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荧光定量PCR数据处理方法的探讨


2008年18(3)

生物技术

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No.200610011402.7,2006.

荧光定量PCR数据处理方法的探讨 ~
唐水凯1,贾水义‘


(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室,江苏无锡214081; 2.浙江省淡水水产研究所,浙江湖州313001) 摘要:real time liT—PCR通过直接检测指数扩增期的PCR产物来确定基因的初始模板量,是定量基因表达最灵敏的方法,其 准确性取决于扩增效率以及数据的处理方法。目前最常用的两种分析荧光定量P(R实验数据的方法是绝对定量和相对定量。 绝对定量方法是通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较处理过的样品和未处理过的样品目的基因之间的 表达差异。而相对定量又有双标准曲线法,2“6Q法以及动力学法。该文介绍了这些方法的推导、假设及其应用。 关键词:荧光定量PCR;绝对定量;相对定量


中图分类号:Q333

文献标识码:A}一文章编号:1004—311X(200S)03一0089—03

Method

01'Processir坦Real Time PCR Data
仉扑配Yong—kail。J队Yong—p-“

(1.研‰咄疆y for C,enede‰dir.g al"^qIl妇AfIi础and挪浏hⅡe Biolol田",Nini由y d姆∞‰,Freeing"R蜘∞№ⅢcII‰簟,
dele曲∞in exp蝴删煅ofthe sil咖step.11le删啪beK曲depelld the盥Ille嘲叫蒯∞which qI戚t蚯ve枞眦based.Two盥两approaches l缸d鹏PcR d∞,the妇lute仉relatlve删埘vc me【}10d。a砖eun砌y de删n鹤the cum.Relative a缸ea加fl眦 0f岫target r唧Ib盯,u蛐b,r陀慨the cu舳m删, AJ奴瑚d:Real血∞liT—Pelt
is the

o嘁^蠢镬b呵《FiB呻Seiene目,wl商2141】81;2.乃岣im唱Institute
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∞the PaR efficiency alld

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one

F妇ies。抽l赫l

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in u∞.AbeoIuIe quantification

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PeR si粤lal

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pre鲫l 脚words:real妇憋;absolute删谢饥;relative删洲∞ derivation,唧tion,arld a|班c绷i讲B
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qI阳n1碰ic砒如咀凭lates the PcR si伊1a1 quantitative met】[10cIB include the

transcript in

two

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2—44QⅡ圮吐lod,ld岫etie枷etI-0d.The pI田_po日e of this report is

0f

tIlese舶e|匿础.

自1983年bltillis…构思了PeR(耐岫_lera篇el咂in麟蒯饥) 技术,1985年美国Science杂志酋刊Saikiul等使用PCR方法做 出镰状细胞贫血基因诊断以来,PCR技术已成为生命科学极 有用的研究工具。随着荧光在PeR中的应用以及检测技术的 发展,PE公司发现了利用荧光标记的探针在P(m循环过程中 积累的荧光强度达到仪器检测阈值时,系统的初始模板数量 与循环次数之间有线性关系,从此建立了目前的定量PeR技 术。实时定量PcR是检测基因最灵敏的方法,特别是低丰度

产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系, 通过检测扩增产物很难对原始模板进行准确定量。但在PeR 扩增曲线的指数增长区的某一区域,同样样品扩增产物的荧 光量几乎相等。如果在扩增曲线的指数增区域适当位置设定

荧光检出界限值,即阈值(tllIesh础),就会得到阈值与扩增出线

的交点Q值,ct值是指达到阈值时的扩增循环数(th蒯a
IN;R指数扩增的公式是:R。=风×(1+E)。

ey-

de)。经数学理论证明。Q值与起始模板数的对数值成反比线 性关系。, 其中E,表示扩增效率,n为循环数,R。表示在n个循环 后PeAl产物的数量,凰为原始模板数量。设定PcR到达指数 扩增期时,产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的 总量,即特定的拷贝数K,为常数)高于背景为仪器所识别,此

的基因b。J,比N0m啪印迹、斑点印迹、竞争P(R、半定量PeR
具有准确、敏感、简便、污染率低等特点,在微生物的检测、食 品的检测、病原体的检测、药物疗效考核、转基因研究以及基 因表达研究等方面有重要的应用价值。 实时定量PcR的数据分析方法有两种:绝对定量和相对 定量怕“J。绝对定量一般通过标准曲线来确定我们所感兴趣 基因的拷贝数,相对定量方法则是比较处理过的样品和未处 理过的样品目的基因转录本之间的表达差异。而相对定量又 有双标准曲线法、2。厶6Q法以及动力学法峥。廿】。

时的循环数为c。,也就是K=Ro×(1+层,)。,取对数得:l班=
】g凰+C。×tg(1+E,)。将其转换为: C。=一1/tg(1+E,)×19凰+k聋Vlg(1 4-E,) 对于一特定的t'CR而言,E,与K均为常数,故上式公式 为循环数(C。)对原始模板拷贝数的对数(19冗o)一次方程,其 标准形式为y=b【+b,该直线的斜率为一1,lg(1+E。),在横坐

l绝对定量
PeAt是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,描述PeR 动态进程的曲线即为扩增曲线,它并不是一条标准的指数曲 线,而是S形曲线。因为随着PcR循环数的增加、DNA聚合酶 的失活、西nnP和引物的枯竭以及反应副产物的干扰等原因使 PCR并非一直呈指数扩增,而最终进入平台期,使得PcR扩增
收稿日期:20叮一12一ll;修回日期:2008—01—10

标上的截距为l彬lg(1+E),这就是荧光定量PeR的标准曲
线。

我们将已知浓度的标准品梯度稀释进行rd血圮PcR,就
会按照起始模板量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲 线。再由C。值与起始模板数的对数之间存在的线性关系,就 可以作出标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同,扩增后 也可以得到c值,并将C值代入标准曲线,就可求出未知浓度 样品的起始模板量(图1)【1利。绝对定量分析的标准品选择很 重要,尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。以DNA为

基金项目:江苏省自然科学基金(Blc2006啷);中央级基本科研业务费
专项资金(2000r7JBF003)项目资助 作者简介:唐永凯(19r78一),男,湖北黄冈人,助理研究员,从事遗传育

种,E一嘲n:时@脑.∞。
 

生物技术 样品,则要选择基因组DNA作为标准品;以RNA为样品,则要 选择PlNA(totai llNA)或目的基因的eDNA为标准品。如果目

2008链18(3)

的基因丰度低,DNA样品则要构建质粒标准品,RNA样品则要 构建体外转录RNA。

荧 光 信 号 强 度

亳4 3


粤2
亳1

謦。
循环圈数
real firm

圈1

№.1 2相对定量

The出蒯删d

PCR的标准曲线
realtime PCR’
?

其中E表示扩增效率,n为循环数,足表示在n个循环 后PCR产物的数量,冠表示在c1个循环后PCR产物的数量, 局为原始模板数量。ct代表目标扩增产物达到设定阈值所 经历的循环数。G.,代表目的基因(相对于管家基因)扩增产物 达到设定阈值所经历的循环数,墨为一常数,在这里指荧光 量,对于管家基因而言,也有同样的公式j 五=Xo×(1+E)。一=K。 用心除以五得到:
忍 凰×(1+西)“7 静 , ..尬一Xo×(1+觑)o。一五&一1、

’绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使 用,但在有些情况下,并不需要对转录本进行绝对定量,只需 要给出相对基因表达差异即可。如X基因在经过某种处理后 表达量是增加了还是减少了,这时只需要用相对定量的方法 就可以得到结果,而不需要对标准品进行定量来确定浓度。 由于系统误差的原因,不同的样品很难获得相同量的RNA,这 时就有必要引入管家基因来对所有样品进行归一化处理(IiNA 量校正),然后再对不同样品之间的目的基因表达量进行比 较。相对定量大多采用双标准曲线法、2“60以及动力学法。 2.1双标准曲线法 目的基因、管家基因分别作标准曲线,然后从各自的标准 曲线上求出初始模板量,经管家基因均一化处理后,求出目的 基因的相对含量。表lml中用标准品分别作出目的基因和管 家基因的标准曲线,再根据Sample A、Sample B、Sample C的C。 值分别得到目的基因和管家基因的初始模板量。然后经管家 基因的均一化处理,分别得到三样品目的基因的相对含量,见 表2[川。
裹1目的基因和管家基因的原始定量结果
Tab.1 1lle


目的基因和管家基因经过C。和c。循环数后达到相同 的荧光量,K和融相等,即K等于1。对于使用Taqmma探针 的real time PCR而言,b和k的值由一系列因素决定:包括探 针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探 针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数足并不 一定等于l。
’“

假设目标序列与内参序列扩增效率相同,即E=匠=E (风,弱)×(1+E)04’“=K或RN×(1+E)o?”D一=K RN代表经过均一化处理过的初始目标分子量,△c‘表示 目的基因和管家基因C。值的差异(c‘.,一c1.,)。整理上式得: 冠Ⅳ=K×(1+E)。60; 最后用任一样品q的尺N除以参照因子(calibrator,cb)的 RN得到:

cl value 0f 0bjecI

germ

and

housekeeping舭


垦塑量
标准品1 标准品2 标准品3 标准品4 标准品5 标准品6 蟹硷Ie鬟
1 10 100 1000 10tiff0 100000


旦丝墨里茎 壁 星量堕墨:!
35.66 32.T/ 29.20

垦塑堡
l 10

笪墨墨垦旦 垒 壅量蕉墨::
37.46 33.06
一 一 一 一 一 一

I∞
1000 10000 100000 343.3 17.3
一 ?

艿.毋
26.10 22.51

笛.75
22.06

‰R_a=群-(1棚“△D’』’


t8.磁
27.22

18.鹅

在这里,一△△G=一(△cI.。一A c1.d)。设计好引物, 控制好扩增条件,扩增效率E接近于l。因此目的基因的量通 过管家基因均一化处理之后相对于参照因子而言就是:
2一△△o。

啡B-31?70 继曼 丝:堡


为.17
22?70 8589?7

!竺垒:!



丝:丝型丝:2

表2目的基因的相对含量
Tab.2

RNA样品A RNA样品B RNA样品C
2.2

检测样品{器1西i吾粟i—号差星蒿窖L而
The relative omtent

0f出ject gem

表3m1给出了目的基因(c—myc)和内参基因(GAPDH)在 不同PCR管中扩增的实验数据。在这里不应把任一单个的c 一打驴基因ct和GAFDH基因ct作比较,而应该分别计算出c —rn筘和GAPDH的平均C。来计算△cl。因此,在最后的计算 中,2“60的误差通过△△ct加上标准差和△△c。减去标准 偏差来评估。如果在同一PCR管中扩增目的基因和管家基因 (目的基因和管家基因分别用不同的荧光标记),则分别对每

6391.5

343.4 17.3

0.01537

1.000

舒鲫.7
7432.9


0.0020 0.2618

0.0"37 4.874

1946.1

2—66口法

如果反应条件控制较好,目的基因和管家基因的扩增效 率相等,这时就不需要作标准曲线,而是通过比较△C。值来确 定目的基因的表达量。
c-

个C。计算△cI值,这些值取平均值后再进行2“卸计算。
2.3动力学法’ 上述的几种计算方法,都是假定PCR指数扩增期的效率 相等,但实际情况并非如此。经动力学检验。P(m扩增期的荧 光量和循环数符合下述方程:

对于目的基因来说,PCR指数扩增的公式是:R。=Ro×(1 +层,)。,当循环数到达阈值时的ct时,荧光量为一常数墨,即 冠=风×(1+E)“’=K

露一只-2再面矛可Itui瓣2

R-

 

2008年18(3)

生物技术

91

R指PCR扩增过程中的荧光量,见指荧光背景量,兄指 扩增循环数为13时扣除背景的荧光量,R一指PCR达到扩增平 台期时最大的荧光量,nl尼指荧光量为R一的一半时的扩增循 环数。K为PCR扩增期的斜率,为一常数。
表3目的基因和管家基因的cl值
Tab.3 The

效率不可能为1,即使相同组织相同的基因,由于加样、引物浓 度、酶量、核苷酸量等系统误差的影响,扩增效率也会不一样, 动力学法就很好地反映了每次循环的扩增效率,由该方法计 算出的&代表初始模板量,但计算较复杂,未能得到广泛的 运用。


cI value 0£target

gene

and hmsdceeping

gene

4展望
由于real
time

PCR的灵敏度极高,因此—个合适的数学模

型来处理数据就显得非常重要。目前广泛运用的模型是尺. =风×(1+E,)。,是在假设扩增效率不变的基础上建立
∞.M ∞.冀
30?34 30.50

23.56

蕾.47 筠?岱 趋.萌
∞.岛-
23.63±0.09 22.76
?

的ⅢmJ,这对PCR早期是合适的,但要运用到整个PCR过程 中,显然是不对的。因为P(R扩增是一个多因素影响的过程, 。包括模板量、引物、离子、核苷酸、酶活力、反应温渡。除了温 度能控制,其它成分都是动态变化,最终影响到扩增效率。除 ’了数学模型外,PCR的引物设计、反应条件控制也尤为重要, 扩增产物的特异性高,得到的扩增曲线好,运用目前的数学模 型就能得到理想的结果。
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在PCR扩增中,扩增效率显然不可能相等,到达平台期 后,扩增效率降为零。所以每次PCR循环,扩增效率都不会一 样。根据现在通行的数学模型m】,定义扩增效率为: E=(兄一兄一。),墨一t 结合上面的方程可以得到:

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假设风为初始模板量,此时n=o,那么可以得到凡和荧 光量问关系的方程:

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从S型的扩增曲线上可以得到R一和nl璧,代人方程中可 以获得K值,从而求出模板的初始量风,如果PCR扩增中没 有非特异性的产物,扁可以代表基因的初始模板量,然后再 通过管家基因的均一化处理,可以算出目的基因的相对含量。
裹4不同酶量的real血tPCR各数据
Tab.4
time
t-一 一

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Polymerase"(m)
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R。

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o.47 o.46 0.45 0.44 ume

0.9986 2.783 o.9988 2.340 0.9989 2.155 0.9982 1.791

30.60

15.95 15.90 16.55 16.20

10—5

【9J丑娜M,S}I∞D,HeM JE,d a1.0c山r clt域目in d一“f.d口di嘲∞【J].M越Vb.2007。13.2129—36.
[10]Mo∞f.i P,Q硼dleyIa5 D F,B毛哺M C,d
血瞻PCR

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2.635钿.23
2.684 30.93 2.749 30.443

2.4×10—5 2.1×10一, 2.7×10一,

从表4中可看出。不同酶量的mtl 中得到的llo却几乎相等。

PCR的K值以及

R。的值不一样,扩增曲线不一样,cI值也不一样,但从方程

阳‰in阳即帕盼toPHllB,量t删白tIy“d碍Iml舶ciIl}Iib嘛[J].J AppI
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y∞戚additive

3小结



绝对定量数据容易处理,能给出目标基因的绝对数量,通 常在需要确定目的基因绝对拷贝数的条件下使用,但标准品 的制备困难,而且不易质控。所以在不需要精确定量的情况 下,大都采用相对定量的方法。双标准曲线法假定PCR在指 数扩增期扩增效率一样,通过cI值来确定目的基因的相对含 量。由于作标准曲线的标准品容易获得,不需要定量,所以该 方法得到了广泛的应用。而2“60法则假定目的基因和管家 基因的扩增效率为1,不用作标准曲线,具有简便易行的优点, 但误差较大,在运用过程中应优化反应条件,使目的基因和管 家基因的扩增效率接近1。在PCR早期扩增过程中,反应成

PCR

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份、循环条件、引物错配均会影响砌t最终产物量,所以扩增  

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荧光定量PCR数据处理方法的探讨
作者: 作者单位: 唐永凯, 贾永义, TANG Yong-kai, JIA Yong-yi 唐永凯,TANG Yong-kai(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业部水生动物遗传育种和 养殖生物学重点开放实验室,江苏无锡,214081), 贾永义,JIA Yong-yi(浙江省淡水水产研 究所,浙江湖州,313001) 生物技术 BIOTECHNOLOGY 2008,18(3) 1次

刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 引用次数:

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相似文献(10条) 1.学位论文 丁维民 TaqMan-MGB探针双重荧光定量PCR方法绝对定量MDV-Ⅰ和HVT 2009
马立克氏病(Marek's Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's Disease Virus,MDV)引起鸡的一种恶性淋巴肿瘤性疾病,具有高度接触传染

性。由于该癌症病的隐蔽性极强,又没有治疗手段,其主要预防措施是1日龄内接种疫苗。但疫苗仅阻止发病而非感染,因此对MDV的感染或污染进行特 异性的诊断和监测十分重要。TaqMan-MGB实时荧光定量PCR (FQ-PCR)技术具有快速、灵敏、特异、特别是可以定量测定病毒拷贝数的优点为检测MDV提 供了很好的方法。 本试验根据GenBank上的Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV-1)UL36基因和火鸡疱疹病毒(HVT) Bcl-2基因序列,用Primer Express 3.0软件分别设计了MDV-1和MDV-3的特异性引物和TaqMan-MGB探针,根据距阵优势法分别对引物和探针的浓度进行了优化,并在不同退火温度和不同循环 数下进行了优化反应,确立了最佳反应体系和反应条件,通过双重实时荧光定量PCR的不交叉反应,最终建立了MDV-1和MDV-3的TaqMan-MGB探针双重实时 荧光定量PCR方法。该方法特异性强,对新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒及鸡胚成纤维细胞提取的DNA均未 扩增出荧光定量曲线;将放置不同时间的质粒(1d、30d)分别进行FQ-PCR的检测,发现不同检测时间、不同反应管之间的域值(CT)的变化很小,组内 组间变异系数均小于5%,表明本试验建立的方法具有很好的稳定性;将浓度分别为5.45×1010与5.38×1010拷贝数/mL的pBJ-U和pHV-B质粒DNA标准样品 分别用去离子水做10的系列倍比稀释,进行常规PCR、FQ-PCR检测,结果表明FQ-PCR的检测灵敏度高出普通PCR 100倍。pBJ-U和pHV-B质粒DNA标准样品分 别稀释至10-10时FQ-PCR可灵敏地检测5.45、5.38个拷贝数的病毒,而在pBJ-U和pHV-B质粒DNA稀释到10-8时,常规PCR产物的电泳结果已经不清晰。 通过对实验鸡和临床发病鸡的检测,得出本试验建立的双重荧光定量PCR方法可以灵敏地定量检测到MDV-1。在临床发病鸡检测的不同组织样品中,MDV1含量为103.5~6拷贝数/mL,羽囊中病毒含量最高,达105~6拷贝数/mL;通过对实验免疫攻毒鸡羽囊样品的检测,发现HVT疫苗在一定程度上抑制了 MDV-1在体内的复制,使羽囊排毒高峰延迟了两周,与攻毒对照组相比其高峰值下降101~2拷贝数/mL; MDV-3在HVT免疫攻毒组的羽囊中的病毒含量要高 于免疫对照组,并且MDV-3在羽囊中的整体复制水平都不高。 总之,该方法将为MDV强毒污染监测、临床鉴别诊断、MD发病机理以及疫苗免疫机理 的研究提供一种良好的技术手段。 关键词:马立克氏病病毒;UL36和Bcl-2基因:TaqMan-MGB;双重FQ-PCR

2.期刊论文 王文君.陈海祥.WANG Wenjun.CHEN Haixiang 新型荧光定量PCR检测孕妇生殖道解脲脲原体方法的建立 -全科医学临床与教育2006,4(5)
目的 探讨建立自身淬灭探针荧光定量PCR方法检测解脲脲原体(Uu)的可行性及价值.方法 根据Uu UreA基因序列设计合成引物和自身淬灭引物,采用 基因克隆技术,将UreA基因片段插入到载体pMD18-T,以此作为标准品.优化PCR条件,建立以自身淬灭引物技术为平台的实时荧光定量聚合酶链反应(FQPCR)方法,并对所建立的方法进行初步方法学评价.结果 成功构建了重组质粒pMD18-T-UreA;建立了以自身淬灭探针技术为基础的实时荧光定量PCR方法 ,其线性检测范围为101~109copies/μl;灵敏度为10copies/μl;重复性实验批内CV为2.35%,批间CV为3.68%,天间CV为4.92%;特异性好;通过初步临床应 用发现,所建立的FQ-PCR方法与经典的培养方法相比,不仅能实时监测反应进程、绝对定量和快速检测,且检出率显著高于培养方法.结论 自身淬灭探针荧 光定量PCR方法检测Uu具有快捷、敏感、廉价等优点,可在临床诊断中应用.

3.学位论文 张珣 六种植物病毒Real Time PCR定量方法的建立及其应用 2008
植物病毒的检测是植物病毒病监测防控中最为重要的环节之一。以往常规的血清学检测,核酸杂交检测和传统PCR技术在植物病毒检测应用方面都或 多或少存在着不完善的地方。因此,本研究以荧光定量PCR技术为基础,锚定水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)、三种大麦黄矮病毒 (Barelyyellowdwarfviruses,BYDVs)、小麦矮缩病毒(Wheatdwarfvirus,WDV)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)的 CP序列基因保守区域,分别建立了各自的用于定量检测的RealTimePCR方法。同时,应用这些方法对这几种病毒进行了初步的定量检测研究。主要内容如 下: 1.建立了一套用于定量检测RSV的OneStepRealTimeRT-PCR方法。通过序列比对,在RSVCP序列保守区域内设计特异性的引物和探针;通过在 GenBank中用BLAST进行比对,证实引物探针特异性很高。对RSVOneStepRealTimeRT-PCR反应体系进行优化,最佳的引物和探针终浓度均为O.2μmol/L建 立标准曲线,检测灵敏度可达到20拷贝/2μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。通过与ELISA检测技术的灵敏度对比,该实时荧光定量PCR方法 展现出极高的灵敏性。对感RSV水稻不同组织内和单头带毒灰飞虱体内RSVCPRNA进行绝对定量检测。结果显示,水稻叶片中病毒RNA含量高于茎组织;雌 虫灰飞虱体内较雄虫携带有更多的病毒RNA,并且虫体的胸腹部是病毒RNA最主要的聚集区,而虫体头部病毒RNA含量极低。 2.针对BYDVGPV、GAV和 PAV的定量检测,分别建立了OneStepRealTimeRT-PCR方法。三套独立的检测体系检测靶基因序列均位于BYDVCP保守序列上。GPV检测探针标记FAM荧光基 团,GAV检测探针标记CY5荧光基团,PAV检测探针标记HEX荧光基团。建立标准曲线,三套定量检测体系的检测灵敏度均可以达到50拷贝/20μl体系,曲 线斜率和扩增效率均符合定量要求。通过对感病小麦的检测证明所建立的RealTimePCR体系是成功的。 3.建立了一套用于定量检测WDV小麦株系的 RealTimePCR方法。通过序列比对,分别在WDV小麦株系CP基因和长非编码区设计了两组引物探针。其中锚定长非编码区的引物和探针组合可以很好的区 分WDV小麦株系和大麦株系。使用锚定CP基因的引物探针组合建立RealTimePCR定量检测方法。通过对反应体系进行优化,最佳的引物和探针终浓度均为 0.2μmol/L。建立标准曲线,检测灵敏度可达到30拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。通过与ELISA检测技术的灵敏度对比,该实时 荧光定量PCR方法展现出比ELISA检测要高的多的灵敏性。通过对田间采集的26组疑似WDV侵染小麦样品进行定量检测,其中24组样品检测为阳性,病毒检 出率为92.3%。而同时采用传统普通PCR进行检测,仅有12组样品检测为阳性,病毒检出率不到50%。由此可见,本研究中所建立的荧光定量检测方法相 对于传统PCR检测具有更高的灵敏度。对采集自病区的单头条沙叶蝉体内WDV进行绝对定量,结果显示该定量方法适合于单头介体昆虫带毒量的检测;进 而为小麦产区WDV介体昆虫带毒率分析提供了一种新颖的,灵敏的,准确的手段。使用第二组引物探针,针对本实验室采集的大麦样品进行WDV小麦株系 的检测。结果显示,样品YNKM-29,YNKM-38,YNKM-39和YNKM-43可以检测到WDV小麦株系DNA。 4.建立了一套用于定量检测CGMMV的 OneStepRealTimeRT-PCR方法,并首次将检测靶基因锚定于病毒CP基因上。通过摸索改进,建立了一套比较适合提取富含多糖多酚植物样品总RNA的方法 。对反应体系进行优化,最佳的引物和探针终浓度均为0.2μmol/L。建立标准曲线,检测灵敏度可达到50拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合 定量要求。利用建立的定量方法对西瓜种子不同部位组织带毒量进行了检测。结果显示,子叶组织中病毒RNA含量极高,外种皮次之,内种皮最低。由此 可见,子叶是西瓜种子内病毒RNA聚集最为主要的部位。

4.期刊论文 蒋春燕.王泰健.王琴.范学政 实时荧光定量PCR技术 -动物医学进展2005,26(12)
荧光定量PCR技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的,具有灵敏度高、 特异性强、线性关系好、操作简单等优点,不但能够用于基因定量检测,还能准确定量疾病相关基因的表达,现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、 定量分析、早期诊断、基因分型等方面.它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实现定量检测,但都有各自的优缺点,需根据具体的试验选择合适的定量 方式,从而得到更准确的试验结果.提高荧光定量PCR技术的特异性和灵敏度需从多方面着手,主要指特异性探针及引物的设计,选择合适的Mg2+浓度、引物 和探针浓度、循环数等.

5.学位论文 段廷云 H1N1亚型SIV河南株的分离鉴定、HA基因的克隆和序列分析及荧光定量PCR诊断方法的建立 2006
猪流感是世界范围内常见的呼吸系统传染病之一,早在上世纪二十年代就开始在美洲流行。常与其它病原共同感染而加重了对世界各国的养殖业的 危害。此外,由于猪被称为是流感病毒的组合器,猪流感病毒因而在公共卫生方面也有着十分重要的意义。流感病毒亚型众多和容易变异的特点给该病 的诊断和防治带来了诸多挑战。H1N1是猪流感最常见的亚型之一,在我国多个省份都有过报道。为了研究猪流感病毒的分子流行病学变化规律,找到准 确、敏感的诊断方法,为猪流感的防治奠定分子生物学角度的基础和依据,本试验从河南本地猪场分离了H1N1亚型猪流感病毒,并建立了能够对病料进 行定量检测的实时荧光定量PCR诊断方法。 病毒被命名为A/Swine/Henan/407/2005(H1N1)(简称为SHN407),为热不稳定型,对酸敏感,能导致小白 鼠发病、死亡。从存活的小白鼠血清中可以检测到特异性抗体,EID50,ELD50分别为10-6.5和10-1.75。从GenBank上下载了世界各地多个典型H1N1亚型 毒株HA基因,在编码区以外相对保守区设计了一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增出SHN407株的HA基因,然后将其克隆到pGEM-T载体上,转化到 JM109大肠杆菌中,经蓝白斑筛选后将阳性菌株的重组质粒测序。序列分析发现该毒株的HA基因全长1701bp。HA全基因共编码566个氨基酸,其中HA1包含 330个、HA2包含221个。共有7个糖基化位点,其中HA1上有5个、HA2上有2个。裂解位点附近没有碱性氨基酸存在,不具有高致病性毒株的特征。HA基因 的同源性及系统发育树显示,该毒株与香港、中国内地、北美的古典H1N1亚型分离株的亲缘关系较远,而与欧洲各国流行株的亲缘关系较近,为典型的 类禽H1N1亚型猪流感病毒。 从GenBank上下载了来自世界各地多个典型毒株的NP基因,利用DNAstar软件进行分析比较,在大约1300-1500bp之间发 现了一个相对保守区。利用Premierexpress引物设计软件找到了一对引物和相应的探针序列。在探针的5'端以FAM标记;3'TAMRA标记。利用上述引物 ,通过RT-PCR方法扩增出SHN407株的部分NP基因,然后将其克隆到pGEM-T载体上,转化到JM109大肠杆菌中,经蓝白斑筛选后将阳性菌株测序,测序结果 证实扩增的序列完全正确。将从细菌中提取的重组阳性质粒10倍梯度稀释,作为阳性定量标准模板,用于标准曲线的建立和样品的检测。本试验经过对 探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度的一系列优化比较,建立了最佳的反应体系和扩增程序,标准曲线上各点均匀一致。该方法对H3N2、 H9N2等流感病毒亚型以及猪体内常见的多种病毒对比试验均显示阴性。与普通PCR方法相比,荧光定量PCR不仅解决了不能绝对定量的难题,在定性检测

上也更为敏感。H1N1亚型荧光定量PCR诊断方法的建立为猪流感的病理研究创造了有利条件。

6.期刊论文 王欣.苗玉发.周晓冰.沈连忠.李波 腺病毒载体介导gag基因在小鼠体内的生物分布 -中国生物制品学 杂志2008,21(11)
目的 研究腺病毒载体介导gag基因在C57BL/6小鼠体内的生物分布.方法 经C57BL/6小鼠左后肢股四头肌部位单次注射0.05 ml Ad-gag,于给药后不同 时间摘取组织脏器,采用Taqman探针实时荧光定量PCR法,以小鼠β-actin基因作为内参,外标绝对定量法分别定量样本中gag和β-actin基因拷贝数.计算 每104个小鼠细胞中gag基因的拷贝数,比较各脏器的分布数量.结果 外标绝对定量法精密性良好.gag基因主要分布在注射位点、淋巴结、脾脏和肝脏,其 他脏器没有分布.给药后3 d,gag基因在靶器官分布达峰值,注射位点分布最多,伴随时间延长逐渐减少.结论 Ad-gag疫苗在体内不会蓄积并产生全身的特 别是生殖系统毒性.本研究可作为重要的安全性试验数据,支持药物在临床应用.

7.学位论文 王彩纹 NGAL mRNA荧光定量PCR检测方法的建立及初步评价 2009
目的: 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin,NGAL)是lipocalin家族的新成员,于1993年 在人中性粒细胞中被发现。近年来众多研究表明NGAL基因参与若干肿瘤的发生发展,可能是人类的一种重要的癌基因;Goets等的研究还显示在细菌入侵 机体后,NGAL可以作为铁载体介导阻碍细菌对铁的捕获,从而抑制细菌的生长,是一种重要的细菌抑制剂;NGAL还参与肾小管上皮发生的及功能调控 ,对急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)等肾脏功能的诊断价值比传统的AKI实验室指标血肌酐更为快速和准确,是AKI最强有力的预测因子。因 此对NGAL基因的检测亦显得尤为重要。本课题研究的目的就是建立NGAL mRNA的荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测方法,并 将此方法应用于临床结肠癌患者肿瘤组织、癌旁组织及正常组织NGAL mRNA的检测,初步验证其应用价值。 方法: 1.根据NGAL基因序列,设 计并合成PCR引物,将PCR扩增的特异片段克隆入T载体,重组质粒经筛选、鉴定、定量后作为标准品。 2.在上述NGAL扩增片段内部设计FQ-PCR引物 ,通过正交设计方式对PCR引物浓度、退火温度、SYBRgreenⅠ染料(Mg2+)浓度等PCR反应条件进行优化,从而建立NGALmRNA的检测方法。 3.将高 浓度标准品质粒进行系列稀释,用上述优化的FQ-PCR方法进行检测,以NGAL拷贝数为横坐标,循环阈值为纵坐标绘制标准曲线,用于被测物的绝对定量 。 4.对该检测方法进行敏感性、特异性及重复性等方法学评价。 5.将建立的FQ-PCR用于临床结肠癌患者肿瘤组织、癌旁组织及正常组织 NGALmRNA的检测,其结果与普通PCR相比较。 结果: 1.成功构建了重组质粒pGM-T-NGAL。 2.确立了FQ-PCR最佳反应条件 :SYBR10×Buffer(withMg2+)2μl、dNTPs0.2mmol/L、上游、下游引物各0.32μmol/ml、SYBRTaqTM1.25μl、ddH2O15.15μl,退火温度60.0℃。 3.制作的标准曲线相关系数为98.9%,无非特异性扩增。建立了以NGAL mRNA SYB RgreenⅠ染料技术为基础的实时荧光定量PCR方法,其线性检测范围 为102~109copies/μl;灵敏度为10copies/μl.高拷贝样品的天间CV为3.57%、批内CV为2.95%,低拷贝样品的天间CV为3,24%、批内CV为 1.85%;特异性好; 4.对临床标木的检测结果与预期设想完全相符。肿瘤组织、癌旁组织正常组织的NGAL mRNA水平呈明显的下降梯度。与普通 PCR相比,该检测方法灵敏度要高约100倍。 结论: 我们成功构建了FQ-PCR检测体系和NGA LmRNA的定量标准品,其快速、灵敏、特异的特点 适合临床实验室的应用。为临床NGAL mRNA的快速定量奠定了坚实的基础。

8.期刊论文 定量PCR的荧光技术 -生命的化学2005,25(5)
荧光定量PCR是在普通PCR基础上,利用荧光技术对核酸进行绝对定量的一项新兴技术,其灵敏度高、特异性高、操作简便和定量准确,已被广泛应用于 临床和科研中.为更好地发挥荧光定量PCR的优点,荧光技术领域的研发工作十分活跃.

9.学位论文 王伟 甜菜夜蛾抗多杀菌素的机理研究 2006
甜菜夜蛾(SpodopteraexiguaHübner)是一种世界性分布、间歇性大发生的,以危害蔬菜为主的杂食性害虫,对农业生产造成巨大危害。长期的化学 防治,甜菜夜蛾已对许多类杀虫剂产生了很高的抗药性。多杀菌素是一种作用机制独特的新型杀虫剂,对甜菜夜蛾的防治效果显著,但是近年来发现甜 菜夜蛾已对多杀菌素产生了一定的抗药性。但是甜菜夜蛾对多杀菌素的抗性机制的研究很少,本研究选用上海市郊的甜菜夜蛾进行了室内敏感和抗性品 系的筛选,对甜菜夜蛾抗多杀菌素的机制进行了初步的研究,主要结果如下。 采用浸叶法进行抗性品系的筛选,当筛选到第5代时,抗性是敏感的 345.4倍,可以看出甜菜夜蛾对多杀菌素的抗药性发展速度较快,易产生高抗性。选用氰戊菊酯、辛硫磷、灭多威、甲氨基阿维菌素、氟氯氰菊酯等5种 不同类型的药剂对多杀菌素进行交互抗性的测定,结果显示这些药剂均对多杀菌素没有交互抗性。用敏感、抗性品系3龄幼虫通过点滴法分别测定PBO、 TPP、DEF、DEM对多杀菌素的增效作用,敏感品系分别增效0.7、0.5、1.0、0.6倍,抗性品系分别增效9.8、1.5、2.6、1.5倍。其中PBO对抗性品系的增 效作用最为明显,为9.8倍。对谷胱甘肽S-转移酶(GST)和多功能氧化酶O-脱甲基进行了酶活测定,结果GST在抗性品系和敏感品系中活性没有显著变化 ,活性比为1.0倍;抗性品系的多功能氧化酶O-脱甲基活性是敏感品系的5.2倍,表明甜菜夜蛾对多杀菌素的抗性与谷胱甘肽S-转移酶无关,可能与多功 能氧化酶0-脱甲基活性增高有关。 以5龄甜菜夜蛾抗性品系的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应 (RT-PCR)扩增并筛选出2个新的长度约450bp的甜菜夜蛾细胞色素P450基因cDNA片段,并对这些序列进行了生物信息学分析。结果显示,这2个P450基因片 段分别属于细胞色素P450CYP4家族的CYP4S和CYP4G2个亚家族,二者分别命名为Secyp4s8-likeSecyp4g31-like基因。其中前一个基因片段的长度为 441bp,推导的氨基酸序列长度为146个氨基酸残基;而后一个基因片段的长度为456bp,推导的氨基酸序列长度为151个氨基酸残基。 本研究利用 荧光定量PCR技术对克隆得到的2个细胞色素P450基因在不同品系甜菜夜蛾体内的表达水平进行了检测。我们重新设计了荧光定量PCR引物,然后利用绝对 定量的方法检测了这2个基因在不同品系甜菜夜蛾体内的拷贝数。结果显示,Secyp4s8-like基因和Secyp4g31-like基因在抗性品系甜菜夜蛾样品中为 1.74E+04拷贝/μg总RNA和3.70E+02拷贝/μg总RNA,在敏感品系中为1.45E+03拷贝/μg总RNA和2.69E+02拷贝/μg总RNA。两相比较后可以看出 ,Secyp4s8-like基因在抗性品系中表达量是敏感品系的12.0倍,而Secyp4g31-like基因在抗性品系中表达量是敏感品系的1.38倍。据此推测 ,Secyp4s8-like基因的过表达可能与甜菜夜蛾对多杀菌素的抗性相关。

10.期刊论文 王建英.杭苏琴.李云龙.WANG Jian-ying.HANG Su-qin.LI Yun-long 荧光定量PCR检测小鼠卵母细胞 中Mad2 mRNA的表达 -畜牧与兽医2006,38(10)
目的:应用SYBR Green Ⅰ染料法建立检测Mad2 mRNA表达的实时荧光定量PCR的方法,并探讨小鼠卵母细胞减数分裂成熟中Mad2 mRNA的表达.方法:采 用实时荧光定量PCR的方法,以SYBR Green Ⅰ为荧光染料,梯度稀释的重组质粒为模板制作标准曲线,并以此方法分析了小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中 Mad2 mRNA表达的动态变化.结果:建立了实时荧光定量检测方法分析小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达,该方法灵敏、特异,扩增效率接近100%.进行了标准 曲线的制作,以及对目的基因Mad2转录水平的绝对定量.结论:实时荧光定量PCR是检测基因表达水平的理想选择,在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达存在动态变化.

引证文献(1条) 1.张亚晶.卢才义.黄亚.周圣华 睡眠剥夺对大鼠心脏的影响及其致心律失常机制研究[期刊论文]-心血管康复医学 杂志 2009(3)

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