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葡萄糖转运载体测定方法


一.刷状缘膜囊的制备:(方法参照 Kessler(1978),Shirazi-Beechey(1991)和 Bauer (2001b)修正) 所有操作过程需在冰上或者 4℃下进行。将冷冻样品进行称重,并在冷烧杯中用 缓冲剂(100mM 甘露醇,2mM HEPES/Tris 缓冲剂,pH7.1)解冻。解冻后,在冷的 有盖培养皿中用剪刀和镊子将组织样剪为 1cm 小块,将小块组织样重

放入冷烧杯,然 后将组织块悬液振动 2 次(设定为 No.80),每次一分钟。用布氏漏斗过滤振动后溶液, 溶液转入 250mL 量筒,记录滤液体积后转移至 400mL 烧杯中。将烧杯放置冰上,搅 拌溶液。制作多个平行样以备进一步分析,这些处理后样品为匀浆液。已知浓度的氯 化镁溶液加入到匀浆液中以达到 10mM 的终浓度,温和搅拌溶液 20 分钟,然后进行两 种离心:5min,3000*g;30min,30000*g。利用 20-G 型检测针对剩余的颗粒进行再 悬浮,缓冲液为 100mM 甘露醇+20mM HEPES/Tris,pH7.5。悬浮颗粒在组织研磨机 (Potter-Elvehjam; Teflon/glass)中均匀搅拌十次后在 30000*g 离心 30min。最终颗 粒用 23-G 型检测针在 500μL 缓冲液中(300mM 甘露醇,0.1mM 硫酸镁,20mM HEPES/Tris,pH7.5)再次悬浮。悬浮颗粒(囊泡)由反复流过 27-G 型检测针 10 次的 溶液制备均匀,避免出现气泡。将试样等分入冷冻管后-80℃保存。 二.检测 利用 BSA(牛血清白蛋白)作为匀浆蛋白浓度和囊泡浓度的标准。麦芽糖酶是刷状缘 膜富集度的标记酶,Truner 和 Moran(1982)的方法测定麦芽糖酶活,使用 25mM 磷 酸盐缓冲液(pH6.3)和 30mM 麦芽糖。释放的葡萄糖通过 COBAS FaraⅡ(全自动生 化仪)(Roche, Montclair,NJ)测定麦芽糖酶活表达为μmol product/min*mg of protein。囊泡中麦芽糖酶活的富集(enrichment)表示为囊泡麦芽糖酶活/匀浆麦芽糖 酶活。 37℃下将 5μL(50μg of protein)的小囊泡置于预热的微量离心管中,预热的培 养 基 中 包 含 100mM 硫 氰 酸 钠 或 硫 氰 酸 钾 、 99.8mM 甘 露 醇 、 20mM HEPES/Tris (pH7.5),再加入 200μM 葡萄糖(1.0μCi【U-14C】-D-glucose)。加入 1mL 冰冻终 止溶液(150mL 氯化钠,250μM 根皮苷)3s 后葡萄糖吸收被终止。移取 0.9mL 上述 溶液,迅速通过 0.45μm 圆形纤维素薄膜。整个薄膜用终止溶液(5*1mL)清洗。将 薄膜置于 20mL 闪烁计数瓶中,瓶中加入 12mL scintillation cocktail(Scintisafe Plus 50%LSC Cocktail)。样品通过 Quantasmart 软件用于放射性测定(闪仪 Tri-Carb 2900TR/SL)。在 Na+和 K+存在的前提下,葡萄糖吸收的测定重复五次。钠依赖性葡 萄糖的吸收通过硫氰酸钠孵化值减去硫氰酸钾孵化值得到。 三.免疫印迹
批注 [LK2]: Incubation? 批注 [LK1]: ?enrichment and abundance?

囊泡和匀浆液(40?g 蛋白/道)在 60℃下孵育,然后用 7.5%的 SDSPAGE 分离。 蛋白通过电转移至 0.45?m 的硝化纤维膜上,用固绿染色法(固绿染色液)使其显现 出来(Fisher Scientific, Pittsburgh,PA)。为了指示刷状缘膜的纯度,连续用探针检 测 SGLT1,GLUT2 和碱性磷酸酶。薄膜在封闭溶液中(2.3%康乃馨脱脂奶粉溶于 30mM Tris 碱,300mM NaCl,0.1%(vol/vol)吐温 20,pH7.5)封闭 1.5h。将薄 膜置于迷你转迹机中,每个样品道的封闭液中放置 50?L 抗-SGLT1 抗体(兔抗兔 SGLT1;1:325 稀释度;100?g/?L 初始浓度),然后在摇床中室温杂交 1h(摇 床)。将薄膜浸在含有 150?L 封闭液迷你转迹机中,再将薄膜从迷你转迹机中取出, 在封闭液中继续浸泡 5min。辣根过氧化物酶共轭二抗(驴抗兔免疫球蛋白;1:5000 稀释度)作用于每个薄膜样品各 1h。将薄膜在封闭液中浸泡 5 次,每次 5min,再在 TBS/Tween20(30mM Tris base,300mM Nacl,0.1%【vol/vol】Tween20, pH7.5)中浸泡 10 分钟。对薄膜轻轻点样以除去多余水分,发光底物也通过 blotted 处理 5 分钟。薄膜轻轻 blotted,包在塑料包中,进行曝光,洗照片。准备下一个探 针时 , 将 薄 膜 在 60 ℃ 溶 液 中 进 行 水 浴 分 带 ( 69mM SDS , 62mM Tris Base , 7.8?L/mL β-巯基乙醇)。在探测 GLUT2 之前,需将样品在封闭液中封闭 2h(2.5% 康乃馨脱脂牛奶混于 30mM Tris Base,150mM Nacl,pH7.5)。薄膜在含有 50?L anti-GLUT2 抗体(兔抗鼠 GLUT2;1:165 稀释度;100?g/?L 初始浓度)的样品道中 杂交 1.5h。杂交完成后,每个薄膜浸泡于迷你转迹机中的 240mL 封闭液中。从迷你 转迹机中取出后,薄膜在封闭液中浸泡 3 次,每次 5 分钟。辣根过氧化物酶共轭二抗 (驴抗兔免疫球蛋白;1:5000 稀释度)作用于每个样品各 1.2h。剩余的清洗液和化学 发光显影部分和 SGLT1 探测处理方法一样。显影后,将薄膜再次分条带。 探测碱性磷酸酶前将样品在封闭液中(2.0%脱脂牛奶混于 10mM Tris Base, 200mM Nacl,pH7.5)孵育 1.5h。在不同管中薄膜与碱性磷酸酶抗体(小牛抗兔碱 性磷酸酶,calf antirabbit;1:10000;10mg/mL 初始浓度)杂交 1h。杂交后,将薄 膜在封闭液中浸泡 5 次,每次 5min。辣根过氧化物酶共轭二抗(驴抗兔免疫球蛋白; 1:5000 稀释度)作用于每个样品各 1h。剩余的清洗液和化学发光显影处理同 SGLT1 探测相同。 四.相关蛋白丰度及分子大小的测定: 扫描放射自显影的数字成像,并利用 UN-SCANIT 软件程序对光密度进行扫描和评 估(方法参照 Swanson,2000)。光密度值作为任意单位被报道,并用信号值减去放 射自显影照片的一个平均背景值作为实际值。用每段肠道的匀浆信号值减去囊泡信号 值,就可以得到 SGLT1,GLUT2 和碱性磷酸酶的富集值。通过利用十二指肠的光密度 值减去各个肠段的光密度值,把用于评估整个肠道 SGLT1 丰度的光密度值标准化至十 二指肠样品。SGLT1 和 GLUT2 的表观位移权重通过对移动距离和已知 Marker 的位移 进行回归得到,范围为 184.5-9.1kDa(用标准点预染的蛋白梯)。
批注 [LK3]: ?How?

五.数据分析 囊泡和匀浆麦芽糖酶活性,麦芽糖酶丰度,SGLT1 丰度,葡萄糖吸收值通过利用 SAS 的 GLM 程序进行裂区设计得到。整体设计模型是 block(嵌段)和 treatment(处 理),整个设计的误差是 block×treatment。裂区模型包括肠段和处理×肠段,用残差 平方和作为误差。将肠道样品位置的一次和二次效应进行对照。肠道长度和重量通过 嵌段和处理模型进行分析,模型用残差作为误差值。 SC-9117;SC-2317,wanghcang@126.com

闪烁计数瓶:
液体闪烁计数所用的闪烁体是液态,即将闪烁体溶解在适当的溶液中,配 制成为闪烁液,并将待测放射性物质放在闪烁液中进行测量。应用液体闪烁计 数可达到 4π 立体角的优越几何测量条件,而且源的自吸收也可以忽略,对于 能量低,射程短、易被空气和其它物质吸收的 α 射线和低能 β 射线(如 3H 和 14C),有较高的探测效率,液体闪烁计数器是 α 射线和低能 β 射线的首选测 量仪器。 1.探测机理 闪烁液产生光子的过程是,从放射源发出的射线能理,首先被溶剂分子吸 收,使溶剂分子激发。这种激发能量在溶剂内传播时,即传递给闪烁体(溶 质),引起闪烁体分子的激发,当闪烁体分子回到基态时就发射出光子,该光 子透过透明的闪闪烁液及样品的瓶壁,被光电倍增管的光阴极接收,继而产生 光电子并通过光电倍增管的倍增管的位增极放大,然后被阳极接收形成电脉 冲,完成了放射能→光能→电能的转换。 2.闪烁液 液体闪烁计数系统作用的闪烁溶液,是指闪烁瓶中除放射性被测样品之外 的其它组分,主要是有机溶剂和溶质(闪烁体),有时为了样品的制备或提高 计数效率的需要,还加入其它添加剂。 ⑴溶剂:从 β 源放射 β 射线到发射能被 肖阴极接收的光妇的这一系列能量转移环节中,能量转移效率是很低的,只有 少部分放射能量被利用来发射光子,其中放射源与溶剂之间,能量转移效率大 约为 5 ̄10%。对溶剂的选择,主要视其对闪烁体的溶介度和将放射能转移给 闪烁体的效率而定。如果以一定浓度的闪烁体在甲苯溶液中产生的脉冲高度为 100%,那么,凡能产生 80%以上的脉冲高度的都定为溶剂,能使脉冲高度随 其浓度上升而逐渐减小的称为稀释液,而在浓度很低时就能引起脉冲高度显著 下降的叫淬灭剂。在液体闪烁计数系统中,一个好的溶剂应满足下列条件:① 对闪烁体的溶介度高;②对放射源的转移效率高;③对闪烁发射的光子透明度 高;④在无论有无助溶剂的帮助下都可以溶介放射性样品;⑤在计数器的工作

温度下来结冰;⑥能够形成均相的测量溶液。一般认为,烷基苯是最好的溶 剂,如甲苯,二甲苯。此外,苯甲醚也是比较好的溶剂。另外,对于含水量较 多的样品,采用 1,4-二氧不作为溶剂,因为该有机化合物的极性较大,既能 很好地溶介闪烁体又可溶介含水量较多的样品,能改善计数效率,缺点是价格 昂贵,冰点高,久放后产生淬灭作用很强的过氧化物,必须经纯化才能使用, 并应加入 0.001%的二乙基二硫代氨基甲酸钠或丁基氢氧基甲苯(BHT), 以抑制纯化的二氧六环变质。溶剂在闪烁溶液中约占 99%,因此,它的纯 度对闪烁液的品质是很大的影响因素。溶剂中不发光的杂质、氧和水的含量多 少,都关系到淬灭程度。原则上讲,溶剂应具有闪烁纯,即不含或很少含有影 响闪烁计数的淬灭成分。实际证明,“分析纯”试剂可以不经纯化而直接使用。 ⑵闪烁液:在液体闪烁计数系统中,闪烁体又称荧光体,是闪烁液的溶 质,它的很多,根据其荧光特性及作用,可分为两类,即第一闪烁和第二闪烁 体。 ①第一闪烁体:(初级闪烁体):常用的第一闪烁体:对联三苯(TP): 化学结构 它是最早使用的闪烁体之一。它的计数率高,价格比较便宜,但是, 在低温或含水溶液介度不高。2,5-二苯恶唑(PPO):化学结构 它是目前普 遍使用的闪烁体,能很好地溶介在常用的溶剂中,在含水的情况下也是如此, 在甲苯中的溶介度达 200 克/升以上。它的化学性质稳定,价格也较便宜。但 是,它的最大缺点是有明显的浓度淬灭(自身淬灭),即随着 PPO 在溶剂中的 浓度升高,计数效率下降。2-苯基-5-(4-二苯基)-1,3,4 恶唑(PBD): 化学结构为 它是已知的最有效的闪烁体之一。比 PPO 能耐受浓度淬灭,但 是,它的溶介度低,尤其是在低温和含水样品存在时,溶介度下降更快,而且 用量比 PPO 多两倍,价格昂贵。2-(4-t-丁基苯基)-5-(4-二苯基)-1,3,4,恶 二唑(丁基-PBD):化学结构为 它的溶介度比 PBD 高,其最大优点对化学 淬灭和颜色淬灭不敏感,因此,可以获得较高的计数效率。 ②第二闪烁体(次 级闪烁体):第二闪烁体的主要功能是吸收第一闪烁体发射的光子后,再在较 长的波段上重新发射出荧光来,并能增加光子的产额。在高浓度下第二闪烁体 起着一部分与第一闪烁体相同的作用(即接受激发溶剂分子的的退激能量,并 发出荧光),此外,它还能与淬灭因子竞争,从而减少了第一闪烁被淬灭的程 度。在下列一种或一种以上的情况下,必须在闪烁液中加入第二闪烁体:a. 样 品中含有直接淬灭第一闪烁体的化合物;b. 第一闪烁体浓度太高而引起强烈的 自身淬灭,且发射的光谱范围与光电倍增管光阴及不匹配;c. 计数器的光电倍 增管光阴极对于较长波长的光谱响应比较好;d. 测量的样品在近紫外区有明显 的吸收。 常用的第二闪烁体有:1,4,双 2(5 苯基恶唑)苯(POPOP)它的溶介度 小,在甲苯系统为 1.2 克/升,在二氧六环中为 1.5 克/升。溶介速度慢,通 常需加热促其溶介,它是目前普遍使用的第二闪烁体。1,4 双 2(4-甲基-5- 苯基恶唑基)-苯(DMPOPOP):它的溶介度比 POPOP 大,在甲苯系列内为

2.3 克/升,在二氧六环内是 0.8 克/升,溶介速度也快,但没有 POPOP 的计 数效率高,且需要较高的使用浓度。 此外,还有对-双(0-甲基苯乙稀基) 苯,(双-MSB)和 2-(4'-二联苯基)-6-苯基苯并恶唑(PBBO),几种常 用的初级闪烁体的荧光波长在 3460-3800 埃之间,而 Cs-sb 型光阴极的最大 光谱响应波长为 4000 埃左右。因此,对于 Cs-Sb 材料的光阴极,仅用初级闪 烁体不能很好地进行能量转移,计数效率很低,加入次级闪烁体后发射光谱波 长增加到 4180-4300 埃,使其与 Cs-Sb 型光阴的光谱响应得到改善,能量转 移较好,计数效率提高。Cs-K-Sb 型是双碱型光电倍增管,它的最大光谱响应 波长比 Cs-Sb 型短。因此,不用次级闪烁体也可以有较好的计数效率。但是, 考虑到次级体和其它功用,通常在实际工作中,往往都要使用次级闪烁体。 闪烁液中除了溶剂,闪烁体之外,有时还添加一些其它成分。为了增加闪 烁液对含水样品的溶解能力,需加入助溶剂;为了改善计数效率,则加入抗淬 灭剂。甲苯、二甲苯等有机溶剂极性很小,对水的溶介能力较差。当样品含水 较多时,即使样品体积不大,也很难和甲苯中二甲苯互溶为透明的均相学府。 有时样品的含水量虽然不大,但它的放射性水平很低,为了在较短的测量时间 获得符合统计误差要求的计数往往需要增加样品的体积,这就等于增加了含水 量,这样的样品也不能很好地和甲苯或二甲苯互溶,为此,要加入一定量的极 性较大的有机溶剂,如甲醇,乙醇,乙二醇乙醚等,这些溶剂在非极性溶剂和 水分子之间起着桥梁作用,既能和甲苯、二甲苯互溶,又能和水互溶,达到增 加含水样品在闪烁液内的溶解度的目的,所以称之为助溶剂。\par 助溶剂的淬 灭作用较大要限制其用量,因而,可容纳的含水量也是有限的。其中乙二醇乙 醚的极性大且学淬灭作用小,是常用的助溶剂。抗淬灭剂通常用在对含水量很 大的样品测量或采用二氧六环作溶剂时,因为这种闪烁液淬灭作用大,为改善 计数效率,加入抗淬灭剂萘是十分重要的。萘也是一种荧光物质,它可以抵消 一部分淬灭作用,但是萘不能和对联三苯合用,尤其是在甲苯、二甲苯溶剂 中,否则计数效率很低。液体闪烁计数器中,闪烁液的最佳体积可以在一定范 围内有所变化,吸要能获得较高的计数效率,就应该采用较少的体积,尤其对 于 3H 样品来说,较小体积的闪烁液还可以减少本底计数(大约 0.5cpm/ml 闪 烁液),减少样品的自吸收。如果当样品中含有淬灭剂成分时,增加闪烁液的 体积,可以经稀释作用来减少淬灭。 3.探测装置 在液体闪烁计数中引用非常灵敏的光电倍增管,对于探测穿透力低的 α 射 线和低能量的 β 射线(如 3H,14C 等)是极为重要的。使用一个光电倍增管 的单光电倍增管液体闪烁计数器,由于电倍增管的热噪声及样品受光照射后发 出的磷光,会有较高的本底计数,探测效率也较低。使用两个性能指标大致相 同的光电倍增管,并和符合电路相连接,做成双管符合型液体闪烁计数器,符 合电路只能通过由两只倍增管同时产生的信号,因而只有当两只光电倍增管在 符合电路分辩时间内同时观察到的信号才被记录下来,而由热噪声或磷光产生

的随机脉冲则被扣除掉,有效地降低仪器本底,提高了探测效率,系统探测效 率可在 50%以上。在液体闪烁计数系统中,光电倍增管阳极形成脉冲电压的大 小,与阳极一次收集的电子数成线性关系。在光电倍增管放大倍数不变的情况 下(取决于高压的稳定性),光阴极产生的光电子越多,最后到达阳极的电子 数也越多,而光电子数取决于光子数。在正常情况下,闪烁剂分子释放的光子 数与放射性同位素衰变时产生的 β 射线能量成正比关系。由于放射能在传递和 能量转换途中,或多或少地要发生能量消耗,因此,放射能和发射的光子数之 间近似地成线性关系。这说明液体闪烁计能够作能谱研究,以分析不同能量的 放射性同位素,达到定性目的。例如,3H、14C 双标记样品,可通过双道液体闪烁计数器同时测定。阳极在单位时间内产 生脉冲电压的数量,与闪烁瓶内放射性同位素的多少以及同位素衰变率成线性 关系,与样品内的放射性强度成正比,这是液体闪烁测量的定量基础。例如, 在知道液体闪烁计数器探测效率的前提下,通过对某种放射性样品进行测定, 可以求得该样品中的放射性强度为多少微居里或多少贝柯勒尔。 4.双标记同位素测量的应用 液体闪烁计数器特点之一是能作双同位素分析,配备两个或三个以上独 立的脉冲高度分析器的多道装置,并具有脉冲相加和线性门装置,在每种同位 素的最佳计数条件下同时测量它们,就能区分发射不同能量的同位素,假定有 一个含有 3H 和 14C 的样品,我们将仪器中脉冲高度分析器多道装置中的道 1 调 3H 的平衡点(最佳工作条件),道 2 调在 14c 的平衡点。3H 和 14C 标准 样品溶解的在同样的溶剂中,并采用与实验样品相同的闪烁体,首先测量空白 样品,然后对实验样品和标准样品进行计数 。 为了使双标记测量获得成功,两种放射性同位素的 β 谱必须要有足够的差 异来满足脉冲高度分析所要求的分离。在两种同位素能谱过于接近的情况下, 例如 14C 和 35S,必须首先对它们进行同位素的化学分离,然后再分别计数。 在双标记测量中,较常用的成对同位素有 3H 和 14C、3H 和 35S、3H 和 32P 及 14C 和 32P 等。总之,在双同位素标记的测量中,要满足下述两个条件:第 一,较高能量的同位素尽量能够在不受较低能量同位素干扰的条件下进行计 数;第二,选择一个最佳条件,以对双标记样品中较低能量的同位素能进行计 数。 5.液体闪烁计数样品的制备 流体闪烁测量的榈制备是很重要的操作,操作的成功与否,直接影响到 计数效率。样品制备方法的选择要考虑以下四个因素:⑴所测样品的物理和化 学特性,决定所用闪烁液类型和决定是否需要将样品转化为更适于测量的形 式;⑵样品所含的同位素的种类,对于含 3H 的样品要更加注意;⑶预计的放 射性水平,在样品的放射性强度低时,要求的制备方法比较严格;⑷制备过程

的经济和方便,尤其在样品数量多的更为重要。其一般原则是必须使所制备的 样品的放射性,能在一个短的测量时间达到适当的统计学准度,最关键的是要 求样品制备过程中,尽可能地减少“淬灭”因素。 ⑴均相样品的制备 脂溶性样品可直接加入甲苯、二甲苯系统的闪烁液,含水量小于 3%的样 品,仍应用甲苯、二甲苯系统的闪烁液,但需加入乙醇或甲醇或乙二醇乙醚等 极性溶剂助溶,助溶剂与甲苯的比例通常为 3:7。必需时加抵消部分淬灭作 用,提高计数效率,含水量再大时,最好采用 100 毫升乙二醇乙醚。20 毫升乙 二醇,8 克 PPO,500 毫克 POPOP,150 克萘,最后用二氧六环加到 1 升的闪 烁液配方,此配方容纳水量大,效率好相当高,但需注意二氧六环易形成过氧 化物,会导致化学发光的进行,所以应在避光条件下贮存,或者在贮存期间加 入锌粒或其它抗氧化剂以清除过氧化物。 ⑵非均相样品的制备 ①乳状液计数:表面活化合物 Triton X-100 是广泛应用的乳化剂,其化学 结构式: 它的亲水端吸引水和其它极性分子,疏水端吸引甲苯等非极性分子。 乳状液的物理性能随着水分的增加而改变。当甲苯闪烁液与 Triton X-100 按 2:1(v/v)组成的配方时,样品水分在 15%以下的乳状液是透明的;随着水 分的增加,就会出现两个不同的相,分相的乳状液不稳定,不能用于测量;水 分继续增加,就形成稳定的乳状液,此时液体是透明的或不透明的。乳状液的 分相与温度有关,在温度由 17℃开始下降时,计数效率线性地增加约 10%, 到 4-0℃之间为最大值,温度再低,计数效率不再增加,通常把乳状液首先加 热到 40℃,然后在无振荡的情况下冷却,在 4℃保持 2-4 小时。溶质在有机 相和水相之间的不同分布是决定乳状测量计数效率的关键,乳状液测量的效率 有时会比均相测量更高,这是因为淬灭物质主要保留在水相中而不影响在有机 相中发生的能量转移过程。在均相溶液中,系统中所有的成人的成份都密切地 相互接触,所以任何一个淬灭作用都能表现出来。 ②悬浮液测量:对于在甲苯等为基础的闪烁液中溶解度极低的无机盐等样 品,可采用凝胶技术成悬浮测量液。样品经初步处理后,制成相同大小的颗 粒,然后在含有凝胶剂的系统中做成悬浮液。对于悬浮液测量,下列要求是必 须的:①固体物质要很好地粉碎,并要求是白色或无色的均匀粉状颗粒,以避 免光的吸收;②要求样品确实不溶于闪烁液,否则溶解的与不溶解的部分有不 同的计数效率,造成计数不稳定,结果不易重复。悬浮液测量的优点是样品不 溶解在溶剂中,所以样品淬灭极小。在悬浮测量中作为聚胶剂 的物质有硬脂酸 铝、蓖麻油的衍生物(thixin) 及二氧化硅的细颗粒(Cab-o-sil)。含 3.5 ̄4.0% Cab-o-sil 的悬浮液,要 以得到很高计数效率,Cab-o-sil 还可以减少计数瓶壁对放射性吸附作用,一般

制样时,往往先加 Cab-o-sil,再加入放射性样品,使放射性更多地吸附在悬浮 颗粒上而提高计数效率。悬浮液测量法除应用于固体无机盐的测定外,也可用 于水溶液和组织匀浆,还可用来测量薄层层析的放射性,应用时只要将层析物 粉碎,简单地与凝胶混合即可,如果待测物能部分地从层析支持物上被洗脱而 溶于闪烁液,则此法不可使用。 ③支持物测量:与悬浮液测量相似,凡不溶于闪烁液的样品,可将它放置 在支持物上再浸入闪烁液中进行计数。支持物的种类很多,如纸条、滤纸、玻 璃纤维滤纸及醋酸纤维素膜片等。支持物在计数瓶内的位置对计数有直接影 响,通常都采用平放瓶底测量,且膜片不超出闪烁液面,保持支持物和测量杯 的干燥,都能获得较高的计数效率和测量重复性。支持物测量除淬灭作用小 外,还有一个突出的优越性,即一次测量可以党纲较多的样品。因在同一测量 瓶内,随膜片叠加数目的增加(10 片之内),计数率线性增加而计数效率保持 不变,这对于放射性水平低的含水样品测量非常适用。\par 在上述几种支持物 中,以醋酸纤维素薄膜、玻璃纤维滤纸的效果优于普通滤纸,因为普通滤纸对 光子传播几乎是不透明的,所以计数效率很低。 6.液体闪烁计数中的淬灭作用 放射能量在测量瓶内的传递和转换过程越顺利,测量效率越高。但事实 上,影响能量传递过程顺序进行的因素很多,它的每一环节都存在着对能量的 争夺过程,使得放射能减少,甚至发生能量传递的中断,导致测量效率下降, 这种现象称为液体闪烁计数的淬灭。造成淬灭的因素很多,按淬灭性质归纳起 来,有下列三种类型。 ⑴化学淬灭 化学淬灭的产生,是由于被放射能激发的少量溶剂分子在分子运动中,与 非激发的杂质、溶剂、溶质分子碰撞而将激发能发热能形式消耗。化学淬灭的 严重程度取决于淬灭物质的化学结构和浓度。化学淬灭与淬灭物浓度的关系是 淬灭物质的浓度越大,淬灭作用越严重。例如,氧和水都是强淬灭剂,在常温 压下,闪烁液都能溶介空气中的氧,当氧的溶解量达到 2×10-3M 时,淬灭作用 比无氧情况下大 20%,而且闪烁液中的含水量(来自含水样品和溶剂中的少量 水分以及其它的添加剂)在可能的条件下,应越少越好,闪烁液不能放在冰箱 中。 ⑵颜色淬灭 由于颜色对光量子的吸收作用,使得带颜色的闪烁液削弱了光子的亮度, 也缩短了光量子的自由程,导致到达光阴极的光子数减少,造成计数效率下 降。不同的颜色,淬灭作用程度不同,闪烁液荧光波长接近于紫外光,所以, 颜色淬灭程度的顺序为:兰色〉黄色〉红色。一些生物样品,如血、尿等在制 样过程中,要进行脱色处理,如果支持物测量中,滤膜干燥时被烤黄,也会造 成计数效率的严重下降。

⑶光子淬灭(又称局部淬灭) 在非均相测量中,由于样品本身的自吸收而使 β 射线能量在没有传递给溶 剂分子之前就消耗掉了,这种淬灭在均相测定中,因样品处理不好,也会发 生,谓之光子淬灭。 前已述及,不同能量的放射性核素,在液体闪烁计数时, 闪烁体给出的光子数不同,产生的电脉冲高度亦不同。如果由接近平均能量的 14C1 的 β 粒子产生 400 个光子,在一个符合型液体闪烁器中,每个光电倍管 将接收 200 个光子,又因为光电倍增管的最子效率大约是 25%,因此 200 个 光子打到光阴极上产生大约 50 个光子,而淬灭作用使得到达光阴极光子数减 少,这种减少只要能让每次衰变记录下来,否则就被计数器漏记,因此,将这 些考虑应用到能量较低的 3H 时,如果按平均能量(0.018MeV)计算,3H 的 β 粒子在甲苯闪烁液中,大约产生 40 个光子,按 25%的量子效率计算,则每 个光电倍增管光阴极大约产生 5 个光子,与 14C 相比,光电子产额为 1:10,所 以,在 3H 测定中,中等程度的淬灭就会产生不能挽回的计数损失。
固绿 固绿是酸性染料,能溶于水(溶解度为 4%)和酒精(溶解度为 9%)。固绿是一种染含有浆质 的纤维素细胞组织的染色剂,在染细胞和植物组织上应用极广。他和苏木精、番红并列为植物组织 学上三中最常用的染料。 配方:(1)固绿酒精液 固绿 1 g; 95%酒精 100 ml 配方 (2)苯胺固绿 苯胺固绿酒精液 固绿 1 g, 95%酒精 40 ml,苯胺 10 ml 苯胺固绿 配后充分摇匀,过滤后使用。


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葡萄糖转运体
葡萄糖转运葡萄糖转运体是一类镶嵌在细胞膜上转运葡萄糖的载体蛋白质,它广泛分布 于体内各种组织。根据转运葡萄糖的方式分为两类:一类是钠依赖的葡萄糖 转运体...
生化作业答案
基因的启动子,启动报道 基因在酵母细胞内的表达,如果检测到报道基因的表达产物,...激活靶细胞细胞膜载体蛋白,使血液中的葡萄糖转运到细胞中;络氨酸磷酸 化受体与...
湖南省长郡中学2017届高三8月单元检测生物试卷
图中产生[H]的场所都是线粒体 C.用 O 标记葡萄糖,则产物水中会检测到放射...下列有关载体的叙述,错误的是 A.肝脏细胞膜上葡萄糖的转运载体是蛋白质 B....
血糖实验
题 目 激素对血糖浓度的影响及血糖浓度的测定 系专班学姓 部业级号名 医学...胰岛素降低血糖的机制 1.促进肌、脂肪组织等的细胞膜葡萄糖载体葡萄糖转运入...
高一 生物 检测
细胞膜上葡萄糖转运载体的数量增加,已知这些细胞膜上 的载体转运葡萄糖的过程不...14.回答下列问题 (1) 清晨静脉取血液测定正常人和胰岛 B 细胞分泌功能不足者...
上海市十一校2016届高三生命科学12月联考试题
糖原和淀粉的彻底水解产物都只有葡萄糖 B.糖元、...测定胚芽鞘弯曲的情况(弯曲角 度用α 表示);图 2...(共 90 分) Na 驱动的葡萄糖 同向转运载体 + ...
第九章 糖尿病及其生化检验
①促进肌肉、脂肪等组织的细胞膜葡萄糖载体葡萄糖转运入细胞; ? ②通过增强...作系列血糖浓度测定, 对非妊娠成人,推荐葡萄糖负载量为 75 g,对于小孩,按 1.75...
新余市2014届高三上学期期末质量检测生物试
在 CO2 浓度一定、温度适宜的环境中,测定植物叶片在不同光照条件下 CO2 的吸收...28.(9 分) 已知骨骼肌细胞和脂肪细胞膜上的葡萄糖转运载体转运葡萄糖的过程不...
2015生命活动的调节单元过关检测
2015生命活动的调节单元过关检测_理化生_高中教育_教育专区。包括动植物生命活动...脂肪细胞膜上葡萄糖转运载 体的数量增加,已知这些细胞膜上的载体转运葡萄糖的...
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