由中国水稻所提供。非转

1.1材料

基因水稻品种由浙江农科院作核所提供。灵敏度检

测所用标准试样是将经鉴定为转基凶的水稻品系与
非转基因水稻混合,由本实验窜制成。 植物基因组DNA抽提试剂盒:上海瑞丰农业科 技公司;定性PCR用Taxi DNA聚合酶、dNTPB、MgCl2 及其缓冲液:Takara;100
bp DNA

Marker:大连宝生生

物有限公司;DY2501型核酸电泳仪:北京六一仪器

厂;DUR640核酸和蛋白分析仪、图像分析系统Alpha
Innotech的凝胶成像系统:BECKMAN公司;定性PCR FIE一100仪:MJ Research公司。 1.2方法 1.2.1水稻基因组DNA的提取与纯化 水稻基因组DNA利用上海瑞丰农业科技有限公 司的植物基因组DNA抽提试剂盒提取和纯化,DNA 样品的质超用琼脂糖凝胶电泳和核酸定量检测的方 法进行评价。取3—5
t,L

Reaction,PCR)技术因其简易操作、高效率、高

通亮和高灵敏度等优点,已成为转基因生物核酸检 测技术中最主要的,在各国转基因检测中广泛应用, 发挥了极大的作用。本研究以转基因水稻品系为试

DNA溶液在含有溴乙锭的

1%琼脂糖里进行凝胶电泳分析,判断其浓度和纯
度。利用BECKMAN公司的DUR 640核酸和蛋白定

验材料,采用定性PCR方法检测水稻的外源转基因
成分,以期建立快速、灵敏、有效的转基水稻成分检
收稿日期:2007一11一僻 作者简介:王小琦,男,1978年出生,助理研究员,作物遗传育种 通讯作者:张维锋,男,1958年出生,研究员,作物遗传育种

量分析仪对DNA样品进行质量测定及浓度定
量[10—12}。
1.2.2

PCR扩增反应

PCR反应条件:参考转Bt基因水稻检测技术规

万方数据

第23卷第6期

王小琦等转基因水稻定性PER检测体系的建立

203

范定性PCR方法(试行)[12]。
1.2.3

277

bp大小的条带,检测结果的特异性很好。如图la CaMV35s定性PER检测体系建立

PCR引物合成

所示,水稻内源基因SIPS定性PCR检测结果。
2.2

所用引物由宝生物工程(大连)有限公司合成, 引物信息如表1所示。
1.2.4

利用设计的特异性引物建立了CaMV35s的定性
PCR检测体系,对转基因和非转基因水稻品系进行 定性PER检测,在含有Ca ̄Ⅳ35s的转基因水稻中都 可以扩增得到单一的195 bp大小的条带,非转基因

PCR对照设置

为避免实验污染而造成PCR扩增结果出现假阳性 或假阴性,进行PCR检测时必须设置阳性对照、阴性对 照和空白对照。阳性对照用阳性材料提取的DNA作为 模板。阴性对照用阴性材料提取的DNA作为模板。空 白对照用ddH20代替DNA模板[10‘11]。 1.2.5定性PCR扩增体系
表2 成分
10x PCR Buffer
2.5 mmot/L

水稻和空白对照没有扩增条带,如图1b所示,检测
结果的特异性很好。
2.3

NOS定性PcR检测体系建立

利用设计的特异性引物建立了NOS终止子的定
性PER检测体系,对转基因水稻和非转基因水稻品
体积/且L
3.O

PER扩增体系

系进行定性PCR检测,含有Nos的转基因水稻可以 扩增得到单一的180 bp大小的条带,如图1£所示,

dNl甲 F R

3.O O.5
O.5

加{珏'ad/L
20 tanol/L
DNA

检测结果的特异性很好。
2.4抗虫Bt基因定性PcR检测体系 利用设计的特异性引物建立了外源基因Bt的定 性PCR检测体系,对转基因水稻品系进行定性PCR 检测,含有Bt的转基因水稻可以扩增得到单一的

Priraer Primer

Polymerase

0.2 2.0 19.0

Template DNA ddn20

1.2.6

PCR结果观察与分析

415

2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶成像
分析系统观察记录电泳结果。 1.2.7定性PCR检测体系的检测极限(LOD) 用一系列不同转基因含量(10%、5%、3%、1%、

bp大小的条带,检测特异性很好。如图ld所示, 转基因水稻外源基因Bt定性PCR检测结果。

2.5外源基因定性PCR检测体系检测极限(LOD) 利用不同转基因成分(如10%、5%、3%、1%、 0.5%、0.1%、0.05%和0.01%)的标准DNA样品测

0.5%、0.1%、0.05%和0.01%等)的标准DNA样品 为PCR扩增模板,经过至少三次重复后,确定可以获
得PER扩增到的DNA样品的最低转基因含量为相 对LOD值哺一9j。

试CaMV35s启动子、NOS终止子、Bt基因PCR检测体
系的检测极限,根据标准DNA样品测试的结果判断

建立的定性PCR方法的LOD值。
经过多组不同转基因含量的标准DNA样品的重

复测试,CaMv35s启动子定性PCR检测方法的IDD

2结果与分析
2.1水稻内源基因SPS扩增体系的建立

为0。05%,图2a显示了用不同转基因水稻含量的标
准DNA样品进行LOD测定的结果。NOS终止子定 性PER检测方法的LOD为0.05%。图2b显示了用 不同转基因水稻含量的标准DNA样品进行LOD测 定的结果。

利用设计的特异性引物建立了水稻内源基因 SPS的定性PCR检测体系,对转基因水稻品系和非转 基因水稻进行定性WaR检测,均扩增得到单一的

万方数据

204

中同粮油学报

2008年第6期

注:a为C4tMv 35 s启动子;b为NOSX终止子;C为盯基因。泳遭 1—9分别为空白对照、10%、5%、3%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和 O。Ol%的转基冈GKl9棉花DNA样品;泳道M为DNA分子量Ml|rkel- 图2转基因水稻定性PCR检测方法LOD测试

分,通过多次重复试验,建立了稳定快速的转基因水 稻定性PCR检测体系。美国、欧盟、日本、韩国等都 规定j,食品中转基因成分的最高含量11“J,目前市 场上存在的转基因加工产品大部分是转和非转基因 产品混合制成的,有些加工产品中转基因成分含量 极低,为此本研究利用转基因水稻和非转基因水稻 按一定比例(10%、5%、3%、1%、0.5%、0.1%、 0.。5%和0,01%等)混合成不同的浓度梯度,进行了 PCR定性检测灵敏度试验,确定了转基因水稻定性
注:M表示Mafker(100bp);Rl表示样品产行l的窜复;R2表示样 品平行1的重复2;R3表示表样品平行l的重复3;PC表示刚性对照; Nc表示阴性对照;W表示水;Rl 7表示样品平行2的蘑复l;R2’表示样 品平行2的重复2;R3’表示样品平行2的重复3 图1利用设计的特异性引物建立的不同定性PCR检测结果图

PCR检测的灭敏度可达到0.1%,稳定性良好。结果 表明:PCR技术检N;'I-源基因是灵敏和准确的,可以 广泛地应用到转基因产品及其加工产品的转基因成 分检测中。 3.2检测PCR与实验PCR的异同 PCR技术是分子生物学的基础技能,但检测PCR 要求每一次结果都要准确、无污染,这对检测人员、 检测实验室、检测试剂提出更高的要求。实验一次 失败可以蘑复做一次,但检测要求每一次都不能失 败,检测结果可能会影响政府的决策,企业的声誉及 成败,产品的推广等,这就要求检测PCR体系高度稳 定。

在转基因水稻成分为10%、5%、3%、1%、 0.5%、0.1%和0.05%的DNA样品中均扩增得到了
415

bp的片段,在0.01%的转基因水稻样品中目的片

段没有扩增,说明实验建立的Bt基因特异性PCR检 测方法的LOD为0.05%,图2c显示了用不同转基因 水稻含量的标准DNA样品迸行LOD测定的结果。



结论与讨论
本研究采用PCR技术检测CaMV35S启动子、

3.3转基因产品的安全性及其标识必要性 随着转基因产品的商品化,转基因生物及其产 品的安全性问题已逐渐引起各国的关注,转基因产 品的检测已纳入国内外检验检疫部门的检测项目。

3.1转基因水稻定性PCR检测体系及其检测低限

NOS终止子、Bl基因,判断水稻样品是否含转基因成

万方数据

第23卷第6期

3-.d,琦等转基因水稻定性PCR检测体系的建立

205

国际科学联合会认为转基因食品(蔬菜)可安全食用
的理由为:“自1995年投入市场以来尚无不良后果报 道”。但又提出警告说:“这并不保证随着越来越多 的食品经过改造具备新的特色之后不会遇到危险”。 针对这样的理由,我们吃不吃转基因食品的答案只 有一个:选择权交给消费者自己,这一答案适用于全 世界[13]。那么,市场上的转基因蔬菜,谁来贴标签 呢?这是一项具有现实积极意义和国家战略发展需 要的藿要工作,为此,建立转基因农产品、食品、蔬菜 等检测检验能力体系,建立转基因产品质量安全监

参考文献 [1]杨庆文.转基因水稻的生物安全性问题及其对策.植物遗 传资源学报,2003,4(3):261—264 [2]European
Commission

Regulation(Ec)No.1829/2003

and

1830/2003.Off.J.Eur.Corranun.2003,L 268:1—28

[3]Notification

No.31.Ministry

of蚓cultllre

and Forestry of Kore—

a,Seoul,Korea,2000

[4]Notification

No.1775.Food

and Marketing Bureau,Ministry of of Japan,Tokyo,Japan,

Agriculture,Foresn'y and Fisheries 2000

督检测体系,标识转基因产品并评价其安全性是迫
在眉睫的工作。 3.4多重PCR及定量检测 多重PCR检测转基因产品时,1次PCR和1次 电泳即可同时检测出多种转基因成分,可大大节约

[5]Matsuoka,T.GMO labeling and
APEC—JIRCAS Joint
Biotechnology,2001

detection methods in

Japan.

Sy_唧商啪and
of

Workshop

on

Agricultural

[6]Order No.10.Ministry

ACcultm-e of

the People’s Republic of

China,Beijing,Claim,2002 [7]闰新甫.转基因植物.北京:科学出版社,2003 [8lAme,l-t1.Ronning,SB.Lovseth,A.,et a1.PCR
technology

试剂和时间;由于各对引物扩增时存在竞争,可有效
避免假阳性的出现而提高检测准确率,且不影响检

测的灵敏度【14J。实时PCR检测可大大提高检测的
灵敏度,同时清楚产品(食品)中转基因成分的绝对 含量。但目前应用这些方法还存在一些问题,如在 应用多重PCR时检测,目前使用的一些标准中检测 同一材料的引物之间存在很大程度的互补,扩增产

for啪ning
tion

and

qL幽曲ca60n

of genetically modified

or驴ni日璐

(GMOs).Anal

Bioanal

Chem.2003,375:985—993
analysis for the

[9]ISO 24276:2006,Foodstuffs—Methods of
of genetically modified

detee—

oq笋凼璐and

derived products—

General requirements and definitions

[10]GB/T 19495.1—2004《转基因产品检测通用要求和定 义》 [11]NY厂r 672—2003《转基因植物及其产品检测通用要求》

物片段大小相近等,严重影响PCR扩增效率和凝胶 检测效率。因此在制定修改标准和设计引物时要特 别注意这一问题,本研究进行了多重PCR(数据略)
验证,但由于引物之间互补切产物片段相差较小,一 次只能检测两个参数。荧光定量PCR检测的灵敏度

【12]转Bt基因水稻检测技术规范定性PER方法(试行),上海
农业科学院,2005 [13]1he
bios.coln
safety of GM

Livestock Feeds[EB/OL].Hnp://www.ag?

高,但检测成本高,对检测人员素质要求、检测环境
要求较高。

[14]张平平,刘宪华.多重PCR方法对大豆转基因食品的定 性检测.食品科学,2004,25(11):227—230。

Qualitative
Wang
(Crop Xiaoqi

PCR Detection of Transgenic Rice
Zhang Mingchang Ren Zhiqiang
Feng Ruiyun

Zhang Weifeng
Genetics Institute,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 03003

1)

创bstll硪A
er,terminator

reliable and simple polymerase chain of Agrobacterium nopaline synthase

reaction(PCR)method gene(NOS)and

for detecting external

C州V
ale

35S promot-

re,on

Bt gene from genetically modified rice was estab— delicate and

lished in this work.Results indicate that the detection limit is less than 0.1%.and the PCR technique accurate.and
are

applicable to detect transgenic components from transgenic crops
are

and

foods.Some problems about the de?

tection technique and the necessity of marking wansgenic products Key words transgenic

discussed. limit

rice,qualitative detection,endogenesis,detection

万方数据

转基因水稻定性PCR检测体系的建立
作者: 作者单位: 刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 被引用次数: 王小琦, 张名昌, 任志强, 冯瑞云, 张维锋, Wang Xiaoqi, Zhang Mingchang, Ren Zhiqiang, Feng Ruiyun, Zhang Weifeng 山西省农业科学院作物遗传研究所,太原,030031 中国粮油学报 JOURNAL OF THE CHINESE CEREALS AND OILS ASSOCIATION 2008,23(6) 1次

参考文献(14条) 1.杨庆文 转基因水稻的生物安全性问题及其对策[期刊论文]-植物遗传资源学报 2003(03) 2.European Commission Regulation (EC) No.1829/2003 and 1830/2003 2003 3.Notification No.31 2000 4.Notification No.1775 2000 5.Matsuoka,T GMO labeling and detection methods in Japan 2001 6.Order No.10 2002 7.闫新甫 转基因植物 2003 8.Ame,HJ.Ronning,SB.Lovseth,A PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs) 2003 9.ISO 24276-2006.Foodstuffs-Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products-General requirements and definitions 10.GS/T 19495.1-2004.转基因产品检测通用要求和定义 11.NY/T 672-2003.转基因植物及其产品检测通用要求 12.转Bt基因水稻检测技术规范定性PCR方法(试行) 2005 13.The safety of GM Livestock Feeds 14.张平平.刘宪华 多重PCR方法对大豆转基因食品的定性检测[期刊论文]-食品科学 2004(11)

相似文献(10条) 1.期刊论文 魏兴华.袁筱萍.余汉勇.王一平.汤圣祥.廖西元 转基因插入对水稻花粉活力和杂交结实的影响 -应用 生态学报2005,16(1)
以花粉活力和杂交结实率评价转基因插入对水稻品种异交潜力的影响.选用含bar、crylAb、BADH和Xa21等4种基因的5份转基因水稻品系研究转基因 插入对转基因受体品种花粉离体萌发率的影响.结果表明,不同受体品种花粉离体萌发率差异显著;转基因水稻花粉离体萌发率在0.416~0.584间,与受体 品种(0.400~0.574)相近;转基因品种与相应受体品种间花粉离体萌发率差异不显著.对所选配的26个人工杂交组合杂种结实调查表明,bar、crylAb基因 的插入对受体品种杂交结实率影响显著,而Xa21基因的插入对受体品种杂交结实率影响较小;转基因水稻品种(花粉供体)与非转基因水稻品种的杂交结实 率变幅为0.056~0.413,在受体品种(花粉供体)与非转基因水稻品种的杂交结实率范围(0.052~0.417)之内.本研究花粉离体萌发和杂交结实结果表明转 基因的插入对水稻品种异交潜力的影响甚微.

2.学位论文 陈良燕 抗虫基因对受体水稻(Oryza sativa)的适合度效应研究 2005
多种抗水稻虫害的外源基因已经被转入水稻中,一些转基因水稻品系已进入了环境安全评估并等待商业化生产。外源转基因可以通过基因漂移逃逸 到水稻的野生近缘种或杂草种群中并带来一定的环境生态后果。但是转基因水稻中的外源基因是否能在野生近缘种或杂草种群中被固定下来和扩散开来 ,这与外源基因是否能提高野生近缘种或杂草类型的适合度密切相关。在一定的虫压条件下,抗虫基因可能为野生近缘种或杂草种群带来适合度利益 ,但在没有虫压的条件下,抗虫基因可能会消耗野生近缘种或杂草类型的部分能量来运转该抗虫基因,从而产生适合度净成本。了解转基因水稻中的抗 虫基因对转基因水稻植株所带来的利益与净成本之间的平衡,可以为评估转基因水稻与野生亲缘种之间的杂交后代是否会因为适合度的改变而带来环境 后果提供有用的信息。但是,在严格的授控试验条件下开展水稻抗虫转基因潜在的适合度成本与利益的研究还未曾有过报道。与其它类型的转基因作物 一样,转基因水稻的生物安全评估需要阐明这些转基因作物向野生和杂草近缘种基因流的程度以及基因流产生之后,逃逸到野生或杂草近缘种中的外源 基因是否可能为杂草稻或野生稻带来适合度上的优势,从而导致不利的生态后果。作为了解外源转基因对野生稻或杂草稻可能产生生态效应的第一步 ,本项研究以中国研制的已接近商业化生产的转Bt基因、转CpTl基因和转Bt/CpTl双价基因3种抗虫转基因水稻品系作为研究对象,于2003年和2004年进 行了低虫压和高虫压授控条件下的盆栽试验和大田试验,比较了存在直接竞争和不存在直接竞争条件下的转基因抗虫水稻与非转基因亲本对照品种的生 长和结实,特别关注了这些经过多代选育的转基因栽培稻品系中的外源基因是否表现出可检测水平的适合度成本与利益。 在2003年的盆栽试验中,转基因品系受螟虫危害的程度均低于非转基因对照品系,Bt、CpTl和Bt/CpTl三种抗虫基因可以为转基因品系的抗虫性能带 来优势。在低虫压的条件下,Bt基因未对转基因品系造成种子生产的适合度净成本,在高虫压条件下可以为转基因品系带来种子生产的适合度利益,无 论是在非竞争试验或是竞争试验中,Bt基因都可以显著增强植株的分蘖能力,使得植株的结穗数显著增加,结实数量显著增加;Bt基因在竞争条件下对 转基因水稻植株的适合度利益更为明显。CpTl基因对种子生产的适合度效应不明显,低虫压条件下未对转基因品系的结实产生适合度净成本,高虫压条

件下能显著增强植株的分蘖能力,导致植株结穗数的显著增加,但对植株最终的结实没有带来适合度利益,表明CpTl基因对种子生产的适合度效应可以 忽略。Bt/CpTl基因对植株种子生产的适合度效应显著,在低虫压的竞争条件下,Bt/CpTl品系的种子产量显著低于对照,种子的千粒重也显著低于对照 ;在高虫压条件的非竞争条件下,转Bt/CpTl基因水稻植株在结实上可以表现出一定的适合度利益,但在高虫压的竞争条件下,其适合度利益不再显现 ,表明Bt/CpTl基因在竞争条件下的适合度成本已经达到可以抵消其适合度利益的程度。 在2004年的田间试验中,转基因品系均表现出良好的抗虫性能,受水稻纵卷叶螟和三化螟等钻蛀性螟虫的感染程度均显著低于非转基因对照。历基 因对植株种子生产的适合度效应不明显,在低虫压条件下,Bt品系仅在非竞争条件下的结实率显著低于对照,在其它结实指标上未检测到适合度效应 ,但Bt品系在低虫压竞争条件下的结实数量和结穗数量与对照的差异己接近显著水平(P>O.05,且<O.1);在高虫压条件下,Bt基因在非竞争试验和竞争 试验中均未产生植株结实的适合度效应。CpTl基因对转基因品系种子生产的适合度效应也不明显,在低虫压竞争条件下的千粒重显著低于对照,其它结 实指标与非转基因对照无显著差异;在高虫压条件下未检测到种子生产的显著的适合度效应。Bt/CpYl基因对结实的适合度成本比较显著,在低虫压条件 下,Bt/CpTl品系在非竞争试验中的千粒重显著低于对照,在竞争试验中的结实率、每株实粒重、千粒重、每株结穗数和穗长等结实指标上显著低于对照 ;在高虫压条件下,无论是非竞争试验或是竞争试验中,Bt/CpTl品系的千粒重都显著低于对照。 在田间施用杀虫剂的条件下,Bt品系在竞争条件下各个生长时期的株高和分蘖数显著低于非转基因对照,成熟期的生物量鲜重也显著低于对照,分 蘖数的显著降低导致结穗数的显著降低,从而影响研品系种子的生产,在转基因品系与非转基因品系存在竞争时,这种效应表现得更明显。对于CpTl品 系和Bt/Cptl品系,外源基因对株高有显著的负效应,但对分蘖的影响不显著,对结实的适合度成本也很低。 研究发现,竞争条件下更容易检测到抗虫基因对转基因水稻所带来的适合度效应。在竞争条件下,转基因水稻品系在生长发育和结实上的适合度成 本和利益更为显著。在转基因品系单一种植的非竞争条件下,抗虫基因对转基因水稻植株产生的适合度成本很小,甚至可以忽略,特别是在靶标害虫发 生量大的条件下。 在关于转基因水稻生态安全的研究中,还需要进一步探讨转基因水稻中外源基因的逃逸对野生稻和杂草稻生态适合度的改变、外源基因在野生稻和 杂草稻个体中的表达,以及外源基因在野生稻和杂草稻种群中的持久性。本项研究对有可能商业化种植的3种转基因水稻品系进行了适合度效应的检测与 分析,其结果可以为转基因水稻外源转基因逃逸带来的生态后果评估提供一定的参考,试验中建立的方法可以应用到需要进一步进行的外源基因对野生 稻和杂草稻适合度效应的研究中,在本研究中所揭示的抗虫基因对转基因品系的适合度效应也可以为进一步评估野生稻和杂草稻适合度效应提供有益的 信息。

3.期刊论文 张祥喜.华志华.陈光宇.黄大年 水稻抗性转基因研究进展 -生物工程进展2001,21(2)
随着水稻遗传转化技术的发展,通过基因工程手段获得抗病虫草害及逆境水稻品种成为可能.本文综述了近年来国内外水稻抗性转基因的技术、方法 和策略等研究现状、发展趋势、存在的问题及解决方法,对水稻抗性转基因在水稻育种上的应用也作了评价.

4.学位论文 李英华 转Xa21基因水稻食用安全性及转CpTI基因水稻外源蛋白致敏性研究 2005
目的 @@(1)通过动物喂养实验,观察转Xa21基因大米对机体的生长发育、免疫功能、 亚慢性毒性和生殖毒性的影响,从多角度对Xa21大米的食用安全性进行研究。(2) 对转Xa21基因水稻植株进行定性研究,对Xa21基因在水稻不同组织中的转录水平 进行定量分析。(3)探讨建立外源蛋白在模拟胃肠环境中稳定性评价体系。(4)根 据WHO/FAO提出的决定树原则,对CpTI转基因大米中的目的基因和标记基因所表 达的蛋白进行致敏性研究。 @@方法 @@1动物喂养实验 @@1.1营养学评价实验 @@根据转Xa21基因大米和同品系非转基因对照大米的营养成分分析结果,以美国 营养学会推荐的满足啮齿类生长发育需要的AIN93G全价饲料配方为标准,配制转 基因大米饲料(含转Xa21基因大米83.6%)和非转基因大米饲料(含非转基因大米 84.3%)。所有饲料中蛋白质的含量均为10%。将初断乳Wistar大鼠60只按性别分别 随机分为三组:转基因大米组,非转基因大米对照组和AIN-93G正常对照组。喂相 应鼠料,饮同一自来水。实验期间,每两天记录大鼠进食量一次。每周测身长、体 重一次。观察大鼠生长发育情况。喂满28天后,将动物处死,测血常规和血生化。 取内脏称重,计算脏体比。取右侧后腿股骨,测股骨中点及干骺端骨密度。 @@1.2免疫毒理学实验 @@以AIN93G全价饲料配方为标准,配制转基因大米饲料(含转Xa21基因大米 73.2%)、非转基因大米饲料(含非转基因大米73.7%)和AIN93G饲料。将96只Balb/c 小鼠随机分为4组,即转基因大米组、非转基因大米组、AIN93G对照组和环磷酰胺 免疫力抑制阳性对照组。饲相应鼠料,阳性对照组饲料同AIN93G对照组,饮自来 水,自由进食。于第29天,阳性对照组每只小鼠腹腔注射1mg/ml环磷酰胺0.25ml (约为100mg/Kg),第30天加强一次,制造免疫力低下动物模型。测血常规和 CD4/CD8比值。观察细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫功能的变化。 @@1.3亚慢性毒性实验 @@饲料的配制同免疫毒理学实验。初断乳Wistar大鼠144只,按性别分别随机分 为三组:转基因大米组,非转基因大米对照组和AIN-93G对照组。饲相应鼠料,自 由进食。每周记录大鼠进食量两次。每周测身长、体重一次。观察大鼠生长发育情 况。实验中期和末期采血,测血常规和血生化。第91天处死动物,取内脏称重,计 算脏体比,并对脏器进行病理检查。取右侧后腿股骨,测股骨中点及干骺端骨密度。 @@1.4致畸实验 @@饲料的配制同免疫毒理学实验。初断乳Wistar大鼠160只,按性别分别随机分 为四组:转基因大米组,非转基因大米对照组、AIN-93G对照组和敌枯双阳性对照 组。饲相应鼠料,阳性对照组饲料同AIN93G对照组,自由进食。喂满90天后,将 雌雄按1:1合笼。阳性对照组于怀孕第7-16天灌胃致畸物敌枯双(1mg/Kg)。所有 孕鼠于怀孕第20天被处死,观察孕鼠母体毒性和胎鼠生长发育情况。 @@2Xa21基因在转基因水稻中的定性和定量研究 @@2.1Xa21基因在转基因水稻中的定性研究 @@根据Xa21基因序列,设计特异性引物,分别以转基因水稻和非转基因水稻叶片 中的DNA为模板,进行PCR反应,琼脂糖电泳,鉴别目的条带。通过Southern杂 交实验,进一步进行转基因植株的鉴别和目的基因拷贝数的确定。 @@2.2Xa21基因在转基因水稻不同组织中转录水平的研究 @@提取转基因水稻不同组织总RNA,以oligdT为引物反转录cDNA。以cDNA为 模板,进行Real time PCR扩增。以含有目的基因/管家基因片段的T载体质粒做标 准曲线,通过Ct值,计算样品中目的基因/管家基因的起始拷贝数。 @@3外源蛋白在模拟胃肠环境中稳定性评价体系的建立 @@根据美国药典提供的模拟胃液、肠液配方,以11种标准蛋白质为研究对象,观

察不同蛋白质在模拟胃肠环境中的稳定性。选出不易降解的蛋白质作为阳性对照, 选出易降解的蛋白质作为阴性对照,为评价其他蛋白质的稳定性提供参照。 @@4对CpTI转基因大米中的目的基因(cpti)所表达的CpTI蛋白和和标记基因(hpt) 所表达的HPT蛋白的致敏性研究 @@4.1 CpTI蛋白的致敏性研究 @@根据WHO/FAO提出的决定树原则,确定cpti基因的来源、分析CpTI蛋白氨基 酸序列与已知致敏原氨基酸序列的同源性,分析CpTI蛋白在模拟胃液中的稳定性, 检测CpTI蛋白与过敏人群的血清学免疫反应。 @@4.2 HPT蛋白的致敏性研究 @@根据WHO/FAO提出的决定树原则,确定hpt基因的来源、分析HPT蛋白氨基 酸序列与已知致敏原氨基酸序列的同源性,分析HPT蛋白在模拟胃液中的稳定性, 检测HPT蛋白与过敏人群的血清学免疫反应。 @@结果 @@1营养学评价实验 雄性:转基因大米组肝体比值显著高于非转基因大米组 (p<0.05),但与AIN93G对照组无统计学差异(p>0.05);其他所有指标,转基因大米 组和非转基因大米组均无统计学差异(p>0.05)。雌性:转基因大米组肝体比值显著 高于非转基因大米组(p<0.05),但与AIN93G对照组无统计学差异(p>0.05);转基 因大米组血钙浓度和股骨密度高于其他两组(p<0.05);其他指标,三组之间无统计 学差异(p>0.05)。 @@2免疫毒理学实验 转基因大米组和非转基因大米组,所有观察指标均无统计学差 异(p>0.05)。阳性对照组淋巴细胞数、体液免疫功能、细胞免疫功能和非特异性免 疫功能均显著低于其他三组,表明免疫力抑制动物模型复制成功。 @@3亚慢性毒性实验雄性:转基因大米组和非转基因大米组,所有观察指标均无统 计学差异(p>0.05)。雌性:实验中期,转基因大米组胆固醇和高密度脂蛋白显著高 于非转基因大米组(p<0.05),实验末期,上述差异消失。实验末期,转基因大米组 肝体比值、肺体比值和谷草转氨酶活性显著高于非转基因大米组(p<0.05),但与 AIN93G对照组无统计学差异(p>0.05)。三组实验动物内脏病理检查未发现明显异 常。 @@4致畸实验 转基因大米组和非转基因大米组,所有观察指标均无统计学差异 (p>0.05)。阳性对照组与其他三组相比,胎鼠身长、尾长、体重显著降低(p<0.01), 外观畸形率、骨骼畸形率和内脏畸形率显著增高(p<0.01),表明阳性对照动物模型 复制成功。 @@5 Xa21基因在转基因水稻中的定性和定量研究PCR结果证实:随机抽测的6株 转基因水稻,全部扩增出1255bp的特异扩增带,而非转基因水稻均未出现扩增条带。 Southern实验证实,Xa21基因在转基因植株中为单拷贝整合。Xa21基因转录水平在 水稻叶片中最高,种子次之,根、茎最低。 @@6外源蛋白在模拟胃肠环境中稳定性评价体系的建立大豆胰蛋白酶抑制剂和牛 乳β-乳球蛋白对模拟胃液有很强的抵抗力,60min完全不降解,可作为阳性对照品; 花生血凝素在模拟胃液中8min后降解,有一定抵抗力,可作为对模拟胃液有一定抵 抗力类蛋白的参照;大豆脂肪水解酶、土豆酸性磷酸酶,牛血清白蛋白本身在模拟 胃液中15秒内全部降解,可作为在模拟胃液中不稳定蛋白的参照。外源蛋白在模拟 胃液中的浓度以0.25~0.5mg/ml为宜。 @@7 CpTI蛋白的致敏性研究cpti基因来源于豇豆,其表达的蛋白CpTI与已知致敏 原无连续相同的8个氨基酸序列。与已知致敏原大豆胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列 同源性为11.52%。在模拟胃液中60min稳定存在,与14位过敏患者血清未发现有 免疫结合反应,与3位大豆过敏患者血清亦未发现有免疫结合反应。 @@8 HPr蛋白的致敏性研究hpt基因来源于大肠杆菌,其表达的HPT蛋白有1处连 续9个氨基酸残基中有7个氨基酸残基与已知过敏原相同,与已知致敏原氨基酸序 列相似性为23%。在模拟胃液中15秒内全部降解,但其弥散型降解带30min稳定存 在,其生物活性1min内消失。与14位过敏患者血清未发现有免疫结合反应,与3 位大豆过敏患者血清亦未发现有免疫结合反应。 @@结论 @@1本研究沿用本课题组转基因饲料配制方法,既保证了转基因大米的高暴露量,又 保证了实验动物全面的营养供给,而且每组饲料营养成分一致,使实验结果可比性 更好,可信度更高。 @@2本研究就转Xa21基因大米进行了一系列动物喂养实验,从不同角度对转基因大米 的食用安全性进行了研究,为今后其他转基因食品的食用安全性研究提供了参考。 动物喂养实验包括营养学评价实验、免疫毒理学实验、亚慢性毒性实验和致畸实验, 总体上未发现转Xa21基因大米对实验动物有明显毒副作用。 @@3首次对转Xa21基因水稻中不同组织Xa21 mRNA进行了定量研究,Xa21 mRNA 水平在水稻叶片中最高,种子次之,根、茎最低。为以后研究目的蛋白在不同组织 含量提供依据,为准确评估人群暴露水平打下基础。 @@4本研究建立了模拟胃液/肠液环境体系,根据不同蛋白在模拟胃液/肠液环境中稳定 性不同,找出了评价外源蛋白在模拟胃液/肠液环境中稳定性的阳性参照品和阴性参 照品,为评价其他蛋白质的胃肠稳定性提供依据。 @@5首次对CpTI蛋白的致敏性进行了系统研究。CpTI来源于致敏物种,与已知致敏 原氨基酸序列同源性为11.52%;不被模拟胃液所降解;与过敏患者血清无免疫结合 反应。根据2001年,FAO/WHO生物技术食品致敏性联合专家咨询会议公布的转基 因食品致敏性树状评估策略,现有实验证据不支持CpTI蛋白具有潜在致敏性。 6首次对HPT蛋白的致敏性进行了系统研究。HPT来源于大肠杆菌,与已知致敏原 氨基酸序列相似性为23%;在模拟胃液中不稳定,15s内全部降解,但降解带30min 内存在,其生物活性1min内完全丧失;与过敏患者血清无免疫结合反应。根据2001 年,FAO/WHO生物技术食品致敏性联合专家咨询会议公布的转基因食品致敏性树 状评估策略,现有实验证据不支持HPT蛋白具有潜在致敏性。 @@关键词:转Xa21基因大米(水稻) 食用安全性研究 营养学评价 免疫毒理 亚慢性毒性 致畸实验 模拟胃肠液 霉素磷酸转移酶

致敏性研究 豇豆胰蛋白酶抑制剂 潮

5.期刊论文 韩兰芝.吴孔明.彭于发.郭予元.HAN Lanzhi.WU Kongming.PENG Yufa.GUO Yuyuan 转基因抗虫水稻生 态安全性研究进展 -应用与环境生物学报2006,12(3)
我国转基因抗虫水稻的商业化种植已成为国内外广泛关注的热点问题.本文系统综述了转基因抗虫水稻的遗传转化、基因漂流、靶标害虫的抗性风险 、对非靶标生物和稻田节肢动物群落的影响以及Bt杀虫蛋白在土壤中的残留等方面的研究进展.现有研究表明,Bt水稻对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等 主要靶标害虫具有较高的抗性水平,对稻飞虱、叶蝉、捕食性天敌等非靶标生物的生长发育和稻田节肢动物群落的稳定性无明显影响.靶标害虫的抗性和 转基因水稻与杂草稻、野生稻之间的基因漂移风险是转基因抗虫水稻商业化种植的主要环境安全问题.参60

6.学位论文 姜永厚 转基因抗虫水稻对几种天敌的影响及其机理研究 2004
该文在室内以转Bt基因水稻(KMD1)和转Bt/Sck双价水稻(MSB)两种转基因抗虫水稻——两种水稻主要害虫(二化螟Chilo suppressalis、褐飞虱 Nilaparvata lugens)和一种偶发性害虫(稻眼蝶Mycalesis gotama)——三种主要天敌(二化螟绒茧蜂Apanteles chilonis、尖钩宽黾蝽Microvrlia horvathi和拟水狼蛛Pirata subpiraticus)为研究系统,研究了转基因抗虫水稻经害虫对天敌生物学特性的影响及可能的作用机理,实验结果如下:一、转 Bt基因水稻对二化螟的存活和生长以及二化螟绒茧蜂生物学特性的影响 二、转cry1Ac+sck双价抗虫水稻对二化螟存活和生长以及二化螟绒茧蜂生物学特 性的影响 三、取食转基因抗虫水稻后二化螟幼虫血淋巴中游离氨基酸含量的变化 四、取食转基因抗虫水稻后二化螟幼虫血淋巴糖代谢和蛋白质浓度的 变化 五、取食转基因抗虫水稻后二化螟幼虫中肠蛋白酶活性的变化 六、转Bt基因水稻表达的毒蛋白Cry1Ab在害虫及其捕食者体内的积累动态 七、转 基因抗虫水稻对尖钩宽黾蝽生物学特性的影响 八、转Bt基因水稻对拟水狼蛛生长发育的影响 九、转Bt基因水稻对拟水狼蛛捕食功能反应和猎物选择性 的影响

7.期刊论文 宋晓慧.孙继峰.李春光.曲春艳 水稻转基因育种研究进展 -种子世界2008,""(6)
本文综述了水稻的抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂和品质改良转基因育种研究现状,并且展望了水稻转基因育种的未来.

8.学位论文 郑晔 水稻高效转基因体系的建立及其应用研究 2008
植物转基因技术是获得具有优良性状的转基因作物和植物基因功能研究的重要手段。在过去的二十年,植物转基因技术已有很大的改进,转基因效率 及转化的物种数有了很大的提高。但是,到目前为止,仍有不少植物种或品种不能进行转基因,或转基因效率很低。通过研究,进一步提高植物转基因的效 率,具有重要意义。本研究一方面从农杆菌介导的水稻转化技术着手,探讨了植物中参与农杆菌转化过程的基因在提高水稻转基因效率方面的功效。另一 方面,研究以高效基因干涉技术为基础,对水稻铁营养代谢途径中重要基因进行了抑制表达,明确了该体系在水稻中的基因干涉效果,并初步研究相关基因 的功能。主要实验结果如下: 1.通过在水稻中超表达拟南芥AtH2A1基因来对农杆菌介导的水稻转化技术做出优化,提高了水稻的转化效率。以粳稻日本晴为材料,将带有AtH2A1基 因的超表达载体pTF101.1-H2A1及空白对照pTF101.1分别转到日本晴中,并且对T1代转基因种子进行转化效率分析。发现在超表达AtH2A1基因的T1代转基 因种子诱导的愈伤与空白对照诱导的愈伤相比,侵染效率提高了44%。 2.另一方面,本研究采用Gateway高通量技术,对5个水稻铁营养相关基因构建相应的7个RNAi干涉载体,干涉的基因包括构建了分别针对水稻尼克酰胺 合成酶OsNAS1,OsNAS2,OsNAS3,Fe2+转运体OsIRT1和OsIRT2基因。这些载体转入水稻日本晴野生型和naat1突变体后发现,T1代转基因苗均有不同程度的干 涉效果。其中在OsNAS1,OsNAS2共同干涉载体转入naat1突变体后,naat1突变体的表型回复到了野生型,为明确NAB基因在水稻铁代谢中的作用奠定了基础 。

9.期刊论文 张祥喜.ZHANG Xiang-xi 国内外水稻抗病转基因研究进展 -江西科学2000,18(4)
随着水稻遗传转化技术的发展,通过基因工程手段获得抗病水稻品种成为可能.综述了近年来国内外水稻抗病转基因的技术、方法,对水稻抗病转基因 在水稻育种上的应用也作了评价.

10.学位论文 毛双林 水稻高效转基因体系的建立及抗病、抗逆性的改良 2002
水稻转基因技术已得到很大的发展,但是转化率低、外源基因整合位点随机、外源基因表达低效和不稳定等问题依然存在.进一步提高水稻转基因效 率并建立规模化的转基因技术体系是获得高效表达转基因植株的基础.我们提出以转基因模式材料为中介建立“外源基因种质库”,再通过杂交转育并辅 以分子标记辅助选择,将外源基因导入待改良的品种.这样既可以克服基因型的障碍,又便于规模化操作,有利于提高水稻转基因育种的效率.为达到这一目 的.该研究以24个籼型恢复系和保持系作为研究对象,以外植体诱导愈伤组织的能力、抗性愈伤组织的发生率以及出苗率来评价参试试转化效率,筛选出具 有较高转化效率的材料,为建立高效的水稻转基因技术体系奠定基础.

引证文献(1条) 1.王东.宋君.雷绍荣.刘勇 SYBR Green I实时PCR检测转Cry1Ab/c基因水稻[期刊论文]-中国测试 2009(3)

本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zglyxb200806044.aspx 授权使用:贵州大学(guizdx),授权号:096d6528-052d-4824-8d22-9e1801679fb5 下载时间:2010年10月23日


相关文章:
PCR技术在转基因水稻检测中的应用
中的应用仲恺农业工程学院 生命科学学院 摘要:采用PCR技术检测启动子、终止子、Bt基因,判断水稻样品中是否含转基因成分,建立了稳定快速的转基因水稻定性PCR检测体系。...
2009年9月证券考试证券市场基础知识预测试题
转基因水稻定性 PCR 检测体系的建立[J].中国粮 油学报, 2008, 23 (6) ...通过对被导入基因水稻 DNA 的提取分离,进行 PCR 切入 遗传序列的扩增,然后电泳...
转基因水稻多重PCR和Real—time PCR定性检测中的问题与策略
龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 转基因水稻多重 PCR 和 Real—time PCR 定 性检测中的问题与策略 作者:仇娟 来源:《湖北农业科学》2015 年第 02 期...
转基因水稻多重PCR和REAL―TIME PCR定性检测中的问题与策略
转基因水稻多重PCR和REAL―TIME PCR定性检测中的问题与策略_思想汇报/心得体会_党团工作_实用文档。转基因水稻多重PCR和REAL―TIME PCR定性检测中的问题与策略 ...
生物计量复习资料
转基因水稻定性 PCR 检测流程如下: 水稻基因组 DNA 的提取和纯化 PCR 扩增...国家计量体系包括量值传递和量值溯源体系 22、生物计量研究对象:核酸、蛋白、微...
2.石家庄市2015届高三复习第二次质量检测(二)
(4)检测培育转基因水稻的目的是否达到,需要检测转基因水稻 。 (5)理论上,基因组文库含有的生物基因数量 (大于、等于、小于)cDNA 文库中含有的生 物基因数量。 ...
转基因玉米PCR检测开题报告
植物基因组 DNA 的提取 3.引物设计、筛选和优化 4.复合 PCR 体系优化 5....等. 转基因水稻“科丰 6 号"实时荧光 PCR 定性定量检测方法研究[J].生 物...
转基因大豆检测技术研究进展
因作物只有棉花,转基因水稻的安全评价已经进入到了...转基 因大豆进行检测比较发现,SDS–PAGE和PCR检测...玉米和水稻深加工产品定性检测的S重巢式PCR检测方法...
转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测
迄今为止,还没有快速、高通量同时检测不同品种和不同品系的转基 因大豆、玉米和水稻外源基因的报道。本研究旨在建立五重巢式 PCR 体系,探索粮食深加工产品中的...
转基因水稻讲义
转基因水稻讲义_生物学_自然科学_专业资料。学生课题...与 Southern 分析相比,PCR 检测 DNA 用量少,操作...而湖南师大硕士把实验结论定性为“基本上是安全的”...
更多相关标签:
pcr反应体系 | pcr体系 | 25ul pcr反应体系 | pcr扩增体系 | 50ul pcr反应体系 | 20微升pcr体系 | pcr体系引物浓度 | 荧光定量pcr反应体系 |