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纤维素酶产生菌的筛选鉴定和产酶条件优化


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F O   N  E ME T INI D S RE l O DA DF R N ATO   U T IS N  

纤 维 素 酶 产 生 菌 的 筛 选 鉴 定 和 产 酶 条 件 优 化 
汤  斌 , 阿娜 ,张庆 庆  陈
( 徽 工 程科 技 学 院 生

物 与化 学 工 程 系 , 徽 芜 湖 ,4 0 0  安 安 210)

摘  要  筛 选 得 到 1 纤维 素 酶 产 生菌 T 1 根 据 真 菌 的 分 类 鉴 定 方 法 , 定 为 根 霉 属 菌 ( hz p ss . 。 正  株 C , 鉴 R i o u  p )

交 实验 确 定 该 菌 株 的 优 化 培养 条件 为 : 草 采 用 1  的 醋 酸 预处 理 , 草 与麸 皮 比为 3: , 稻 5 稻 7 固液 比为 1: , 种  3接 量 1  , O 温度 2  ̄ 稀释 1 的 Mad l 营 养 液 作 为 培养 基 液 体 。在 优 化培 养 条 件 下培 养 9 h 发 酵终 点 时滤 纸  8 C, 倍 n es 6,
酶 活 F A、 MC 酶 活分 别 达 到 2 . 、 4 .   g 干 物 质 ) 较 优 化 前 的 1 . 、 8 .   g 干 物 质 ) 别 提 高 了 P C 5 5 2 9 0 U/ ( , 7 8 1 7 0 U/ ( 分  
4   和 3  。 3 3  

关 键 词  筛 选 , 定 , 霉 , 维 素 酶 , 化  鉴 根 纤 优

运用 微 生物对纤 维类 物质进 行充 分 的酶解作 用 ,   可将 纤维 素材料 转 化成糖 、 乙醇 、 饲料 蛋 白等 , 对缓 解 

1 2 1 初   筛  . . 

对 采集 到 的 样 品进 行稀 释 、 平 板 , 长有 单 菌  涂 从 落 的平 板 中选 取典 型 的真菌 菌落转 接斜 面 , 同时 制  并 片作纯 度检查 , 不纯 , 若 应进一 步划 线分 离 , 至获 得  直

全 球能源 危机 、 品和饲料 资源 紧张 以及环 境污染 有  食
着重大意 义_ 。产纤维 素酶 的生 物种群 相 当广泛 , 1 ] 如  真 菌 、 菌 、 线 菌 等 , 内外 研 究 主要 集 中 在 木 霉  细 放 国 属、 曲霉 属和青 霉属 上口 。 目前 纤维 素酶 的生产 存   ] 在 着酶活 力低 , 生产 周期 长 等 问题 , 不 能真 正 用 于  还 大规 模工 业生产 , 因而 筛选 高 活 力 酶 、 酵周 期 短 的  发 菌株 是降解纤 维 类 物 质 的关 键 。国 内外 对 根霉 属 产 

纯 培养 体 为 止 ; 纯 培 养 体 点 种 至 初 筛 培 养 基 上 , 将  
2 ℃ 培 养 4  8 8h后 用 1rg   /mL 的 刚 果 红 染 液 染 色 2 a  

h 倾 去染 液后 再用 1mo/ ,   lL的 Na OH 溶液 洗涤 过 多  染 液 , 制酶 活性 , 抑 固定 水 解 圈大 小 。菌体 若 能分 泌 
纤 维素 酶 , 在菌 落周 围会 出现 清晰 的水解 圈 , 则 依据  水解 圈 与菌落 直 径 比值 ( HC 比值 ) 的大 小选 择 高活  力 菌株 。选取 HC 比值 大 的菌 落 移接 到试 管 斜 面上  培养 保存 备用 。  
1 2 2 复  筛 . .   

纤维 素酶 的研究 报道较 少 , 其培 养条件 的优 化 尚未  对
见 报 道 。本 研 究 采 用 正 交 设 计 实 验 优 化 了 根 霉  R io u s. 1的培养条 件 , hz p sp TC 目的在理 论上 可 以丰 

富纤 维素酶 的研 究资料 , 实践 中指导 生产及 应用 。 在  

将斜 面 培 养 物用 生理 盐 水 洗下 , 分 混 匀 , 当  充 适

1 材 料 与方 法   
1 1 实 验 材 料  . 
1 1 1 实 验 菌株   . . 

稀 释 , 备 成 孢 子 悬 液 ; 孢 子 悬 液 接 种 于 内含 5  制 将 0
mL 种 子 培 养 基 的 2 0mL 的 三 角 瓶 中 , 整 孢 子 浓  5  调

度 为 1 个/ 0 mL, 于转 速 为 1 0r mi 5 / n的摇 床 上 培养 
1  ; 2 0mL三角瓶 内添加 厚 约 1 5c 的固态发  2h 于 5   . m 酵培 养基 , 接人 种子培 养 物 , 置培养 8d 2d翻 曲 1 静  ,     次, 湿度控 制 在 7  。通 过 对 发 酵 产 物 酶 解 还 原 糖  O 产量 的测定 , 选 出酶 活性 高 的菌株进 入下一 轮 发酵  筛 产酶 条件 的研究 。鉴 定后 接种保 藏 。  
12 3 酶活 测定[ ..  

分 离 自黄 山生态林 中 , 由安徽 工程科 技学 院可 再  生 资源研究 室选 育并保 存 。  
1 1 2 培 养 基  ..

初 筛 培养基 [ C  : MC N  0g 葡 萄糖 5g 琼脂  — a1  ;  ;
2  ; a d l 无 机 营 养 盐 ( 除 有 机 物 )  0  0g M n es 扣 10 0 mL;  

自然 p H。复筛及 固 态发 酵 培 养 基 ( 化 前 ) 麸 皮 5 优 :  

g 稻 草 5g混 合 物 加 入 3  、   0 mL 的 Ma d l 营 养 盐 。 n es  
菌种保 藏培 养 基 : 萄 糖一 铃 薯琼 脂 培 养 基 。种 子  葡 马 培 养基  :0 麸皮浸 出汁 。 ] 1   
1 2 实 验 方 法  .
第一作者 : 士, 学 教授 。   *安 徽 省 高 校 自然 科学 基 金 重 点 资 助 项 目( J 0 7 1 ) K 2 0 A0 8   收 稿 日期 :0 7 1 4 2 0 一O —0 ,改 回 日期 : ∞ 7 0 — 2   2 — 3 2

1 3 实 验 设 计  .

在对 根霉 R io u  p TC h zp ss . I发 酵特 性 初 步 了解 

的基础 上 , 用 L 3 ) 采  (  正交表 优 化培养 条件 , 具体 因 
素 和 水平安 排 如表 1 。用统 计 分 析 软 件 S   . AS 8 2对 

实 验数 据进 行方差 分析 。  

6J    

! .!壁 .    !   !  

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表 1 正 交 实 验 设计 因 素 和水 平 取 值 表   

《 菌鉴 定手 册 》  定其 分类 学地位 。 真 _ l确 8  

在 P A 培 养基 上 菌 落初 期 白 色 , 熟 后 灰 褐 色  D 老
或 紫黑 色 。匍 匐 菌 丝 弧形 , 色 , 四周 蔓延 。 由匍  无 向 匐菌 丝与基 物 接触处 长 出假根 , 假根 非 常发达 , 多枝 ,   褐 色 。在假 根处 向上 长 出孢 囊 梗 , 直立 , 每丛 有 2   ~4 条 成束 , 少单 生或 5 7条 成 束 , 分 枝 , 灰 色或  较 ~ 不 暗 暗褐 色 , 5 0   0  m。顶端 形 成 孢子 囊 。孢 子  长 O ~35 0
注: 预处理, 将稻草分别以 1  的醋酸 、 的 H S 4和 1 5 的 Na H浸  5 2   zO .  O

囊 球形 或近 球形 , 期 黄 白色 , 熟后 黑 色 。孢 子 囊  初 成 内囊轴 明显 , 球形 , 部 与 柄 相 连 处形 成 囊 托 。孢囊  基 孢 子球形 、 卵形 , 棱 角或线 状条 纹 。根 据《 有 真菌鉴 定  手 册 》 定 TC 鉴 I为 毛 霉 目、 霉 属 菌 ( hz p s 根 R io u 
s .)   p 。

泡 , 11 蒸 煮 2h , 高温 2 ̄ C   后 承流清洗 至中性 。  

2 结 果 与 分 析   
2 1 菌 种 鉴 定  . 

根据 真菌 的分类 鉴定 方法 , 观察 筛选 得到 的菌 株  TC 孢 子囊 形 态 、 丝 形 态 以 及 菌 落 形 态 等 , 照  1 菌 对

2 2 正 交 实 验 结 果 及 方 差 分 析 结 果  .

表 2 正 交 实 验 结 果 

从 表 3中可 知 , P   值 一0 0 9 、 MC P 值  F AP .00 C  


响因子 的顺 序不 同 , 培养 条 件 最 佳组 合 相 同 , 明  但 说
TC 所 产 纤 维 素 酶 各 组 分 的生 物 合 成 是 协 同进 行  I
的。  

00 5 , . 0 0 均小 于 0 0 , 交 实验 在 0 0 水 平 具 有  .5 正 .5

统 计学 意义 。因素 z 、   z 、   z   z 、 。 z 、  的 P值 均 小 于 
0 0 , 明 z 、  z 、    这 5 因素对 实 验 结 果  .5说  z 、。 z 、 个
有 显著影 响 。  

2 3 验 证 实 验  .

在完 成 了第 1轮正交 实验后 , 到 2 优化 方案  得 个 A   CDEF       。和 A  3   。 z z B C D E F 。各方 案 的优 劣还 

从表 2中可 知 , 验组 1  P 及 C 实 2F A MC均 为最  高 , 培 养 条 件 最 佳 组 合 为 A B C D E F ; 于  其   。 z z  。对 F A 而言 , 因子 的重要 程 度 依 次是 B A> E C P 各 > >  

需实验 进 一步验 证 , 实验 结果  表 4  。
表 4 验 证 实 验  u g 干物 质 ) /(  

>D>F, 培养条 件最 佳组 合为 A  3   3 z z 对于  BcDEF ;
C MC而言 , 因子 的重要 程度 依次 是 B A> D C 各 > >  

> E F,培 养 条 件 最 佳 组 合 为 A B c D E F 。 以  >   3  3 2 z
上结 果表 明 , 于纤 维 素 酶 的不 同组 分来 说 , 对 虽然 影 

堡  鲞 鱼f蔓 塑i  苤 蔓 塑璺   ! 7  

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纤 素 酶 ! 相. 主 要 是 由式关 键。糸 生n  维 至 基 : 2   于 ,产A、  酶 活  用 培    :- A B . 4 本当 所' 的 I- :a E ̄ I
…  



参考文献     。
1 吉海平, 王风斌. 浅谈微生物在秸杆生物学转化中的应用   []生物工程进展,971 ()5 ̄5 J. 19 ,72:6 9   2 iZ ag C i n  o L- w n uFc r aet g  Qn hn , h Mi L , u ag - at s fc n    — g K J o  f i f mn 。  。 o i a g h   。 “ 。 。 。  。 y        m 吣  Ⅲ^d “ 。    r s   C3[ . i e “c T cnl y20 ,   。 e eR -0J B。 s r eho g , 7 。:   ei ] r。 e o 0 3 Y k I d E 。 k P  k. N 。  ki0 k   。 。 ,      。 ke  .    Y  v    d .Bi   、e

相 同 ; 次 , 要 因素 C虽 差 异 较 大 , 在 灭 菌 过 程  其 重 但 中, 可避免 地使 2者 缩 小 了差 异 , 而 影 响亦 不 明 不 故   显; 从一 般 因素 D、 E分 析 , 由于 D 以 C量 计 , 2组  故 实验 中 D 值 完 全相 同 。E值 影 响 亦 不 明显 , 能 与  可 环境及 仪器精 密度 有 关 ; 次要 因 素 F对 实 验 结 果 影  * / 、 这与 刘小 杰  实 验分 析 结果 吻 合 , J  ̄d , 。   即过多 的 

N源 易使菌体 大量 繁殖 , 抑制 了纤维 素酶 的分泌 。从 
节约成 本角度 考虑 , 后续 实验 以稀 释 1倍 的 Ma d l n es   营养盐 添加 到麸皮 与稻草 混合体 中 。  

s n。 i f o  

t f 。pp t 1   。。f  。 。g i    。i i i   d   

tri    b 。  

b d  a o b  e im nos ugs s盯 i “ l e e tr y h l etu  n u A  gl s 盯 a rc t fa f   l    []B rs r   eho g ,069 : 00  3 J. i e  c T    l y20 , 1 3~1 5 o o e o 7  0 

3 结

论 

i  

ku i O
。   。

n    。v

,  

V  V   ov,   l The S    V  e k   e  a   l   t .   e -
,, 。 ,  

尸  



() 1 筛选得 到 1株 纤维 素 酶产 生 菌 TC , 据 真 1根 菌 的分 类鉴定 方法 , 观察 T C1的孢 子囊 形 态 、 菌丝 形  态 以及 菌落形 态 等 , 据《 菌 鉴 定 手 册 》 定 T   依 真 鉴 C1 为根霉 菌  咖 ss. n  p ) 
… … …  

tn   i nacd r ut n f eu s   dX l a一 at wt E hne  o co    l l e a   y ns s h P d i oC la s n a   e[]Mi oioy20 , : 4 ~16 sJ. c b l ,05 r og  4 11 4   陈阿娜? 一种改进的纤维素分解菌鉴别培养基[] 生物学 J?  


4 8 ̄ 4 9

( ) 根 霉 P i。 “  p T 1发 酵 产 纤 维 素 酶  2对 hz   ss? C 的培养 条件进 行优 化 , 到 最佳 培 养 条 件组 合 为 : 得 稻 
草 采 用 1  的醋 酸 预 处 理 , ( 草 ): ( 5 m 稻 m I ) 3 R皮 一  

6  

产  


华 . 色 木 霉在 稻 壳 和 麸 皮 混 合 基 质 上  绿

素  

。 [ 研   

’  

. 

, 

2。 3 ( ): ~ 1   04 o 1 9 2
7 M e    d1  M,   o i , oh  M e A det  R  e tR C  


e e  o   a - m  t f s c  

: , 7 固液 比 一1: , 3 接种 量 1  , 度 2  ̄ 采 用 稀  O 温 8C, 释 1 的 Ma d l 营养盐 作为培 养基 液体 。 倍 n es   ( ) 菌 株 在培 养 基 上 能够 快 速 生 长 , 酵 9 h 3该 发 6 

ca fn eu s [] B t h o Bon  y p 96 hry gcI 1 e J. i e nI i gS m ,17 , ii 1o oc   e   ()2 ~3  6 :1 3 8 魏景超. 真菌鉴定手册[ . M]上海 : 上海科学技术出版社,  

即达到 酶 活 高 峰 期 , 绿 色 木 霉 酶 活 高 峰 期 提 前  较
4 h 缩 短 了 发 酵 周 期 , 酵 终 点 时 滤 纸 酶 活 F A、 8, 发 P   C MC 酶 活 分 别 达 到 2 .  g 干 物 质 ) 2 9 0u/ 5 5u/ ( 和 4.   

17?0 5 996 ̄7  
9 刘 小杰 , 国庆 , 和? 氏木 霉 Z5 维素酶发 酵培养 何 陈启 康 J纤   基的优化 []浙江大学学报 ,033()63 2  J. 20 ,   :2 ̄68 7

S re n c e ni g,I ntfc to   fCe l l s - r d c i n S r i   n   tm i a i n de ii a i n o   lu a e p o u to   t a n a d Op i z to   o   t  r e t to   nd to s fI s Fe m n a i n Co ii n  

Ta g Bi Ch n An ,Z a g Qi g ig n   n, e   a h n   n qn  

ABS TRACT 

On   el l s — o c i n s r i  e c lu a e pr du to   t a n TC1 wa   c e ne . twa  d ntfe   sRhi o   ss r e d I  si e iid a   z puss b s d o  —   p. a e   n i  

d n iia i n m e ho   ff ng . h   tm ie   e m e t ton c dii ns d t r i e   y orhog na  sgn w e e: e tfc to   t d o   u i T e op i z d f r n a i   on to   e e m n d b   t o lde i   r  

sr w  o e ( r te tdb   5 a e i a i) ta p wd r wh a  rn( ta p wd r p er ae   y1   c t  cd ,srw  o e / e tb a 3:7 c ),s l  u sr t/ iud n ti oi s b ta e l i  u r   d q —
me t( :3),a   u ntt    no u a i n 1 nd q a iy ofi c l ton( 0 ),2 1  8℃ ,a d haftme d l e   a e swa   s d a  i i  u— n   l i   iut d M nd l  s u e   slqu d n     ti e . rm nt The m a m u a tvii s o   it r a e   nz m e(   xi m  c i te   f fle  p p r e y FPA) a d c r x n   a bo yme h   e l o e nz m e( t ylc lul s  e y CM C)  

wee 2 .5 2 9   g d y me i m,r s e tv l  n e   h   p i z d fr n ain c n i o s a tr 9 h, r  5 , 4 .0 U/   r  du e p ciey u d r t e o tmie   eme tto   o dt n   fe  6   i
whc   e eic e s d b   3 ih w r  n r a e   y 4   a d3  n  3 ,r s c i ey c m pa e   ih t e i ta  n e pe tv l   o r d w t   h  nii lo e
. 

Ke   y wor s d 

s r e n i e tfc to c e ni g,d n iia i n,Rhi o z puss .,c lul s o i ia i n  p e l a e, ptm z to  

8『0V1 .(t2) 2   .N6ol4 —7o3o Ta3  0 3—  


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