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02第二章


第二编 纯化方法

主要讲解分离蛋白质和核酸等物质的常见方法 第二章 沉淀法

沉淀法是纯化生命大分子物质常用的一种经典方法。该法操作简单、成本低廉。 一般包括:盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀 等类型。 第一节 基本原理与沉淀类型 一、基本原理 沉淀法也称溶解度法 纯化基本原理是: 根据各种物质的结构差异来改变溶液的某些性质,就能致使抽

提液中有效成分的 溶解度发生变化。 结构差异:如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比例的差异 某些性质:如 pH、极性、离子强度、金属离子等 换句话说就是: 不同的物质置入相同的溶液,溶解度是不同的; 相同的物质置人不同的溶液,溶解度也是不同 二、制备蛋白质 1.盐析法 的。

盐析法的根据是: 蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随盐浓度的增高而上升(盐溶 salting in), 但当盐浓度增高到一定数值时,其溶解度又逐渐下降,直至蛋白质析出(盐析 salting out)。 粗提取液

一定浓度范围的盐溶液 (如 0~25%饱和度硫酸铵)

离心分离(得上清液)

一定浓度范围的盐溶液 (如 25%-60%饱和度的盐溶液)

离心法收集的沉淀物(初步纯化) 杂质呈盐析状态, 有效成分呈盐溶 状态

有效成分呈盐析状态, 杂质呈盐溶状态 盐析法的一般操作步骤是

(1)盐分级沉淀 ①盐的选择 常选用的盐是硫酸铵。 因为硫酸铵与其他盐(如氯化钠、硫酸钾等)相比,有以下优点: 溶解度大,对温度不敏感。 分级效果好。有稳定蛋白质结构的作用。 价格低廉,废液可以肥田。

缺点:得到的样品欲继续纯化时,需花一定时 间脱盐。 ②硫酸铵盐析 A.固体法 在大体积的粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵,当加到一定饱和度时,蛋白质便可 沉淀出来。 例如,在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵,当饱和度达 35%时,尿素酶基本上仍留 在溶液中;而饱和度达 55%时,尿素酶几乎全都沉淀出来(见表 2-1)。 欲将蛋白质溶液变成一定饱和度硫酸铵溶液时,需要加入的硫酸铵数量可从表 2-2 (P25)查得, 也可用下列公式计算:

g:表示在一升溶液中需加入固体硫酸铵的克数; S2:表示要求达到的百分饱和度。 S1:表示原溶液中的百分饱和度。 B.饱和溶液法 这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法。 其操作是在蛋白质溶液中逐步加入预先调好 pH 的饱和硫酸铵溶液。 不同饱和度所需的硫酸铵量可用下列公式计算:

V=V0 [(S2-S1)/(S3-S2)]

式中,V 表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml); Vo 表示原来溶剂的体积(ml); S2 表示要求达到的百分饱和度; S1 表示原溶液中的百分饱和度; S3 表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百的)。 C.透析法 将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中,通过透析作用来改变蛋 白质溶液中的盐浓度。 (2)盐析曲线制作 用盐析法沉淀欲分离样品时,所需浓度范围要通过试验确定。 具体步骤如下: A. 分级沉淀

取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液, 调节 pH 至稳定范围, 6~10 分 次加入不同量的硫酸铵:

第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时,静置一段时间,离心或过滤即得 到第一个分级沉淀部分。

接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中, 则得到第二个分级沉淀部分。

如此连续进行,便可得到 6~10 个分级沉淀部分。

B.作盐析曲线 将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜 pH 缓冲液中, 根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图, 即可得到如图 2-1 所示的典型盐析曲线。 C.确定最佳盐析范围 在此曲线基础上,参照表 2-3 的分级试验方法,可根据生物材料来源的难 易程度,以及对有效成分纯度和收得率的需求,先找出有利于提高纯化倍数或得率 的大致分级框架,然后经过反复试验就能确定最佳盐析范围。 从表 2-3 可以看出, 若生物材料来源容易,主要是考虑提高纯化倍数时,选择 48%-65%盐饱 和分级范围,酶的纯化倍数可达 3.0,而得率仅为 75%; 若生物材料来源较困难,主要是考虑提高收得率时,则选择 45%~70%甚

至 45%~75%盐饱和分级范围,酶的收得率可达 80%以上,而纯化倍数将≤2.4。 盐析小结 A.分级沉淀; B.作图盐析曲线: 测蛋白质或酶含量; 作盐析曲线图 (以蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度 之间的关系) ; C.确定最佳盐析范围: 反复试验,确定最佳盐析范围(材料来源的难易,有效成分纯度和收得率的需 求) 。 (3)盐析的影响因子 ①盐析常数(KS) 实验证明,每种蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间存在下列关系,即 溶解度(S, mg/ml 表示)的对数值与溶液中盐的浓度(M)成反比例关系, 以 可用下面 的公式表示:

lgS=β- KS·M

式中,S 表示有效成分在水中的溶解度; M 表示摩尔浓度; KS 表示有效成分在特定条件下的恒定值 (见表 2-4),其大小即表示有效成分之溶 解度降低的速率与盐浓度的关系。

KS 值大,则意味着有效成分溶解度降低的速度是随着盐浓度的增加而快速降低(即 沉淀加快)。 因此,对一种有效成分而言,KS 值越大,分级范围越窄,盐析效果就越好。 某一蛋白质的 KS 值不仅与蛋白质本身的性质有关,而且也会受溶液的 pH、温度和 盐的种类等因子的影响。 ②盐分级范围的差异性 当分离两种以上蛋白质时,若每一种蛋白质的 KS 值都很大,而且盐析范围(盐离子 强度)差异明显,则分离效果好(见图 2-2 中 A 和 C);若 KS 值很大,但盐析范围差 异较小,则分离效果不好(见图 2-2 中 A 和 B)。 ③pH 和盐浓度 一般来说, 在第一次盐析时(即除去杂质), 盐溶液 pH 应偏离有效成分的 pH 值, 靠近杂质 的 pH 值; 在第二次盐析时(分级盐析范围内,即沉淀有效成分),盐溶液 pH 应调至接近 有效成分的 pH 值。 另,考虑避免盐溶液 pH 值对蛋白质的破坏。 ④蛋白质的纯度和浓度 一般控制样品液蛋白浓度在 0.2%—2%为宜。 (蛋白质浓度越高,共沉淀现象越明显) ⑤其他 在进行盐析沉淀时,有时需在溶液中加 1mmol/L 的 EDTA-Na2 盐,以除去沉淀剂中 带入的金属离子。

再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好,过长过短都不适宜,一般需要 2h 左右。 (4)脱盐 常用的脱盐方法:凝胶过滤法、透析法。(前者的原理及操作将在第六章阐述), 透析法的原理是分子扩散运动。 其具体操作是: 把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋, 扎紧袋口(袋内留 有适当空间),漂在水或适当的透析液中,要防止透析液从袋口进入,以免引起透析 袋胀裂。 2.有机溶剂沉淀法 有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二: 其一,与盐溶液一样具有脱水作用; 其二,有机溶剂的介电常数比水小,导致溶剂的极性减小。 常用的有机溶剂是甲醇、乙醇和丙酮。 用有机溶剂沉淀蛋白质时,需加入的有机溶剂量,一般是以体积为单位按下 列公式计算: V 表示加入有机溶剂的体积; Vo 表示蛋白溶液的原始体积; S1 表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度); S2 表示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度(体积百分浓度)。 有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析法相似。盐析法的注意事项在这里同样适用。 此外,还有几点需要指出: (1)低温下操作

由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性。 (2)中性盐作用 加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度,可降低有机溶剂对 蛋白质的变性作用,同时还可提高分级效果。 (3)多价阳离子作用 有些蛋白质和多价阳离子(如 Zn2+、Cu2+等)能结合形成复合物,致使蛋白质 在有机溶剂中的溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀的蛋白质特别有益。 3.蛋白质沉淀法 上面叙述的盐沉淀法和有机溶剂沉淀法是对很多蛋白质沉淀都有效的方法。 蛋白质沉淀法所用的试剂则仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用,

常见的有:

碱性蛋白质、 凝集素、 重金属等。

(1)碱性蛋白质 多价阳离子的碱性蛋白质,如鱼精蛋白,除能有效地沉淀核酸物质外,还 能沉淀某些蛋白质。 (2)凝集素 凝集素中研究较清楚的有植物血球凝集素。它是一种特殊的蛋白质。该物 质对糖蛋白中糖链的末端序列具有明显、特异的凝集力。 (3)重金属

重金属盐(如铅盐、 汞盐)作为蛋白质沉淀剂, 也能将蛋白质或酶得到纯化。

4.聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子 型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。 Honing 等的试验表明: 沉淀作用较满意的是分子质量在 400—6000Da 之间的 聚乙二醇。 这种沉淀的条件温和,不易引起蛋白质变性,而且沉淀较完全,因此应用范围颇 广。 5.选择性沉淀法 根据各种蛋白质在不同物理化学因子(如:温度、酸碱度、有机溶剂等)作用下稳定 性不同的特点,用选择性沉淀法,即可使杂蛋白变性沉淀,而欲分离的有效成分则 存在于溶液中(或者发生可逆性沉淀),从而达到纯化有效成分的目的。 例如:改变温度的选择性沉淀法从酵母菌细胞中纯化醇脱氢酶 即酵母干粉中加 0.066mol/L 磷酸氢二钠溶液, 37℃水浴保温 2h,室温搅拌 3h,离心收集上清液, 升温至 55℃,保持 20min 后迅速冷却,离心去除热变性蛋白,上清液即为热稳定的 醇脱氢酶溶液。 6.结晶沉淀法 蛋白质沉淀可分为晶体沉淀和无定形(非晶体)沉淀两大类,前者分子排列 有规则,后者分子排列无规则。 蛋白质结晶形成过程,实际上也是一种纯化过程。 用显微镜观察结晶的有无及形状,也可作为判断提纯物质纯化程度的一种 方法。

结晶实质上是在特定条件下,改变溶解度产生沉淀的一种方法。 三、制备核酸 从生物材料(包括动、植物组织、线粒体、叶绿体,以及微生物中的真菌、细菌和病 毒颗粒等)中分离出的 DNA 或 RNA,往往是以 DNA-蛋白质(DNP)或 RNA-蛋白质(RNP) 复合物形式存在的。 制备初步纯化的核酸: 先,将这些复合物进行解聚; 再,除去蛋白质; 然后,通过沉淀法得到核酸。 1.DNP/RNP 复合物的解聚 通常使 DNP/RNP 复合物有效解聚的办法,主要是采用加入: 去污剂、有机溶剂、蛋白水解酶等试剂来实现的。 常用的去污剂: 十二烷基硫酸钠(SDS) 十二烷基肌氨酸钠[CH3(CH2)10CON(CH3)CH2COO-Na+] 脱氧胆酸钠(deoxycholate,DOC) 聚氧乙基十六烷基酚醚(Triton X-100) 吐温 40(Tween40) NP-40,等 常用有机溶剂: 苯酚、氯仿 为蛋白质的一类变性剂。

常用蛋白质水解酶: 溶菌酶、蛋白酶 K、蛋白酶 E (1)去污剂 在破细胞的溶液中, 加入适量的阴离子去污剂 SDS 或其他去污剂,有利于使膜蛋白和脂肪溶解,将 DNP /RNP 复合物解聚,进而释放出核酸。

随后加入适量的乙酸钾溶液,以沉淀核酸抽提液中的 SDS-蛋白质及 SDS-K+等物质; 接着可采用离心方法将沉淀物除去,上清液即为初步纯化的核酸制品。 (2)有机溶剂 有机溶剂如苯酚、氯仿是蛋白质的一类变性剂。 用变性剂反复处理抽提溶液, 直至处理液经离心后,在上层水相(含核酸)和下层有机相之间的界面处(含 变性凝聚蛋白)无变性蛋白为止。 收集上层水相, 用透析法除去残留的酚和氯仿即为核酸制品。 (3)蛋白水解酶 用酶法除去 DNP/RNP 复合物中的蛋白质组分的操作比较温和, 并可避免剪切和破坏 核酸的现象发生。 常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶 K(见第一章)和蛋白酶 E(水解能力同蛋白 酶 K)。 2.多糖等杂质的消除 (1)多糖

混杂于核酸提取液的多糖类物质, 一般可用选择性沉淀剂如:异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,适用于 酸性多糖)即可达到目的。 此外,还可用等体积 2.5mol/L 磷酸缓冲液和等体积乙二醇甲醚处理,经 离心,多糖位于中部,核酸存在于上层乙二醇甲醚中 (2)DNA 与 RNA 的分离 ①盐析法 在提取 DNA 时,RNA 属杂质;反之,DNA 是杂质。这两种核酸通常可用盐析 法分开。

DNA 在 1~2mol/L NaCl 溶液中,溶解度较大; 在 0.14mol/L NaCl 溶液中,溶解度极小;

RNA 则能在 0.14mol/LNaCl 溶液中溶解 ②酶水解法 在提取 DNA 时,可用 RNase 水解 RNA 杂质。 市售的 RNase 中,有时会混入 DNase,采用 100℃热处理 15min,DNase 会 失活,而 RNase 活性不受影响。

在提取 RNA 时,可用 DNase 水解 DNA 杂质。 市售的 DNase 中,有时会混入 RNase,当有 Ca2+存在下,加蛋白水解酶 K 作用或加碘乙酸钠(使 RNase 的活性中心组氨酸残基烷化)处理,RNase 会失活,而

DNase 活性不受影响。 3.核酸沉淀 在核酸溶液中加入某些有机溶剂和非离子型聚合物等试剂时,核酸会被有效地沉淀 出来。 (1)有机溶剂 ①乙醇-盐溶液 核酸的钠盐或钾盐在多数有机溶剂(如乙醇、异丙醇)中是不溶解的。 在核酸溶液中加入乙醇-钠盐溶液就可将核酸沉淀出来。 经静置、离心,即可得到核酸。 ②异丙醇 在含 DNA(或大分子 rRNA)的溶液中, 加入 0.3mol/L NaAC 和 0.54~1 倍体积的异丙醇 放置短时间后, 经离心即可得到核酸沉淀物质,而多糖及小分 子 RNA 则分布于上清液中。 核酸经离心后集中于沉淀中,取其用 70%乙醇 洗涤,除去盐和其他小分子物质, 真空干燥后即为核酸制品。 (2)聚乙二醇 加聚乙二醇(PEG)-0.5mol/L NaCl 溶液到核酸溶液中, 可使<2kb 的 DNA 片段沉淀出 来。

用 PEG 沉淀 DNA(浓度>10μg/m1)的溶液,置 0℃,12h 以上, 尔后离心收集沉淀物, 并将其溶于 0.2mol/L NaCl 中, 接着加乙醇沉淀核酸或用氯仿抽提除去 PEG。 (3)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 在多糖含量较高的核酸溶液中, 加入 1%CTAB 和 0.35mol/L NaCl, 可得到 CTA-核酸沉淀物(多糖滞留在溶 液中)。 随后,用 0.1mol/L NaAC-70%乙酸洗涤,就能将 CTA+从沉淀物中置换出 来,和乙酸生成可溶性十六烷基三甲基乙酸铵, 离心后,十六烷基三甲基乙酸铵存在于上清液中, 而核酸形成钠盐, 70% 在 乙醇中仍为沉淀物。 第二节 应用实例 细菌染色体 DNA 的制备


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