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乳酸菌体外抑菌试验报告


当代畜牧

2007 年第 12 期

? 疫病防治 ?

乳 酸 菌 体 外 抑 菌 试 验 报 告
高荣琨
中图分类号: S852. 6 摘要

山西农业大学动物科技学院 ( 太古 030801 )
文献标识码: B 文章编号: 1002- 2996( 2007) 1

2- 0019- 02

对 乳 酸 杆 菌 LL 、 酸 杆 菌 LA 、 酸 链 球 菌 SL 的 抑 菌 特 ( ) 嗜 ( ) 乳 ( )

为 2. 0、 0 、 0、 0 、 0 、 0, 然后进行抑菌试验。 3. 4. 5. 6. 7. ( 3) 将代谢产物分别用过氧化氢酶 0. 5 m m ) 、 g/ L 胃 蛋 白 酶 1 m m ) 、 蛋 白 酶 1 m m ) 在 37℃ 孵 ( ( g/ L 胰 g/ L 育 1 h 进行抑菌试验。

菌 性进行了初步探讨。采用牛津 杯法对 3 株 乳 酸 菌 菌 液 、 体 及 其 代 谢产物进行体外抑菌试验。 结果显示, 3 株乳酸菌的菌液及其代谢产 物具有较强的抑菌活性, 而菌体没有抑菌 活 性 。 代 谢 产 物 热 稳 定 性 较好, 但受 pH 影 响较大。随着 pH 升高, 抑 菌 活 性 逐 渐 降 低 , 在 弱 酸 性、 中性和碱性条件下没有抑菌 活性。代谢 产 物 的 抑 菌 活 性 不 受 过 氧化氢酶、 胃蛋白酶、 胰蛋白酶的影响。

2. 1. 5 2. 2

指示菌菌液的制备 乳酸菌体外抑菌试验

将大肠杆菌和沙门氏

菌各接种于 5 m 营养肉汤中, 37℃培养 20 h 后备用。 L 首先将指示菌培养物 0. 1 m 涂布在平板上, 自 L

关键词

乳酸菌

抑菌活性

体外试验

乳酸菌制剂是应用最早、 最广泛、 种类最多的益 生素之一。乳酸菌是能够分解糖类以产生乳酸为主 要代谢产物的无芽孢革兰氏阳性菌, 厌氧或兼性厌氧 生长, 在 pH3. 0~4. 0 酸性条件下仍能够生长。乳酸 菌属是肠道内的正常微生物菌群, 这一类细菌自然 定植于消化道并能对宿主产生多种有益作用。本试 验采用牛津杯法对乳酸杆菌 LL 、 ( ) 嗜酸杆菌 LA 、 ( ) 乳 酸链球菌 SL 的抑菌特性进行了初步探讨。对 3 株 ( ) 乳酸菌菌液、 菌体及其代谢产物进行体外抑菌试验。

然干燥 30 m n 。然后将牛津杯均匀放置在平板上, i 每个平板放 3 个。最后向其中加满待测液, 37℃ 培 养 12~15 h , 测定抑菌圈直径。每个样品做 3 个重 复, 结果取平均值。



结果



材料
( LB Lur i a Br ot h) 培 养 基 , LL、 培 养 基 , SL 培 LA

3. 1 LL、 、 L 菌液的抑菌结果 LA S 根据试验得知, LL、 、 菌液对大肠杆菌和沙 LA SL 门氏菌都有较强的抑制活性, 结果如表 1 所示。 3. 2 LL、 、 L 代谢产物的抑菌结果 LA S 根 据 试 验 得 知 , LL、 、 的 代 谢 产 物 对 大 肠 SL LA 杆菌和沙门氏菌都有较强的抑制活性, 结果如表 2
所示。
表1
菌种

养基。


2. 1

方法
乳酸菌的制备 乳酸菌菌液的制备 将乳酸菌接种在各自
LL LA SL

LA、 、 L 菌液的抑菌结果 LL S
大肠杆菌 沙门氏菌

m m
21. 36 19. 47 18. 38 21. 49

18. 40 16. 74 13. 59 18. 76

2. 1. 1

的培养基中, 37℃厌氧培养 48 h, 然后进行抑菌试验。

2. 1. 2 乳酸菌代谢产物的制备 取 0. 5 m 活化的乳 L
酸菌接种于 200 m 各自的培养基中, 厌氧培养 72 h, L 然后 4 000 r pm离心, 取上清液经细菌滤器过滤 滤 ( 膜直径为 220 nm , 收集滤液即为乳酸菌代谢产物。 )

LL+LA +SL

表2
菌种

LA、 、 L 乳酸杆菌代谢产物抑菌结果 LL S
大肠杆菌 沙门氏菌

m m

LL LA SL LL+LA +SL

18. 77 16. 80 13. 98 18. 97

21. 48 19. 87 18. 46 21. 76

2. 1. 3

乳酸菌菌体的制备

将上述离心后的沉淀

用生理盐水洗涤 3 次, 然后用生理盐水稀释成原菌 液浓度。

表3
菌种

LA、 、 L 菌体的抑菌结果 LL S
大肠杆菌 沙门氏菌

m m
0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
? 19 ?

2. 1. 4

乳酸菌代谢产物的处理

1) 将代谢产物在 100℃ 下处理 30 m n, 然后进 i
行抑菌试验。 的 aO 、Cl 2) 将代谢产物用 10 M N H H 分别调整 pH

LL LA SL LL+LA +SL

0. 00 0. 00 0. 00 0. 00

? 疫病防治 ?
表4
菌种

当代畜牧
m m

2007 年第 12 期

LA、 、 L 代谢产物 100℃处理后的抑菌结果 LL S
大肠杆菌 试验组 对照组 沙门氏菌 试验组 对照组

竞争消化道黏附位点, 进而竞争营养, 通过生长繁殖 产生代谢产物而抑制病原菌的生长。因而研究者在 选择乳酸菌作为益生菌时, 一般都首先检测其进入 机体后在消化道黏膜的定植能力。

LL LA SL LL+LA +SL

18. 64 16. 70 13. 93 18. 78

18. 79 16. 85 14. 01 19. 00

21. 52 19. 83 18. 52 21. 72

21. 42 19. 92 18. 40 21. 85

2) 从 试 验 可 以 看 出 , LL、 、 的 代 谢 产 物 经 SL LA 100℃ 高温处理 30 m n, 其抑菌活性仍然不变, 这与 i
m m

表5

LA、 、 L 乳酸菌代谢产物酸碱处理的抑制结果 LL S
大肠杆菌 沙门氏菌

丁轲等的报道相符, 说明它是一种热稳定性物 质。 但经酸碱处理后, 其抑菌活性随 pH 的升高而 逐渐降低。当 pH 升高到 6. 0 时, LL、 失去了抑 LA 菌活性, 只有 SL 有微弱的抑菌活性。当 pH 为 7 时, 3 株菌全部丧失抑菌活性。本试验表明, LL, 中性和碱性条件下没有抑菌活 SL, LA 在弱酸性、 性, 说明这 3 株乳酸菌的抑菌活性只有在酸性环 境中才能表现出来。
m m

pH

LL

LA

SL

LL+LA +SL 22. 94 21. 03 18. 07 16. 12 9. 47 0. 00

LL

LA

SL

LL+LA +S L 27. 01 23. 13 21. 42 18. 14 12. 48 0. 00

2. 0 21. 83 21. 57 20. 96 3. 0 20. 14 19. 21 19. 07 4. 0 18. 00 16. 34 17. 24 5. 0 15. 79 13. 23 13. 27 6. 0 7. 0 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 9. 38 0. 00

26. 86 24. 13 24. 95 22. 97 21. 35 21. 04 20. 88 18. 32 19. 49 14. 54 13. 62 17. 96 0. 00 0. 00 0. 00 12. 34 0. 00 0. 00

表6
酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶

LA、 、 L 代谢产物酶处理的抑菌结果 LL S
大肠杆菌 沙门氏菌

3) 本 试 验 用 过 氧 化 氢 酶 处 理 LL、 、 SL LA 的代谢产物后, 其抑菌活性无太大变化。
在试验中, 代谢产物虽经胃蛋白酶、 胰蛋白 酶处理, 抑菌活性同样未变, 说明这些抑菌 成分对胃蛋白酶、 胰蛋白酶不敏感, 它不是 细菌素类物质, 很有可能是类抗生素物质。

LL

LA

SL

LL+LA +SL 18. 73 18. 68 18. 70

LL

LA

SL

LL+LA +SL 21. 18 21. 57 20. 96

18. 64 16. 36 13. 69 17. 93 16. 74 13. 75

21. 29 19. 45 17. 74 19. 96 19. 82 18. 02 20. 57 18. 92 18. 39

过氧化氢酶 17. 86 15. 90 13. 83

3. 3

LL、 L、 菌体抑菌结果 S LA
根 据 试 验 得 知 , LL、 、 菌 体 没 有 抑 菌 活 性 , SL LA

因为乳酸菌细菌素是一种一般只对产生菌同类菌产 生抑菌作用的抑菌活性物质, 且对蛋白酶敏感, 对革 兰氏阳性菌抑菌能力不强。本试验中, LL、 、 的 SL LA 代谢产物对蛋白酶不敏感, 对沙门氏菌有较强的抑 菌活性, 其作用与细菌素的作用不同。以上研究表 明, 本试验中的 LL、 、 的代谢产物中有抑菌活性 SL LA 的成分不是细菌素, 而很有可能是类抗生素。 参考文献
1 2 3 4 5 6
杨景云主编 . 兽医微生态学 . 北京: 中国医学科技出版社, 1997 袁 杰 利 编. 肠 道 菌 群 与 微 生 态 调 节 剂. 大 连 : 大 连 海 事 大 学 出 版 社, 1996 王 霞 , 张 喜 儒 . 双 歧 杆 菌 研 究 进 展 . 中 国 微 生 态 学 杂 志 , 1997, 9

结果如表 3 所示。

3. 4

LL、 L、 代 谢 产 物 经 100℃处 理 30 min 后 S LA
抑菌结果 根据试验得知, LL、 、 的代谢产物经 100℃ 处 LA SL

理 30 m n 后抑菌圈大小几乎未变, 结果如表 4 所示。 i

3. 5

LL、 L、 代谢产物酸碱处理后的抑菌结果 S LA 根据试验得知, 当代谢产物的 pH 为 2. 0 、 0、 3. 4. 0 时, LA、 、 都具有较强的抑菌活性; 当 pH 为 LL SL 6. 0 时, 只有 SL 仍具有微弱的抑菌活性; 在 pH 为 7. 0 时, 均失去了抑菌活性, 结果如表 5 所示。 3. 6 LL、 L、 的代谢产物酶处理的抑菌结果 S LA , 根据试验得知, LL, LA SL 代谢产物经过过氧化
氢酶、 胃蛋白酶、 胰蛋白酶处理后的抑菌活性几乎没 变化, 结果如表 6 所示。

( 2) : 61
杨显光, 徐国云, 蒋寒青 . 双歧杆菌促生长 因 子 的 研 究 . 中 国 微 生 态学杂志, 1996, 8( 6) : 50

A ance B A, Cebr a J J , Beut h J B, et al . Revi ew, Zb 1 , Baky 283: r 431
蔡辉益, 霍启光 . 饲用微生物添加剂研究与 应 用 进 展 . 饲 料 工 业 ,



分析与结论
1) 从 本 试 验 可 知 , LL、 、 的 培 养 液 和 代 谢 LA SL
7 8

1993 H L K, et al . K ean J our nal of A m Sci ence , 1984 , 26: an or ni al 150- 157
周 东 明 , 程 林 春. 益 生 素 中 菌 株 对 温 度 、 值 及 抗 生 素 的 耐 受 性 pH 试验 . 饲料工业, 1995 , 16( 11) : 34- 35

产物对大肠杆菌和沙门氏菌都有较强的抑菌活性, 但单独的乳酸菌菌体都没有抑菌活性, 说明 LL、 、 LA

SL 有 抑 菌 作 用 的 主 要 成 分 存 在 于 其 代 谢 产 物 中 。 Par m 等 1988) 报道, 乳酸菌进入机体后与致病菌 od (
? 20 ?

9 I nooka S.

The ef f ect

of Baci l l us nat t o f eed on HO 2 2

pr oduct i on f r om chi cken s pl een adhevent cel l s . Tohoku A i , 1998 , 38: 17- 20 gr


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