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waters天津培训资料


吴园生
Waters Asia Headquarter

如何快速建立稳定可靠 的液相色谱分析方法

纲要
? 何谓理想HPLC色谱柱? ? 现代液相柱的选择技巧 ? 系统、快速液相色谱方法开发策略 ? 色谱柱生产流程对分离重现性的影响 ? 总结

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1

理想液相色谱柱的衡量标准
? 峰形佳、柱效好 – 对任何分析物 (酸性, 碱性和中性) ? 柱寿命长 – 不同pH和柱温下均有良好表现 ? 色谱分离可轻易放大 – 从分析规模直接放大至制备规模 ? 分离表现高度重现 – 柱与柱间、不同批次填料间和不同粒径填料间均需如此 ? 柱产品质量的可溯源性和柱生产流程是否符合最新GMP规范 ? 价格适中

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为何峰对称性是理想色谱柱的首要判据? 峰形不佳将导致 方法开发难度加大、过程拖长 分析结果不一致 色谱分离度不足 检测灵敏度降低

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2

峰形不佳的后果

积分不准 分离度降低 灵敏度不足

0

5

10 Minutes

15

20

25

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峰形不佳对积分准确度的影响

拖尾因子 = 1.00 积分后定量结果 99.9 % 99.8 % 99.6 %

拖尾因子 = 1.58 积分后定量结果 97.8 % 95.3 % 92.3 %

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3

峰形不佳对峰分离度的不良影响

Rs = (tr Peak 2 – trPeak 1)/ 0.5 (w4.4% Peak 1 + w4.4% Peak2) Rs = (11.5-10.6)/ 0.5 (2.0 + 0.5) Rs = 0.72

注: 基线分离需Rs不小于1.5

0

5

10 Minutes

15

20

25

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峰形不佳对检测灵敏度的影响: Tamoxifen (它莫西芬)

0.0004

C18 品牌 A

信噪比 A 11.0 B 6.5

AU 0.0000 5 Minutes 0.0004 10

注: 对信噪比的要求 LOQ (最低定量限)>10 LOD (最低检测限>2

AU 0.0000 5

C18 品牌 B

Minutes

10

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纲要
? 何谓理想HPLC色谱柱? ? 现代液相柱的选择技巧 ? 系统、快速液相色谱方法开发策略 ? 色谱柱生产流程对分离重现性的影响 ? 总结

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以传统方式制造硅胶色谱填料的过程: 起始原料为矿物硅酸盐(如泡花碱)

Na2SiO3 (矿物) + 2H+

Si(OH)4 (silicic acid)+ 2Na+

硅胶颗粒 (含金属杂质!) C18/C8 bonding + endcapping C18/C8 Reversed Phases (最终仍带金属杂质!)
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5

硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响

质子酸

O O Si HO O Si
HO

O

+

_

Si Si O Al O

O Si OH

金属嵌入硅胶晶格中,使硅醇基的酸性大大增强
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硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物 Hinokitiol峰形的影响
流动相:20 mM Phosphate Buffer pH 3.6 (含 0.05% EDTA): Acetonitrile (50:50)

低金属杂质
O O Si O M n+ O

Si

高金属杂质含量
2
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4 Minutes

6

8

6

传统型C18硅胶柱上金属杂质 对碱性化合物峰形的影响

Propranolol and Butylparaben

流动相 pH 7

Naphthalene

铝杂质含量 ~375 ppm Acenaphthene Tf USP = 6.5 Amitriptyline

5

15

25 Minutes

35

45

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碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理
与键合相的疏水性作用
O-Si O-Si OH O-Si O-Si OH O-Si OH O-Si O-Si O-Si OH O-Si O-Si

双重保留机理:1). 与键合相的的疏水性作 用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
O-Si O-Si 离子交换作用 OO-Si O-Si + O- (CH ) HN 32 O-Si O O-Si O-Si O-Si O当流动相为 pH6O--Si 8时, 硅醇基带负 O-Si

当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离)

+ HN(CH3 )

2

电性(大部解离)
Base Base 对碱性化合 物的保留及 严重拖尾

两实验使用相同的传统C8硅胶柱
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7

既然pH< 3时硅醇基离解受抑制,为何不在所有 情况下采用酸性条件进行分离?
低pH可导致分离选择性的完全丧失!
0.04 U A 0.02 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 Minutes 8.00 10.00

pH 2.0

0.04 0.03 U A 0.02 0.01 0.00 0.00

nortriptyline

pH 7.0

amitriptyline

1.00

2.00

3.00

4.00 Minutes

5.00

6.00

7.00

8.00

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金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化,以至某 些碱性化合物在酸性条件下仍呈现拖尾峰

分析物: Chlorpheniramine 流动相 : 乙腈/KH2PO4 pH 3.0 (20:80)
4

拖 尾 因 子

“高纯硅胶 ”区
3 2 1 0 100 200 杂质铝含量, ppm 300 400

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8

如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题?

? 从修饰流动相着手改善峰形(例如使用竞争性碱 TEA或离子对色谱) –1970-1980年代策略 ? 从改善反相填料着手降低硅醇基活性 –自1990年代起至今

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Waters现代色谱柱三大技术平台
超纯硅胶柱
– Symmetry? C18/C8 – SymmetryShield? RP18/RP8

亲水性化合物专用柱
– Atlantis? dC18 – Atlantis? HILIC 柱

杂化颗粒柱
– XTerra? MS C18/C8 – XTerra? RP18/RP8

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Symmetry? 系列超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成过程

无金属杂质的超纯起始原料

Polyethoxysilane (PEOS)
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Tetraethoxysilane (TEOS)

常见品牌C18柱在pH7下的性能比较
Acenaph 品牌 Symmetry C18 Inertsil ODS-2 Puresil C18 Zorbax Rx C18 Purospher RP-18 Kromasil C18 Alltima C18 Nova-Pak C18 Nucleosil C18 Hypersil ODS Zorbax ODS k' 16 16 14 16 16 19 23 16 15 11 21 Amitrip/Acenap Amitriptyline 拖尾因子(美国药典法) α 1.3 1.4 1.5 1.8 4.8 1.5 3.5 2.3 4.3 2.8 无法测得结果! 1.9 2.5 3.3 6.0 6.0 9.4 13 5.5 10 10

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10

常见品牌C8柱在pH7下的性能比较
Acenaph 品牌 Symmetry C8 Lichrosphere selectB Inertsil C8 YMC basic Puresil C8 Zorbax Rx C8 Kromasil C8 Altima C8 k' 7.8 5.9 7.6 3.7 7.5 5.5 8.2 6.1 Amitrip/Acenap Amitriptyline 拖尾因子(美国药典法) α 1.7 3.7 1.8 2.1 2.1 6.7 2.1 4.4 1.6 2.2 2.3 2.8 2.9 6.0 6.9 7.0

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在pH3下的柱性能测试条件
流动相: 50 mM pH 3.00 KH2PO4/H3PO4 : ACN(80:20 v/v)
N NH+ O OH + NH2

Cl

Chlorpheniramine (有机强碱, pKa 9.1)
O O- OH O

Propranolol (有机强碱, pKa 9.6)
O NH2

Maleate (有机强酸, pKa1 1.8, pKa2 6.1 )
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Toluamide (中性物质)

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常见品牌C18柱在pH3下的性能比较
柱品牌
Symmetry C18 Purospher RP-18 Toluamide Chlorph/Toluam Chlorpheniramine k' 拖尾因子(美国药典法) α 1.4 3.4 1.3 1.4 0.71 1.4

Kromasil C18
Alltima C18 Inertsil ODS-2 Zorbax Rx C18 Puresil C 18 Nova-Pak C 18 Nucleosil C18 Zorbax ODS Hypersil ODS

1.8
2.4 1.7 1.4 1.6 1.3 1.8 1.7 1.5

3.6
3.2 2.9 3.3 3.6 3.9 4.2 4.9 11

1.5
1.8 1.9 2.0 2.9 2.6 3.9 4.6 11

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常见品牌C8柱在pH3下的性能比较

柱品牌 Symmetry C 8 Alltima C 8 Inertsil C8 Puresil C 8 kromasil C8 Zorbax Rx C8 YMC Basic LiChrospher RP-select B

Toluamide Chlorph/Toluam Chlorpheniramine 拖尾因子(美国药典法) k' α 1.4 2.2 1.2 2.0 2.9 1.2 1.4 1.5 1.8 1.5 1.0 1.7 2.6 3.0 3.4 2.5 3.8 2.9 1.3 1.4 1.6 1.6 1.8 1.9

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常见品牌柱在pH3和 pH7下的峰形优劣排序

对碱性化合物的峰对称性
pH 7 Symmetry Inertsil LiChrospher RP select B YMCbasic Puresil Purospher Zorbax Rx Nova-Pak kromasil Alltima Nucleosil Hypersil Zorbax
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pH 3 Symmetry Purospher Alltima Inertsil kromasil YMCbasic Zorbax Rx LiChrospher RP select B Puresil Nova-Pak Nucleosil Zorbax Hypersil

(极佳)

(差)

用液相色铺柱全行业最严苛的流程 进行生产与测试

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无与伦比的色铺柱批间分离重现性

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无与伦比的色铺柱批间分离重现性
来自色谱科学家的研究结论
Repeatability and Reproducibility of Retention Data and Band Profiles on Reversed-Phase Liquid Chromatographic Columns: Results Obtained with Symmetry C18 Columns Journal of Chromatography A, 830 (1999) 55-79

Marianna Kele (田纳西大学) & Georges Guiochon (橡树岭国家实验室)

“…当Symmetry? C18同批号柱与柱间保留时间差异在 0.1%之内、不同批号间柱间的差异在1%之内时,继续要 求更精准的保留时间无异于苛求。” “…要在以上色谱柱上达致更优异的色谱保留重现性,很 可能需要从所使用的仪器硬件本身着手进行系统优化。”
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杰出的柱床稳定
与保护柱同时使用, 可达致10,000次的进样次数

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Waters现代色谱柱三大技术平台
超纯硅胶柱
– Symmetry? C18/C8 – SymmetryShield? RP18/RP8

亲水性化合物专用柱
– Atlantis? dC18 – Atlantis? HILIC 柱

杂化颗粒柱
– XTerra? MS C18/C8 – XTerra? RP18/RP8

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Atlantis? dC18 柱的成功秘诀
表面峰端

峰形

键合相连 接方式

柱寿命 防微孔脱水 保留性能

微孔大小

键合密度

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Atlantis? dC18柱对极性化合物的优异保留性能
尿嘧啶(Uracil) 是测试反相柱最广泛采用的死体 积标记物, 但在Atlantis? dC18柱上具显著保留
Conditions Column: AtlantisTM dC18 4.6 x 150 mm, 5 ?m Mobile Phase A: H20 Mobile Phase B: ACN Mobile Phase C: 100 mM CH3COONH4, Flow Rate: 1.0 mL/min Gradient: Time Profile (min) %A %B 0.0 90 0 10.0 84 6 Injection Volume: 10 ?L Temperature: 30 oC Detection: UV @ 254 nm Instrument:: AllianceTM 2695, 2996 PDA 1 V0 = 1.83 min Compounds: 1. Cytosine 2. 5-Fluorocytosine 3. Uracil 4. 5-Fluorouracil 5. Guanine 6. Thymine 7. Adenine

pH 5.0
%C 10 10

对嘌呤碱表现良好峰形(因 对填料进行了彻底封端)
7

4

5 2

6

3

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00 Minutes

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

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16

Atlantis? dC18 Column:
揭开人类酿酒历史之谜 (2004)

古埃及十二世王 Tutankhamen (约公元前 1346-1327)

1922年发掘Tut王墓葬时所发现的具象形 文字的残片, 疑为盛酒器皿上的标签说明 Tartaric Acid (酒石酸) Syringic Acid (丁香酸): 是红葡萄中的两个内源性标记物

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Atlantis? HILIC Silica
? HILIC Silica 柱用于在Atlantis dC18柱上依然无有效保留的 场合 ? 分离机制为“反反相色谱”技术 ? HILIC Silica 柱与Atlantis dC18柱上的出峰顺序刚好相 反 ? 由于使用含高有机溶剂成分的 流动相进行分离,在LC/MS应 用中的检测灵敏度比Atlantis dC18柱上显著提高 ? 可直接将样品溶于纯有机溶剂 中进样,省却了将样品溶剂蒸 干再定容的麻烦。
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Waters现代色谱柱三大技术平台
超纯硅胶柱
– Symmetry? C18/C8 – SymmetryShield? RP18/RP8

亲水性化合物专用柱
– Atlantis? dC18 – Atlantis? HILIC 柱

杂化颗粒柱
– XTerra? MS C18/C8 – XTerra? RP18/RP8

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高纯硅胶柱可用于解决您 所有的应用难题吗?

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18

突破高纯硅胶柱局限性的必要性
需要全新的柱技术
40

硅胶柱pH适用极限
碱性化合物 具良好峰形 但保留不足 对碱性化合物的保留增强, 但需严格控制流动相pH 值。封端不佳的反相柱会 面临峰拖尾的问题。 碱性化合物呈 中性,保留强, 峰性佳。

30

k
20

10

硅醇基完全解离, 硅醇基未解离 硅醇基解离,带负电荷
3 4 5 6

硅胶基体逐步溶解!
8 9 10 11 12

0

0

1

2

pH

7

Nortriptyline

Amitriptyline

pH 2
0
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pH 10
3 0 1 Minutes 2 3

1

Minutes

2

杂化颗粒柱技术
突破硅胶柱应用禁区的有力手段
优点 无机基质 (C18 –硅胶) 有机基质 (高聚物)
? 机械强度高 ? 柱效高 ? 保留稳定 ? 很宽的pH应用范围 ? 无离子型作用 ?化学稳定性好

缺点
? 有限的pH应用范围 ? 对碱性分析物拖尾 ? 化学不稳定性 ? 机械强度不佳 ? 柱效低 ? 保留行为难以预测

杂化颗粒技术(具硅-碳键机制)
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19

杂化颗粒柱(XTerra?)的合成过程示意

Waters 专利技术 荣获2000年全球 R&D 100 大奖

硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
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四乙氧基硅烷 (TEOS)

甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS)

硅胶颗粒与杂化颗粒键 合后的表面结构比较

C18键合硅胶材料 含?自由硅醇基
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C18键合杂化材料 含1/3自由硅醇基 (比硅胶材料少约一半)

20

基于杂化颗粒的Xterra RP18柱与普通C18硅胶柱 在分离酸性、碱性化合物时的拖尾因子比较

2.5

Modern C18
USP Tailing 2

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Nicotine Nortriptyline Propranolol Methamphetamine Amphetamine Ibuprofen Benzoic Acid Salicylic Acid

1.5

12345678

12345678

123456

123456 123 678

1

pH 2.5 (3.5)
MeCN 20 mM KH2PO4/

pH 4.5
MeCN 10 mM CH3COONH4

pH 7
MeCN 20 mM K 2HPO4

pH 7
MeOH 20 mM K 2HPO4

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为何杂化颗粒柱可增强在高pH下的柱寿命?
Surface modified Silica Particles XTerra? Hybrid Particles

普通硅胶柱

基于杂化颗粒的Xterra 柱

? 硅胶快速溶解 ? 严重的柱失效 ? 柱寿命短暂

? 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速 度明显减缓 ? 柱寿命大大延长

pH
pH 10
MeCN 20 mM Na2B 4O 7

10

XTerra

21

各种基体的液相柱在高pH媒体中溶解速率的比较

基体溶解度曲线
液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔, 由此而造成色谱峰畸形、分叉。

240220200180160140120100806040200-

基体溶解度 (ppm)

现代超纯硅胶柱适用范围pH 2-8 传统硅胶柱适用范围pH 2-7

杂化颗粒柱适用范围pH 1-12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12

pH
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杂化颗粒柱对创建稳定可靠的 HPLC分析方法的独特价值
稳定保留区
100
Note: Column Particle, Temperature and % Organic Held Constant

稳定保留区

10

k
1

0.1 0 2

硅胶柱
4

Xterra杂化颗粒柱
6

pH

8

10

12
Lidocaine

14

Acetaminophen Doxepin

Ibuprofen Imipramine

Nortriptyline p-Toluamide

Mobile Phase: 35% MeCN, 65% 20 mM Buffer
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Dibucaine
(局部麻醉药-碱性化合物)

O H3 C O N N N

CH3 CH3

文献 pKa = 8.9

SDS: 表面活性剂/ 离子对试剂 TEA: 竞争碱 为对抗峰拖尾而加入?

? ? ?

美国药典USP 28 上所推荐的色谱方法 淋洗剂: 1.2 g 十二烷基磺酸钠 (SDS), 0.2g 醋酸钠, 2.0 ml 三乙基胺溶于 300 ml 水中, 调pH 至 5.6,然后加700 ml甲醇 3.9 x 300 mm L1 柱,要求 拖尾因子<3.0

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用杂化柱在高pH下分析Dibucaine 拖尾问题迎刃而解

分析柱: XTerra? RP18, 4.6.x 150 mm, 3.5 ?m 检测波长: 254 nm 流动相: 50% ACN/40% Water/10% aqueous 100 mM NH4HCO3, pH 10.3

? Good Peak Shape ? No Additives ? Simple mobile phase USP TF 1.02

0
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6 Minutes

12

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Altretamine
(三嗪类抗癌药物-强碱性化合物)

CH3 N H 3C N N H 3C N N

CH3 N CH3

正确的做法是用碳酸氢铵而不是 碳酸铵来配制缓冲液 pH 需要控制在± 0.05范围内

pKa = 10.3

CH3

?

美国药典USP 28 上所推荐的色谱方法

? 流动相: 制备甲醇与缓冲液的混合液(790 mg 碳酸铵(NH4)2CO3溶 于1000mL水中,调节pH至8.0 ± 0.05) (65:35) ? 色谱柱: 一根以USP L1填制的 4.6-mm x 30-cm 分析柱。 USP 拖尾 因子不得大于1.5。

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用杂化柱在高pH下分析Altretamine 柱寿命、峰拖尾和方法重现性问题迎刃而解

分析柱: XTerra? RP18, 4.6.x 150 mm, 3.5 ?m 检测波长: 227 nm 流动相: 50% ACN/40% Water/10% aqueous 100 mM NH4HCO3, pH 10.0

USP TF = 1.08

0

6 Minutes

12

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Waters现代色谱柱三大技术平台
超纯硅胶柱
– Symmetry? C18/C8 – SymmetryShield? RP18/RP8

亲水性化合物专用柱
– Atlantis? dC18 – Atlantis? HILIC 柱

杂化颗粒柱
– XTerra? MS C18/C8 – XTerra? RP18/RP8

Symmetry? C18/C8 与 SymmetryShield? RP18/RP8 XTerra? MS C18/C8 与 XTerra? RP18/RP8

究竟有何区别?

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具极性嵌入基团的反相填料结构示意

O Si CH3 CH3

极性 基团

极性嵌入基团键合配体
O Si CH3 CH3

传统直链型烷基键合配体
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极性嵌入基团的可能作用机理
极性嵌入基团有利于增加在硅胶表面的水分子浓度。通过水分子与残余 硅醇基和极性嵌入基团间的氢键作用而将带负电荷的残余硅醇基完全屏 蔽起来,进而保证碱性化合物的峰形比直链型烷基键合相C18/C8更佳。
O H
O Si O O

H

O
H3 C Si O Si O O CH3 C C C O

O C N H (CH2 )7 CH3

O

无额外离子交换作用 降低对碱性化合物的保留 减少峰拖尾 可以100% 水相进行色谱分离
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具极性嵌入基团的键合相一览

高纯硅胶基体 pH 2 to 8

杂化颗粒基体 pH 1 to 12 XTerra? MS C8 XTerra? MS C18 XTerra? RP8 XTerra? RP18

常规直链型烷 基键合相 具极性嵌入基 团键合相

Symmetry? C8 Symmetry? C18 SymmetryShield? RP8 SymmetryShield? RP18

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极性基团嵌入技术(屏蔽技术)的历史沿革
? 1990: Supelcosil? pKb-100 (嵌入酰胺键), 专利 (两步合成法) ? 1992: Prism? RP (嵌入脲结构) 和 Supelcosil? LC-ABZ (两步合成法) ? 1993: Supelcosil? ABZ+Plus (两步合成法) ? 1995/1996: Waters SymmetryShield? RP18/RP8(氨基甲酸酯结构), 专利(一步合成法) ? 1999: Waters Xterra? RP18/RP8 (氨基甲酸酯结构),专利(一步合成 法) ? 1998/1999 (Supelco放弃了基于酰胺键嵌入技术的两步合成法专利): – Discovery? RP Amide C16 (一步合成法) – 许多其他公司开始仿制.

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两步合成法生产屏蔽型固定相的技术缺陷
? 原料易得,工艺简便: 所使用的苯丙胺基硅烷 aminopropyl silane 和长链酰氯均为现成工业原料 ? 合成反应后期的立体禁阻效应使得硅胶表面残余丙胺 基,以此类填料制备的色谱柱将对酸性化合物产生额 外的阴离子交换作用,导致该类分析物的保留反常、 峰形强烈拖尾 ? 严重的色谱柱批间重现性问题

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两步合成法制备屏蔽型固定相的技术路线
OH OH OH Cl Si

硅胶表面胺基化
NH 2 Cl
O

+

Cl

O O

Si
O

NH 2

+
O C (CH 2)n

C Cl

(CH 2)n

CH 3

酰胺化反应
CH 3

O Si O N H

OO O O
Si

酰胺基
NH 2

注:合成反应后期的 立体禁阻效应使得硅 胶表面残余丙胺基!

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在pH 3.0下测试 有机酸、碱和中性化合物的色谱峰形
H H3C H N N CH3

H OH

+

+N
H O
Cl

H HOOC

CH3

O NH2

+

- OOC

H

Chlorpheniramine pKa = 3.6, 9.2 Base: Positive Charge

Propranolol pKa = 9.6

Maleic Acid pKa = 1.9, 6.3 Acid: Negative Charge

Toluamide

Base: Positive Charge

Neutral: No Charge

流动相: 50 mM H3PO4-KH2PO4 pH 3.0/Acetonitrile (80/20)

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28

在Supelcosil? ABZ+PLUS上的测试结果

流动相: 50 mM H3PO4-KH2PO4 pH 3.0/Acetonitrile (80/20) Chlorpheniramine

Note: 对碱性化合物的峰形颇佳
Propranolol
4 6 Minutes

Maleic Acid

?

0

2

Toluamide

8

10

12

14

注: 使用两步合成法制成的分离柱含残余胺基, 导致酸性化合物的峰形强烈拖尾。
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何谓一步合成法?
? 较为昂贵的流程: 无现成原料。需在进行硅胶表面键合 前,先人工合成含有嵌入基团的长链一氯硅烷化合物 ? 含有极性嵌入基团的长链一氯硅烷化合物可与硅胶表 面一步到位完成键合反应
– 重现性最佳的屏蔽型键合相合成科技

? 一步合成法制成的色谱填料完全避免了表面残余胺基
– 无阴阳离子交换作用,因而同时保证了对酸性和碱性化合物 的色谱峰形

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一步合成法制备屏蔽型固定相的技术路线
含极性嵌入基团的长链有机氯硅烷 (需人工专门制备)

O Si O O

OH

O H3 C Si Cl CH3 O C N H (CH2 )7 CH3

+
H3 C

氨基甲酸酯嵌入基团
O C Si O Si O O O CH3 O N H (CH2 )7 CH3

+ HCl

注: 一步到位,全无表面残余胺基 (Waters专利技术)!
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在SymmetryShield? RP18柱 (采用一步合成专利技术)上的测试结果

流动相: 50 mM H3PO4-KH2PO4 pH 3.0/Acetonitrile (80/20) Chlorpheniramine Propranolol
6 Minutes 8 10 12

0

Maleic Acid
2

Toluamide
4

14

一步合成专利技术的威力!
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30

多种品牌色谱柱对碱性化合物的峰形比较
?Bondapak? C18 Waters Spherisorb? ODS2 Nova-Pak? C18 Waters Spherisorb? ODSB YMC-Pack? ODS-A YMC-Pack? Phenyl Zorbax? Extend C18 Nova-Pak? Phenyl YMC-Pack? Pro C18? Symmetry? C8 Symmetry? C18 YMC-Pack? Pro C8? Nova-Pak? CN HP YMC-Pack? CN Zorbax? Bonus RP Luna? C18 Polaris? C18-A Discovery? RP Amide C16 Supelcosil? ABZ+Plus Luna? C18(2) YMC-Pack? PolymericC18? SymmetryShield? RP18 SymmetryShield? RP8 XTerra? RP18 XTerra? RP8 1 10 9 6.4 5.6 5 4.3 3.4 2.6 2.4 2.1 1.9 1.8 1.8 1.8 1.6 1.5 1.4 1.4 1.4 1.2 1.2 1.1 1.1 1.1 1.1 3 5 7 9

USP Tailing Factor (amitriptyline, pH 7)
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四种填料的分离选择性比较
Symmetry? C18 与 SymmetryShield? RP18 XTerra? MS C18与 XTerra? RP18

互为补充,珠联璧合!

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31

SymmetrySheildTM与SymmetryTM间 显著不同的分离选择性

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极性嵌入基团键合相小结

– 主要为改善峰型而设计 – 可用于100%水相分离 – 提供与常规C8和C18很不相同的分离选择性 – Symmetry vs Symmetry Shield – Xterra MS vs Xterra RP

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32

三大色谱柱技术平台为您提供对 不同分析问题的最佳答案
超纯硅胶柱
– Symmetry? – SymmetryShield ?

极性、亲水性化合物 专用柱
–Atlantis? dC18 –Atlantis? HILIC columns

杂化颗粒柱
–XTerra? MS C18/C8 –XTerra? RP18/RP8

pH 2
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pH 8 2 8 1

pH 12

如何配置最恰当的优质色谱柱? 从您的应用课题着手…
是 样品是否水溶性强? (样品是否在使用极少溶剂的流 动相时仍在靠近死体积处出峰?) 否

Atlantis dC18 At pH 2-8
仍无满意保留?

Atlantis HILIC At pH 2-5

我对低pH流动相 中的分离较为熟悉 。我的样品在低 pH流动相中的分 离并无多大困难, 我所关心的方面是 碱性化合物的峰形 以及方法分离的重 现性。

我的样品较复杂, 所以 需要一两根‘全能型’ 的色谱柱,以便考察 样品在低pH、高 pH 情况下的分离状况。

?2005 Waters Corporation

33

Waters 色谱柱应用文集:
查看可直接借鉴的应用范例 从您当地的Waters分公司索要,或登录www.waters.com 然后输入相应的出版号以便下载电子版(PDF格式)。

720000593EN

720000502EN

720000472EN

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Waters 在线电子应用文库:
浩瀚应用实例,每日刷新!

简易登陆网址: http://www.waters.com/chemapps
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34

纲要
? 何谓理想HPLC色谱柱? ? 现代液相柱的选择技巧 ? 系统、快速液相色谱方法开发策略 ? 色谱柱生产流程对分离重现性的影响 ? 总结

?2005 Waters Corporation

您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题 柱寿命太短 11%
Product 极性化合物保 Quality Price 留不佳: 12%

峰拖尾: 28%
Peak Tailing Waters Retention Reproducibility

Peak Tailing

分离不佳: 24% Retention

Reproducibility

保留时间不重现: 25%

?2005 Waters Corporation

35

我的色谱分离为何重现性不佳?
仪器系统问题

? 泵精度、维修保养状况 ? 色谱柱是否置于恒温箱中 ? 系统滞后体积发生改变 (仅影响梯度分离!)
柱与柱间分离表现发生改变 ? 您的色谱柱是否购自可靠的生产和销售厂家?

源自方法本身的问题

? 流动相的配制方法在无意中发生了改变 ? 分离可离子化化合物(酸、碱)未在流动相中使用缓冲液(或缓冲液
的浓度不足)

?

流动相的pH值与被分析酸性、碱性化合物的pKa相近

?2005 Waters Corporation

梯度分离时系统滞后体积变化对分离时间的影响

分离在同一根色谱柱上进行!
系统 B: 泵滞后体积 > 1000 ?L
1 2 3 5 4

10.00

15.00

20.00

25.00

系统 A: 泵滞后体积 800 ?L
4 1 2 3 5

10.00

15.00 Minutes

20.00

25.00

解决方案: 1. 在梯度表的每一个时间段中加入相应的补偿时间 2. 在Empower软件上启动‘柱前体积’功能
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36

流动相的配制顺序: 您常常忽视的细节 需要清楚地记录并遵循流动相的配制顺序! 400 600

60/40

*

* 需指明哪个溶剂先加(如将甲醇加入水中还是水加入甲醇中?)

关于流动相pH的提醒: 缓冲液的pH需在加入有机溶剂前调试!
?2005 Waters Corporation

您的分析方法为何重现性不佳?
流动相缓冲pH值是否靠近分析物的pKa范围?

如图所示, 在靠近中性pH区间分析可离子化化 合物时需要对流动相pH进行非常仔细的控制!!
100

保留因子 (k)


10 1 0.1

碱2

(未离子化)

(未离子化)

碱1


0

中性化合物

1+2 (完全离子化)
2 4 6 8


pH
10 12

(完全离子化)
14

B1 B2

N

N

pH 5.5

A, B1

B2

A

pH6.0

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37

分析方法对pH敏感度的测试- 糟糕的结果
0.40 0.30 0.20 Column: XTerra? RP18 4.6 x 100 mm, 5 ?m Mobile Phase A: 20mM Ammonium Acetate (pH 5.0 to 5.8) or 20mM Ammonium Bicarbonate (pH 6.8 to 7.0) Mobile Phase B: ACN Flow Rate: 0.5 mL/min Isocratic Mobile Phase Composition: 40% A; 60% B Injection volume: 10?L Temperature: 30oC Detection: UV @ 230 nm Instrument: AllianceTM 2690, 996 PDA 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 1.00 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 1.00
?2005 Waters Corporation

1 2
1.00 2.00 3.00

pH 5.0
3

0.10 0.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 1.00

1

pH 5.2
3 2
2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

1

pH 5.4
3 2
2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

1. p-Toluamide 2. Lidocaine 3. Ibuprofen

1 3

pH 5.6
2
2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 Grumbach, Diehl 9.00 10.00

分析方法对pH敏感度的测试- 糟糕的结果
1. p-Toluamide 2. Lidocaine 3. Ibuprofen
0.40

Column:

XTerra?

RP18 4.6 x 100 mm, 5 ?m

Mobile Phase A: 20mM Ammonium Acetate (pH 5.0 to 5.8)

or 20mM Ammonium Bicarbonate (pH 6.8 to 7.0) 0.30 Mobile Phase B: ACN Flow Rate: 0.5 mL/min Isocratic Mobile Phase Composition: 40% A; 60% B Injection volume: 10?L Temperature: 30oC Detection: UV @ 230 nm Instrument: AllianceTM 2690, 996 PDA 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 1.00 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 1.00
?2005 Waters Corporation

0.20 0.10 0.00 1.00

1 3 2
2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

pH 5.8

9.00

10.00

1

pH 6.8
3 2
2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

1

pH 7.0
2

3

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00 8.00 9.00 Grumbach, Diehl

10.00

38

分析方法对pH敏感度的测试- 优异的结果

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杂化颗粒柱对创建稳定可靠的 HPLC分析方法的独特价值
稳定保留区
100
Note: Column Particle, Temperature and % Organic Held Constant

稳定保留区

10

k
1

0.1 0 2

硅胶柱
4

Xterra & X-Bridge 杂化颗粒柱
6

pH

8

10

12 Lidocaine

14

Acetaminophen Doxepin

Ibuprofen Imipramine

Nortriptyline p-Toluamide

Mobile Phase: 35% MeCN, 65% 20 mM Buffer
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39

您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题 柱寿命太短 11%
Product 极性化合物保 Quality Price 留不佳: 12%

峰拖尾: 28%
Peak Tailing Waters Retention Reproducibility

Peak Tailing

分离不佳: 24% Retention

Reproducibility

保留时间重现性不佳: 25%

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我的色谱柱寿命为何不长? 您是否有恰当的样品前处理手段?

? 样品前处理 (净化和富集)的好坏不仅影响分析结果的灵
敏度和可靠性,而且直接影响色谱柱的寿命

您的色谱柱是否有适当的保护措施? ? 在线过滤器 ? 保护柱 您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件?

? 使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐 (如在中性
或碱性pH区域使用高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐)

? 柱温过高 ? 将色谱柱暴露在极端pH的流动相中

?2005 Waters Corporation

40

您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题 柱寿命太短 11%
Product 极性化合物保 Quality Price 留不佳: 12%

峰拖尾: 28%
Peak Tailing Waters Retention Reproducibility

Peak Tailing

分离不佳: 24% Retention

Reproducibility

保留时间不重现: 25%

?2005 Waters Corporation

影响分离度的若干因素
柱效
N ↑ 2, R ↑ 40%

保留因子
K最佳=5

k2 ? N ? (α ? 1) × × =? Rs ? α (k 2 + 1) ? 4 ?
分离选择性
(方法开发归根结底是如何使得α ≠ 1)

?2005 Waters Corporation

41

影响柱效(塔板数)的因素
柱效(N)与柱长L呈正比, 与填料粒径dp呈反比

N∝
分离难易程度 困难 中等 简单

L dp
L/dp

选择柱长L与填料粒径dp的指导原则
30,000 (150mm/5um, 100mm/3.5um, 75mm/2.5um) 20,000 (100mm/5um, 75mm/3.5um, 50mm/2.5um) 10,000 (50mm/5um, 30mm/3.5um, 20mm/2.5um)

注: 方法开发的终极原则是在最短的色谱柱上完成最快的分离, 以达致最 高的样品通量和最省的流动相耗量。
?2005 Waters Corporation

使用更短具更细填料的分析柱(保持L/dP为常数)

是实现高通量分析的不二法门
0.20 AU 0.10

0.00 0.00 2.00 4.00 Minutes 0.20 AU 6.00 8.00

5 ?m – 150 mm Injection = 5.0 ?L Flow rate = 0.2ml/min Rs (2,3) = 2.28 10.00 3.5 ?m – 100 mm Injection = 3.3 ?L Flow rate = 0.3ml/min Rs (2,3) = 2.32
0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50

HPLC技术

0.10

0.00 0.00

4.00 2.5 ?m – 75 mm Injection = 2.5 ?L Flow rate = 0.5ml/min Rs (2,3) = 2.34

0.20 AU

0.10

0.00 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 Minutes 1.20 1.40 1.60 1.80

2.00 1.7 ?m – 50 mm Injection = 1.7 ?L Flow rate = 0.6ml/min Rs (2,3) = 2.29

0.20

UPLC?技术

AU

0.10

0.00 0.00
?2005 Waters Corporation

0.20

0.40

0.60 Minutes

0.80

1.00

1.10

42

影响分离度的若干因素
柱效
N ↑ 2, R ↑ 40%

保留因子
K最佳=5

k2 ? N ? (α ? 1) × × Rs = ? ? α (k 2 + 1) 4 ? ?
分离选择性
(方法开发归根结底是如何使得α ≠ 1)

?2005 Waters Corporation

如何在实践中调控 ‘α’?
这是方法开发的根本!

流动相溶剂选择

流动相pH

α

分离柱

?2005 Waters Corporation

43

在林林总总的色谱柱中, 方法开发应从何开始? ? Symmetry? C18
– 具有超常分离重现性的超纯硅胶的通用形C18柱

? Symmetry Shield?RP18
– 高纯硅胶柱提供高度重现结果, 绝佳峰形, 与Symmetry? C18相 比具正交性分离选择性, 可用于全水相分离

? XTerra? MS C18/ XTerra? RP18
– 方法开发者的首选柱 – 宽pH 应用范围, 多种键合相和多种粒径供选择

? Atlantis?
– dC18 转为 极性化合物而设计,已在工业界获广泛使用 – HILIC 提供真正与dC18相互补的分离选择性

?2005 Waters Corporation

从您最熟悉的路径开始: 首先尝试用高纯硅胶柱在低pH下构建分析方法
样品 为何首先用 Symmetry C18柱 在pH3下分离? 峰形有保障 是
是否属亲水 性化合物?



柱寿命长 pH3为稳定保留区,方法稳 定可靠

Atlantis dC18 At pH 2-5
不成功?

不肯定?
无充 分保

Symmetry C18 At pH 3



!
不成功?

Atlantis HILIC At pH 2-5
Preparation of 10mM NH4COOH buffer at pH 3:

Xterra RP18 At pH 3
仍不成功?

SymmetryShield RP18 At pH 3

? For 2 liters of 10mM buffer, weight out 1.26g of
NH4COOH

? Add 2 liters of water and stir until dissolved ? Adjust to pH 3 with formic acid
?2005 Waters Corporation

转向高 pH分离!

44

如何实施低pH下的三柱分析方案?
换柱前谨记探索流动相溶剂所带来的分离选择性
Symmetry C18 At pH 3 0-80% gradient ACNH20, 10mM buffer, pH 3 0-80% gradient MeOHH20, 10mM buffer, pH 3 成功分离?
否 是

方法再优化

成功分离?




方法再优化

SymmetryShield RP18 At pH 3

0-80% gradient ACNH20, 10mM buffer, pH 3 0-80% gradient MeOHH20, 10mM buffer, pH 3

成功分离?




方法再优化

成功分离?




方法再优化

Xterra RP18 At pH 3

0-80% gradient ACNH20, 10mM buffer, pH 3 0-80% gradient MeOHH20, 10mM buffer, pH 3

成功分离?




方法再优化

成功分离?



方法再优化

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Symmetry C18柱上的成功范例: Lansoprazole (等度分离)
0.050

0.040

pH 3.0
0.030

AU

73%A: 27%B tR = 9.3 min N = 12,100 T = 1.08 k’ = 8.3

0.020

Chromatographic Conditions : Columns: SymmetryTM C18 4.6 x 150 mm, 5.0 ?m Mobile Phase A: 20 mM NH4COOH, pH 3.0 Mobile Phase B: Acetonitrile Flow Rate: 1.4 mL/min Isocratic: as indicated Injection Volume: 2.0 ?L Sample Diluent: 75:25 H2O:ACN Sample Concentration: 350 ?g/mL Temperature: 30 oC Detection: UV @ 254 nm Sampling rate: 10 pts/sec Time Constant: 0.1 Instrument: Waters Alliance? HT 2795, with 2996 PDA

0.010

N NH
0.000 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 14.00

O S N

Lansoprazole 治疗溃疡药物

O F F F

?2005 Waters Corporation

45

Lansoprazole
分析以 0.4N HCl加速降解所得产物
0.080

Lansoprazole
0.070

pH 3.0 73%A: 27%B PA = 0.090 PT = 0.293

0.060

0.050

0.040 AU

0.030

0.020

Chromatographic Conditions : Columns: SymmetryTM C18 4.6 x 150 mm, 5.0 ?m Mobile Phase A: 20 mM NH4COOH, pH 3.0 Mobile Phase B: Acetonitrile Flow Rate: 1.4 mL/min Isocratic: as indicated Injection Volume: 2.0 ?L Sample Diluent: 57:43 H2O:ACN Sample Concentration: 1.42 mg/mL Temperature: 30 oC Detection: UV @ 254 nm Sampling rate: 10 pts/sec Time Constant: 0.1 Instrument: Waters Alliance? HT 2795, with 2996 PDA
Degradation Conditions: Temperature: ambient 50 mg of Lansoprazole + 5 mL of 0.4N HCl stirred for ~ 30 seconds Lansoprazole degraded ~ 43%

0.010

0.000 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 Minutes 12.00 14.00 16.00

?2005 Waters Corporation

Lansoprazole
0.4N HCl加速降解产物基线放大后的情形

2.62% T = 1.40 0.0030 5.99% T = 1.17 9.59% T= 1.10

Lansoprazole 57.74% T = 1.07

0.0025

21.63% T = 1.38

1.60% T = 1.23

0.0020 0.70% T = 1.36 0.0015 AU

0.0010

0.12% T = 1.03

0.0005

0.0000

-0.0005 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 Minutes 12.00 14.00 16.00

Grumbach
?2005 Waters Corporation

46

在起始的C18硅胶柱上未达分离?
探寻另一种流动相溶剂能否改善分离状况
3 1 2 4 9, 5
5.00 Minutes 6.00 7.00

6 7

8

MeCN
9.00 10.00

分离柱: Symmetry? C18 pH =3

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

8.00

1 2

3 4 5

68 7 9

MeOH

0.00

2.00

4.00

6.00 Minutes

8.00

10.00

12.00

14.00

?2005 Waters Corporation

在起始的C18硅胶柱上始终无法取得理想分离?

是考虑极性基团嵌入键合相的时候了!
S N K T F D In Suprofen = S Ketoprofen = K Symmetry? C18 Naproxen = N Tolmetin = T Fenoprofen = F Diclofenac = D Ib Indomethacin = In Ibuprofen = Ib

S T N K F Ib

In D

SymmetryShield? RP18

0

4

8

12 Minutes

16

20

注: 流动相组成完全未变.

?2005 Waters Corporation

47

在低pH流动相中始终无法达致理想分离?
是时候使用杂化颗粒柱施行高pH分离的时候了…
为何使用XBridge/Xterra RP18在 pH10下进行分离? Xterra RP18 At pH 10 无法在低pH情况 下取得理想分离 峰形最佳 柱寿命有保障 分离选择性与C18柱相互补
分离不理想 ?

pH10为另一稳定保留区, 所开发的 方法具高度重现性 Xterra Phenyl At pH 10

Xterra MS C18 At pH 10
分离仍不佳 ?

Preparation of 10mM ammonium bicarbondate (NH4HCO3) buffer at pH 10:

探索中性 pH 下的分离状况!

? For 2 liters of 10mM buffer, weight out 1.58g of NH4HCO3 ? Add 2 liters of water and stir
until dissolved

? Adjust to pH 10 with
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ammonium hydroxide

如何实施高pH下的三柱分析方案?
换柱前谨记探索流动相溶剂所带来的分离选择性
Xterra RP18 At pH 10 0-80% gradient ACNH20, 10mM buffer, pH 10 0-80% gradient MeOHH20, 10mM buffer, pH 10 成功分离?
否 是

方法再优化

成功分离?




方法再优化

Xterra MS C18 At pH 10

0-80% gradient ACNH20, 10mM buffer, pH 10 0-80% gradient MeOHH20, 10mM buffer, pH 10

成功分离?




方法再优化

成功分离?




方法再优化

Xterra Phenyl At pH 10

0-80% gradient ACNH20, 10mM buffer, pH 10 0-80% gradient MeOHH20, 10mM buffer, pH 10

成功分离?




方法再优化

成功分离?



方法再优化

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48

在高pH下进行分离的好处
可能取得与低pH下完全不同的分离选择性 由于碱性化合物在高pH下呈电中性, 故其峰形有保障 可离子化化合物处在稳定保留区域, 分析结果稳定可靠 碱性化合物的保留得以加强 在纯化制备应用中碱性化合物在高pH下的样品载荷与 低pH下相比高 20-50倍 (可显著节省在购买制备柱和流 动相溶剂方面的费用)

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在pH 3 下分离三环类抗忧郁剂的情形
1 3 46,5 1 2 3 4 5 6 Nordoxepin Doxepin Imipramine Amitriptyline Nortriptyline Trimipramine

0-80% MeOH-H2O 梯度分离

XTerra? MS C18

2

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00 7.00 Minutes

8.00

9.00 10.00 11.00 12.00

Column dimension: 4.6 x 50 mm; 3.5?m Column Temp: 30°C. Flow rate: 2.0 ml/min. Detection: 254nm. Injection volume: 20?l. Sample conc: 40 ?g/ml. Gradient:

XTerra? RP

21
18

3

4 6,5

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00 7.00 Minutes

8.00

9.00 10.00 11.00 12.00

Run time: 20 min. Mobile phase: A: water. B: MeOH. C: 100mM Ammonium Formate, pH: 3 0 to 15 min linear from 90 %A, 10% C to 10% A, 80% B , 10% C

1,2

4,6 3,5

XTerra? Phenyl

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

?2005 Waters Corporation

6.00 7.00 Minutes

8.00

9.00 10.00 11.00 12.00

49

在pH 10 时问题迎刃而解
0.10

0-80% MeOH-H2O 梯度分离
4 6 1 2 3 4 5 6
16.00

1

5

2

3

XTerra? MS C18
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 14.00

Nordoxepin Doxepin Imipramine Amitriptyline Nortriptyline Trimipramine

Column Dimension: 4.6 x 50 mm 3.5 ?m Column Temp: 30°C. Flow rate: 2.0 mL/min Detection: 254 nm Injection volume: 20 ?l Run time: 20 min

1
0.10

5

2

3

4

6

XTerra? RP18
0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00

Sample conc: 20 ?g/ml Mobile phase: A: water. B: MeOH, C: 100mM Ammonium Bicarbonate. pH 10 0 to 15 minutes linear from 90% A, 0% B, 10% C to 10% A, 80% B, 10% C

3 1 5 2

0.10

4

6

XTerra? Phenyl
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00

?2005 Waters Corporation

若在 pH3和pH10下均无满意分离, 下一步该怎么办? 考虑中性 pH下的分离…
在pH 7下进行分离的优缺点: 较易改变分离选择性 Xterra RP18 At pH 7 高低 pH均无 满意分离结果 Xterra MS C18 At pH 7
分离不满意 ?

保留时间和分离选择性不易重现 ( 须 严格控制流动相pH值!) 可能会有峰拖尾现象 (需要现代柱 技术) 若使用硅胶柱, 柱寿命将缩短

Xterra Phenyl At pH 7

Preparation of 10mM ammonium bicarbondate (NH4HCO3) buffer at pH 7:

? For 2 liters of 10mM buffer, weight out 1.58g of NH4HCO3 ? Add 2 liters of water and stir until dissolved ? Adjust to pH 7 with formic acid
?2005 Waters Corporation

50

HPLC方法开发全程总揽
样品 是
Atlantis dC18 At pH 2-5

强极性 ?
Not sure?
强 极 性


Symmetry C18 At pH 3 Xterra RP18 At pH 10 Xterra RP18 At pH 7

分离不 理想?

分离不 理想?

分离不 理想?

分离不 理想?

Atlantis HILIC At pH 2-5

Xterra RP18 At pH 3

SymmetryShield RP18 At pH 3

Xterra MS C18 At pH 10

Xterra Phenyl At pH 10

Xterra MS C18 At pH 7 Sunfire C18 At pH 7

Xterra Phenyl At pH 7

分离不 理想?

分离不 理想?

SymmetryShield RP18 At pH 7

注: 更换分析柱前应先探寻不同流动相溶剂对分离选择性的影响
?2005 Waters Corporation

如果所要建立的分析方法将会被长期使用,
值得权衡pH 3 and pH 10下的样品分析通量
Risperidone Degraded with 31% Peroxide Column: XTerra? RP18 3.5?m column 4.6x100mm

pH 3
0.020

AU

Risperidone
0.010

0.000 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00

pH 10
0.040

Risperidone

AU

0.020

0.000

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00 Minutes

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

在两个pH下的分离均令人满意, 应该选择哪一个条件以便长期使用?
?2005 Waters Corporation

51

频繁切换分析柱、流动相溶剂和缓冲液过于繁琐? 自动方法开发系统(AMDS system)可帮您解决问题…
Solvent Selector: Controlled via Contact Closures

D A B C

D1

D2

D3

Mobile Phases: A H 2O B MeCN C MeOH D1 pH 3 NH4COOH D2 pH 10 NH4HCO3 D3 10% MeCN (valve wash) Total of 6 bottles can be used for line D.
Note: For full control via computer, upgrade to Empower software.

3/6 column selector

?2005 Waters Corporation

纲要
? 何谓理想HPLC色谱柱? ? 现代液相柱的选择技巧 ? 系统、快速液相色谱方法开发策略 ? 色谱柱生产流程对分离重现性的影响 ? 总结

?2005 Waters Corporation

52

理想液相色谱柱的衡量标准
? 峰形佳、柱效好 – 对任何分析物 (酸性, 碱性和中性) ? 柱寿命长 – 不同pH和柱温下均有良好表现 ? 色谱分离可轻易放大 – 从分析规模直接放大至制备规模 ? 分离表现高度重现 – 柱与柱间、不同批次填料间和不同粒径填料间均需如此 ? 柱产品质量的可追溯性和柱生产流程是否符合最新GMP规范 ? 价格适中

?2005 Waters Corporation

全球最大的液相色谱柱原产厂家
原产厂家 化学键合厂 柱填充厂 分销商

Waters:

质量的可追溯性和生产 流程的全程控制能力

硅胶颗粒和 杂化颗粒合成 填料键合 柱填充 分拨与销售

Source & control of silica gel can make a big difference in your chromatography

填料键合 柱填充 分拨与销售 柱填充 分拨与销售 分拨与销售

Waters
? 生产流程全部按c-GMP规范操作 ? 持有 FDA的医疗器械生产证书
* Waters: 全球分拨与销售
?2005 Waters Corporation

106

53

一些 Waters? C18 (USP L1) 填料的批间重现性数据

alpha neutral/neutral

alpha base/neutral

Alpha values % RSD

15 10 5 0

7.33 1.4
1970s
Bondapak

3.32 1.3
1980s
Nova-Pak

2.17 0.4
Mid-1990s
Symmetry

0.96 0.17
Late-1990s
XTerra

?2005 Waters Corporation

Symmetry?和 XTerra?柱系列批间重现性数据

12
Alpha Values % RSD

10 8 6 4 2 0
SymmetrySymmetryXTerra XTerra MS XTerra XTerra MS Symmetry Symmetry Shield RP18 Shield RP18 RP18 3.5um C18 3.5um RP18 5um C18 5um C18 3.5um C18 5um 3.5um 5um 0.22 2.14 0.17 0.96 0.68 1.59 0.48 2.12 0.23 2.41 0.11 1.2 0.35 1.84 0.43 1.63

Napth/Ace Amit/Ace

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54

不同厂家对高纯硅胶C18填料键合密度的 控制指标及其对分离选择性的影响
r2=0.982

α

X Y A

umol/m2
C18 填料 键合密度 ?mol/m2 3.24-3.64 2.75-3.75 2.6-

α “指标” 范围
1.12-1.24 1.07-1.53 1.00-1.62

Rs 低端 2.86 0.81 0

Rs 高端 4.14 4.70 5.37

Rs 差异 1.28 3.89 5.37

Waters (A)

厂家 Y 厂家 X

?2005 Waters Corporation

缺乏严密色谱柱批间质量控制的后果*

* 依据有关厂家的质量控制指标进行测试的结果
?2005 Waters Corporation

55

如何保障您建立的重要分析方法可延续使用多年? 将色铺柱的批间重现性考察作为方法验证的关键一环!

建议的色谱柱批间重现性考察程序
从初选的厂家购得A, B, C,D四根新柱 (A, B为同批号填料; C, D 各为不同批号填料) 在柱A上完成方法开发, 然后在 柱B上验证是否得到完全一致的分离 若柱A, B上分离表现不一致, 说明柱A在方法开发过程中已起变化,需要以 柱B上优化得到的结果为准,往下考察。

若柱A, B上分离表现完全一致, 说明柱A在方法开发过程中未起变化

在柱C,D上检验同一分离方法

若柱A, B,C,D上的分离表现完全一致, 说明厂家对该柱产品有良好的质控, 可保证您的分析方法长期稳定。
?2005 Waters Corporation

若A, B,C,D任何一柱上的分离表现不完全 一致, 说明厂家对该柱产品的质控不不严, 需考虑更换生产厂家, 重新加以考察。

重要的方法开发为何要从新色谱柱开始?

? ? ?

随使用条件和样品洁净度的不同,多数色谱柱在使用过 程中可发生化学污染、表面状态改变、基体材料部分溶 解等等潜在变化。 此类改变可导致柱内填料的活化或钝化,使其对某些化 合物的分离选择性加强或变劣。此类特殊分离选择性常 常是无法重复的。 在此类旧色谱柱建立起来的方法将无法在新柱和其他旧 色谱柱上得以重现,造成未来可能需要重新开发方法或 进行大量针对仪器系统、色谱柱和流动相的不必要的诊 断工作。

?2005 Waters Corporation

56

纲要
? 何谓理想HPLC色谱柱? ? 现代液相柱的选择技巧 ? 系统、快速液相色谱方法开发策略 ? 色谱柱生产流程对分离重现性的影响 ? 总结

?2005 Waters Corporation

结语 ?
现代液相色谱柱技术在改善分析物峰对称性、提高在严 苛分析条件(如高、低pH)下的柱寿命、简化分离方法 的建立和提高分析实验室生产力方面均扮演着不可替代 的作用。 应用Waters现代多平台色谱柱技术(Symmetry?系列、 XTerra?系列和Atlantis?系列),结合对流动相溶剂和pH 的系统化调控,是方便快速地进行分析方法开发的最佳 途经。 作为全球最大的液相色谱柱原产厂家,Waters以为色谱 工作者提供最优质、最稳定可靠的柱产品为己任。我们 强大的研发实力、严谨的生产流程控制和丰富的应用经 验为达致以上目标提供了坚强保障。

?

?

?2005 Waters Corporation

57

yuan_sheng_wu@waters.com

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