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pH值胁迫下维生素C对大口黑鲈非特异性免疫的影响


《 饲料工业》 2006 年第 27 卷第 20 期 ?

水 产 养 殖

pH 值胁迫下维生素 C 对大口黑鲈非特异性免疫的影响
谢一荣 摘 要 吴锐全 谢 骏 王广军 关胜军 余德光 乌 兰 用不 同 维生 素 C 水平 (添加 量 分别 为 0、 、 000、 000、 000 mg/kg)的 5 种 饲 料 喂 养 50

0 1 2 4

初始体重为 19 g 左右的大口黑鲈 45 d, 每个处理 4 尾, 各处理 3 个重复, 研究 24 h 不同 pH 值胁迫下 结果显示: 在酸性 pH 值 pH 值为 5.5) 胁迫下, 饲料中添加 ( 维生素 C 对大口黑鲈非特异性免疫的影响。 维生素 C 能促进大口黑鲈血清中溶菌酶和超氧化物歧化酶活力, 与对照组相比差异不显著 P>0.05) ; ( 在碱性 pH 值 pH 值为 10.5) 胁迫下, 饲料中添加维生素 C 能显著促进大口黑鲈血清中溶菌酶和超氧 ( 化物歧化酶活力, 且随着饲料中维生素 C 添加水平的提高, 大口黑鲈溶菌酶和超氧化物歧化酶活力显 著上升。试验证明, 维生素 C 作为抗应激增强剂能有效地提高大口黑鲈的非特异性免疫能力, 从而提 高其抗应激能力。 关键词 维生素 C; 大口黑鲈; 抗应激; 非特异性免疫 中图分类号

S965.211
黑鲈 集约 化 健康 养 殖技 术 的 建 立 和 饲 料 配 制 提 供 参 考依据。

环境 胁迫 (environmental stress)是 指环 境 对 鱼 类 所处的生存状态产生的压力, 可以分为急性环境胁迫 和慢性环境胁迫。 捉捞 (handling)和干扰 (disturbance)等 引起急性环境胁迫, 而水质逐渐恶化和高密度放养等 造成慢性胁迫。由于人类活动范围的扩大、 程度的加 深, 环 境 资源 受到 了 很大 的 破坏 , 环 境 对 鱼 类 引 起 的 胁迫也日益严重。养殖鱼类遭受的环境胁迫主要有: 水 质恶 化 (如含 重 金属 、 溶解 氧、 营 养化 等 )、 低 富 个体 间的相互竞争、 水温大幅度变化以及因养殖密度过高 而造成的拥挤胁迫等。 这些因素对鱼类的胁迫可能是 直接致死的, 而亚致死强度的环境胁迫可使鱼类产生 应激反应 (stress)。这虽然 是 一种 保护 性 反应 , 但 持续 处于应激状态, 机体的特异性和非特异性免疫防御体 系的功能会受到抑制, 导致鱼体对各类病原敏感性的 升高。 所以, 对环境胁迫的研究, 正受到人们的普遍关 注。维生素 C 是一种公认的抗应激因子, 它能够显著 地提高鱼类抗应激能力, 但维生素 C 在大口黑鲈抗应 激方面未见报道。 本试验研究了急性酸碱度胁迫对大 口黑鲈免疫相关酶活力的影响 , 探讨了水体 pH 值变 化对大口黑鲈非特异性免疫机能的影响规律 , 为 大口

1 1.1

材料与方法 饲料配制 试验 在 中 国 水 产 科 学 研 究 院 珠 江 水 产 研 究 所 内

进行。 包膜维生素 C 由维生药业( 石家庄) 有限公司生 产, 维生素 C 含量大于 99%。各饲料原料粉碎后过 40 目筛 , 微量 营 养成 分 采取 逐级 扩 大 法 添 加 , 与 大 原 料 混合 均 匀后 , 再 加水 搅拌 均 匀, 最 后 用 绞 肉 机 制 成 直 径 1.5~ mm、 1.5~ mm 的 软 颗 粒 饲 料 , 放 入 冰 箱 长 2 2 中冷冻备用。 试 验 饲 料 配 方 按 吴 锐 全 等 ( 2004) 报 道 的 大 口 黑 鲈营养指标为依据, 饲料配方组成见表 1。
表1
原料 秘鲁鱼粉 发酵豆粕 国产鱼粉 α 淀粉 - 复合矿物质 鱼油 豆油 复合维生素( 不含 VC) 乌贼膏 维生素 C

试验饲料配方组成 g/kg) (
饲料号 对照组

谢一荣, 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 510380 , 广州市荔湾区西朗。 吴锐全、 骏、 广军、 德光、 兰, 单位及通讯地址同 谢 王 余 乌 第一作者。 关胜军, 广东海洋大学水产学院。 收稿日期: 2006- 08- 07

420 260 100 100 40 40 20 10 10 0

Ⅰ 420 260 100 99.5 40 40 20 10 10 0.5

Ⅱ 420 260 100 99 40 40 20 10 10 1

Ⅲ 420 260 100 98 40 40 20 10 10 2

Ⅳ 420 260 100 96 40 40 20 10 10 4

1.2

试验鱼和饲养条件 大口黑鲈选自广东顺德市省级大口黑鲈良种场。

试 验开 始 前, 先 用 冰鲜 鱼糜 投 喂 , 慢 慢 加 入 配 合 饲 料 对大口黑鲈进行驯化。经过两周的驯化喂养后, 挑选 外观正常、 体质健壮、 每尾体重 19 g 左右的大 口黑 鲈



资 助 项 目 : 广 东 省 科 技 计 划 项 目 2004B20301005) ; 中 国 ( 水产科学院人才基金项目

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水 产 养 殖

谢一荣等: pH 值胁迫下维生素 C 对大口黑鲈非特异性免疫的影响

750 尾作为试验用鱼。将鱼随机分为 5 个组, 每组设 3
个重 复, 每 个 重复 50 尾 , 饲 养 在 网 箱 中 , 网 箱 规 格 为 每天投喂 2 次( 8:30、 2.0 m× m× m。 2.0 2.0 17:00) , 每次按 每周测量一次水质情况, 试验期间 鱼湿重的 3%投喂。 水质状况: 水温 27~ 34.2 ℃、 值 7.2~ 、 pH 8.6 氨氮 <1 mg/l、 亚硝酸氮 <0.1 mg/l、 溶解氧 >3 mg/l。试验周期 45 d。

的大口黑鲈( 鱼体生长情况见表 2) 空胃 1 d, 第 2 d 把 它 们 以每 组 4 尾 , 每 组 3 个 重 复 , 分 别 放 入 已 经 调 制 好试验所需 pH 值的塑料水桶里放置 24 h, 第 2 d 进 行鱼血液样品的取样。早晚各调节 pH 值 1 次, 用浓

HCl 和 NaOH 调节 pH 值至 5.5 和 10.5, 每 13 L 自来
水 加 浓 HCl 1.3 ml、 NaOH 0.75 g。自 来 水 的 pH 值 为

1.3

急性 pH 值胁迫试验 将用不同维生素 C 水平的软颗粒饲料饲养了 45 d
表2
维生素 C 添加量 (mg/kg) 鱼体重 (g) 鱼体长 (cm)

7.2, 池塘水的 pH 值为 7.6。 1.4
血清 溶 菌 酶 活 力 和 超 氧 化 物 歧 化 酶 ( SOD) 活 力

试验鱼体重、 体长
1 000 48.46± ab 4.94 12.97± ab 0.45 2 000 48.87± ab 4.74 12.93± ab 0.42 4 000 50.72± b 2.98 13.13± b 0.34

0 41.59± a 3.56 12.34± a 0.23

500 44.22± ab 2.87 12.68± ab 0.18

注: 同一行数据不同肩标字母表示差异显著( Duncan' s 多重比较, P<0.05 ) 。下表同。

的测定每组中取 12 尾鱼进行尾静脉取血, 并将鱼血 保存于离心管, 4 ℃过夜, 第 2 d 在 4 000 r/min 条件下 离心 10 min 取血清, 用于溶菌酶活力和超氧 化 物歧 化酶活力的测定。 溶菌酶活力采用溶菌酶测定试剂盒 测定; SOD 活力采用 SOD 测定试剂盒测定( 南京建成 生物工程研究所生产) 。

数 据 采 用 SPSS10.0 统 计 软 件 进 行 处 理 分 析 , 利 用方差分析 (AN0VA)来 检验 各 组之 间 的显 著性 , 并 采 用 Duncan's 法进行多重分析, P<0.05 为显著性水平。

2 2.1

结果 酸性 pH 值( pH 值为 5.5) 胁迫下饲料中维生素 C

添加水平对大口黑鲈血清溶菌酶、 SOD 活力变化的影 响( 见表 3)

1.5

数据处理
表3

酸性 pH 值 5.5) 胁迫下大口黑鲈血清溶菌酶、 ( 超氧化物歧化酶 SOD) 活力的变化 (
0 67.75± 2.72 91.08± 6.61 500 85.55± 4.90 99.23± 3.69 1 000 73.41± 7.41 101.69± 4.37 2 000 81.67± 4.25 96.64± 2.80 4 000 111.26± 10.68 117.86± 3.89

VC 添加量 (mg/kg) 溶菌酶活力( μ g/ml ) SOD 活力( U/ml )

从表 3 可以看出, 添加维生素 C 组大口黑鲈的血 清溶菌酶、 SOD 活力比对照组的要高, 但差异不显著。

C 添加水平对大口黑鲈血清溶菌酶、 SOD 活力变化的
影响( 见表 4) 从表 4 可以看出, 对照组大 口 黑 鲈 血 清 溶 菌 酶

2.2

碱性 pH 值( pH 值为 10.5) 胁迫下饲料 中维 生 素
表4

碱性 pH 值 10.5) 胁迫下大口黑鲈血清溶菌酶、 ( 超氧化物歧化酶 SOD) 活力的变化 (
0 45.92± a 6.67 95.66± a 4.50 500 135.08± b 4.37 104.68± a 3.29 1 000 120.29± b 7.61 105.62± ab 5.38 2 000 143.71± bc 9.33 106.02± ab 5.51 4 000 172.89± c 6.78 132.26± b 5.08

VC 添加量 (mg/kg) 溶菌酶活力( μ g/ml ) SOD 活力( U/ml )

活 力 与 添 加 维 生 素 C 组 相 比 差 异 显 著 ( P <0.05 ) , 其 中 4 000 mg/kg VC 添 加 组 与 500、 000 mg/kg VC 1 添加组相比大口黑鲈的血清溶菌酶、 SOD 活力差异显 著( P<0.05) ; 对照组与 4 000 mg/kg 组相 比 大口 黑 鲈 血 清 SOD 活力差异显著( P<0.05) , 但与余下的试验组相 比差异不显著( P>0.05) ; 随着维生素 C 添加量的增加, 大口黑鲈的血清 SOD 活力上升, 添加维生素 C 组大 口黑鲈的血清 SOD 试验组活力比对照组的要高。

鱼体内的 pH 值一般在 7.4 ̄7.8 之间, 水体的 pH 值过低, 会造成鱼类鳃的气体交换和血氧运输障碍、 体内渗透压调节机制失调、 血酸离子调节机制丧失以 及血液酸碱平衡紊乱。 一般来说, 胁迫可引起机体一系列病理变化, 如 组织损伤、 红细胞形态发生变化、 吞噬细胞数量增加、 白细 胞 减少 、 巴系 统病 变 以及 食 欲 下 降 , 鳃 盖 和 尾 淋 柄运动频率增加、 攻击行为减弱、 生长受阻、 生殖力下 降等, 进而影响机体的防御系统。本试验大口黑鲈在



讨论

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谢一荣等: pH 值胁迫下维生素 C 对大口黑鲈非特异性免疫的影响

水 产 养 殖
少虹鳟溶菌酶活性。Sovenyi 等 (1993)将鲤鱼浸泡于含 镉 (5 mg/l)的水体中, 96 h 后发现其肾脏溶菌酶水平不 到对照组鱼的一半。 Roed 等 (1993)得出了相反的结 但 论, 即 胁迫 后 血液 溶 菌酶 水 平 呈 先 降 低 后 升 高 的 趋 势。这些不同的结果提示, 胁迫后鱼体溶菌酶水平变 化的趋向可能受到诸多因素的影响, 如胁迫的类型、 强度以及时间等。所以 ,当比较溶菌酶活性时, 以上因 素就必须考虑进去。本试验结果表明, 饲料中添加维 生素 C 可以提高大口黑鲈抗 pH 值应激的能力。 由表 3 可知, 在酸性 pH 值( pH 值为 5.5) 胁迫下, 试验组大口黑鲈血清 SOD 活力虽然与对照组相比差 异不显著, 但 是随 着维 生 素 C 添 加 量的 升高 , 大 口黑 鲈的血清 SOD 活力呈上升趋势; 由表 4 可知, 在碱 性

受到 pH 值胁迫时出现了体色改变, 身体出现了一些 黑斑, 类似缺氧时出现的症状。经过 24 h 的 pH 值胁 迫 后, 大 口黑 鲈 皮肤 比 较滑 , 可能 是 强 酸 和 强 碱 腐 蚀 后, 体表粘液增多导致的。 鱼类 抵抗 外 来 病 原 入 侵 的 第 一 道 防 线 是 其 广 泛 的非特异性的体液和细胞免疫系统。 水生动物的非特 异性 免疫 机 制包 括 皮肤 、 鳞片 、 壳 和 粘 液 的 屏 障 作 甲 用, 网状内皮系统的吞噬作用以及非特异性体液分子 等, 它 们 对自 然感 染 具有 先 天的 、 选 择 性 的 免 疫 功 无 能, 形成了水生动物体内强大的多功能防御机制。非 特 异性 防 御机 制 在水 生 动物 防 止 感 染 中 扮 演 重 要 角 色, 潜在的非特异性防御机制可以在微生物入侵时发 生 作用, 能 更有 效地 清 除、 解 病 原 微 生 物 和 其 它 有 降 害物质。大量研究表明, 水生动物非特异性免疫系统 在其 自身 抗 病作 用 中较 特 异 性 免 疫 系 统 发 挥 更 大 作 用。溶菌酶即是体液免疫因子之一, 它产生于嗜中性 粒细胞和巨噬细胞, 并被分泌到血液及粘液中发挥溶菌 效应。 SOD 是超氧阴离子自由基 (O )的清除剂, 可保
- 2

pH 值 ( pH 值 为 10.5) 胁 迫 下 , 试 验 组 (4 000 mg/kg)大
口黑鲈血清 SOD 活力和对照组相比差异显著, 但 是 其它试验组与对照组相比差异不显著, 随着维生素 C 增加量的升高, 大口黑鲈的血清 SOD 活力呈上升趋 势。马广智( 2001) 研究了低 pH 值对草鱼鳃和肝组织 中 SOD 活性的影响, 发现低 pH 值在一定程度上刺激 鱼鳃和肝组织的 SOD 活性, 使其活性显著升高。许氏 平鲉处于盐度 5‰~ 10‰水体中 30 d 后, 其血 液 SOD 活力明显升高, 推测是因为长期的高强度低盐胁迫导 致鱼体内产生大量活性氧自由基, 而 SOD 活力升 高 可清除这些活性氧自由基, 从而保护体内细胞免受其 伤害。本试 验 结果 与上 述 结果 类 似, pH 值 为 5.5 时,

护机体细胞免受活性氧自由基的伤害, 是抗氧化防御 系统的关键酶(Parihar, 1997)。 目前, 有众多关于抗氧化 酶系 统可 作 为鱼 体 受污 染程 度 的 敏 感 检 测 指 标 的 报 道 (Ahmad, 2000; Afonso, 1996)。 由表 3 可知, 在酸性 pH 值( pH 值为 5.5) 胁迫下, 试验 组 大口 黑 鲈血 清溶 菌 酶活 力 虽 然 与 对 照 组 相 比 差异不 显著 , 但是 随 着维 生 素 C 添 加量 的 升高 , 大 口 黑鲈的血清溶菌酶活力呈上升趋势; 由表 4 可知, 在 碱性 pH 值( pH 值为 10.5) 胁迫下, 试验组大口黑鲈血 清溶菌酶活力与对照组相比差异显著, 且随着维生素

24 h 后血清 SOD 活性显著 上升 , 并且 随 着维 生 素 C
添加水平的升高而提高。 SOD 活性提高可能是由两个 方面因素引起的: 一方面是低 pH 值胁迫引起; 另一方 面是维生素 C 的刺激作用。一般认为在正常情况下, 体 内 的 SOD 活 性 和 超 氧 阴 离 子 含 量 达 到 一 定 的 平 衡, 低 pH 值或高 pH 值处理时, 体内产生过量的超氧 阴离子, 诱导 SOD 活性提高, 使二者达到一种新的动 态平 衡, 如 果 解除 胁 迫处 理, 机 体 可 能 会 回 复 到 原 来 的平衡状态。但当 pH 值胁迫处理时间过长或 pH 值 过高使氨氮浓度增加, 在双重应激下机体就会产生大 量的活性氧, 如果机体没有足够的 SOD 来清除这些 过多的活性氧, 就会影响机体的正常生理活动, SOD 活性反而降低或丧失。

C 添加量的升高, 大口黑鲈的血清溶菌酶活力呈上升
趋势。表明鱼体在经历了 pH 值胁迫后会产生一种应 激和保护反应, 通过提高其血清溶菌酶活力来增强其 机体免疫力 , 借此维持机体的自身平衡来克服胁 迫 。 普遍 认 为, 鱼 体受 到 急性 胁 迫后 , 常 伴 随 有 血 液 溶 菌 酶水平的升高。 据报道, 在一定条件下, 鱼体血液中的 溶菌酶可能是比皮质醇更可靠的应激信号, 但溶菌酶 水平升高所持续的时间依胁迫的方法和强度而定。 例 如 将 养 殖 在 正 常 海 水 中 的 牙 鲆 放 入 盐 度 20‰~ 40‰ 的水体中, 其血清中溶菌酶含量在盐度改变后先缓慢 升高, 在第 5 d 达到高峰后逐渐降低 (魏然, 2003)。强 度较弱的胁迫, 如 30 min 的捉捞更能使虹鳟 的 溶菌 酶活性得到加强或是抑制; 而高强度的胁 迫, 比 如 2h 的 连 续 运 输 (transportation)或 急 性 水 质 污 染 可 明 显 减

( 参考文献 27 篇, 刊略, 需者可函索) ( 编辑: 孙崎峰, sqf0452@126.com)

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