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研究血管内皮生长因子在先兆子痫大鼠肾损伤中的进展


研究血管内皮生长因子在先兆子痫大鼠肾损伤中的进展 先兆子痫是引起孕产妇及围生儿死亡的重要原因,肾脏损伤所致的大量蛋白 尿为其 主要的临床表现。引起肾小球滤过膜通透性增高的原因目前不详。血管 内皮生长因子(vasc ular endothelial growth factor,VEGF)是一种强效的增强血管壁 通透性的生物活性物质 。有研究表明血浆及胎盘蜕膜局部 VEGF 水平的改变可 能与妊高征的发病有关。但血浆、尿液 VEGF 水平与肾脏局部 VEGF 表达的关 系及肾脏局部 VEGF 的表达与先兆子痫肾损伤的关系至今国 内外尚未有研究。 本 试 验 拟 通 过 一 氧 化 氮 合 酶 抑 制 亚 硝 基 左 旋 精 氨 酸 甲 酯 (L-nitroarginine,L-NAME)复制大鼠先兆子痫模型[1-2],检测血浆、 尿液中 VEGF 浓度, 观 察肾 小球中 VEGF 的表达及其表达的强弱与 24h 尿蛋白排泄量的关系,从而探讨 VEGF 在先兆子痫肾 损伤中的作用。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器 L-NAME(美国 Sigma 公司),VEGF Elisa 试剂盒( 北京 中山生物有限公司),地高辛标记的 VEGFmRNA 探针(德国 Biognostik 公司),VEGF 多克 隆抗体(Santa Cruz 公司),SABC 试剂盒(武汉博士德生物制品公司),大鼠尾 动脉袖带式 血压计,透射电镜,计算机病理图像分析仪。 1.2 动物模型复制与分组取 200~250g 普通级 Wista r 雄性大鼠 50 只和成年 Wistar 雄性大鼠 25 只,按雌:雄=2:1 比例同笼混合饲养一夜后,次日清晨当雌性大 鼠阴道涂片检 查可见活动的精子时,确认为大鼠妊娠第 1d。将孕鼠随机分为两 组,A 组:先兆子痫模型组 (n=6),B 组:正常妊娠对照组(n=6)。 另取 6 只无妊娠史雌 性大鼠作为 C 组,即未孕 L-NAM E 处理组。从妊娠第 18d 开始对 A 组和 B 组大 鼠分别皮下注射 L-NAME 和蒸馏水 250mg/(kg/d), 持续 4d 后于妊娠第 22d 时处 死。C 组大鼠于皮下注射 L-NAME 250mg/(kg/d),持续 4d 后处死 。 1.3 24h 尿蛋白排泄量的测定 用标 准代谢笼分别与注射前和注射第 2、4d 收集各组大鼠 24h 尿液,采用考马斯亮蓝结合法测定 24 h 尿蛋白排泄量。 1.4 收缩期血压的测定 A 组和 C 组大鼠于 L-NAME 注射前 及 L-NAME 注 射第 2、 3、 4d 测量尾动脉收缩压。 具体方法是将大鼠置于预热箱内预热至 38℃~ 40℃,待其安静后用大鼠 尾动脉血压仪在 5min 内连续测量 3 次收缩期血压,取平 均值。 1.5 血浆及尿液标本的采集与检测在注射第 4 天时经 眼静脉窦采集各组大 鼠静 脉血 2ml,置于经肝素抗凝的玻璃管,3000r/min 离心 10min 后取上清液,置于 -70℃冰箱保存 待检。大鼠处死后经膀胱穿刺收集各组大鼠尿液,3000r/min 离心 10min 取上清 3ml 存放于-70 ℃冰箱保存待检。 采用双抗酶联免疫吸附法(ELISA), 通过绘制标准曲线求出标本 VEGF 的 浓度,为了纠正尿液浓度不同的影响,尿液 VEGF 含量以尿 VEGF/尿肌酐(ng/mmol Cr)来表 达。 1.6 原位杂交法大鼠处死后,取一侧肾组织将其置 于 4%多聚甲醛液 1~2h、 脱 水、透明、浸蜡、包埋、

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