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实验九 凝胶层析分离蛋白质


实验九 实验九 凝胶层析分离蛋白质
一 实验目的
了解凝胶层析的基本原理,并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质

二 实验原理
凝胶层析也称凝胶过滤、凝胶过滤层析、分子排阻层析和分子筛选层析。凝 胶是具有一定孔径的网状结构物质,凝胶层析是一种分子筛选效应,主要用于分 离分子大小不同的生物分子以及测定其相对分子质量。 相对分子质量小的物质可 通过凝胶网孔进入凝胶颗粒内部,而相对分子质量大的物质不能进入凝胶内部, 被排阻在凝胶颗粒外,随着洗脱的进行,相对分子质量小的物质由于进入凝胶内 部,不断地从一个网孔穿到另外一个网孔,这样“绕道”而移动,走的路程长, 下来得慢(迁移速度慢) ,而相对分子质量大的物质不能进入凝胶内部即随洗脱 液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来,走的路程短,下来的快(迁移速度慢) ,这 样就可以达到分离的目的。

三 实验器材
1.层析柱 1cm×90cm 2.恒流泵。 3.紫外检测仪。 4.部分收集器 5.记录仪 6.试管等普通玻璃皿

四 实验试剂
1.待分离样品:胰岛素、牛血清蛋白。 2.葡聚糖凝胶 sephadexG-75 3.蓝色葡聚糖 2000 4.洗脱液:01.mol/L ,PH6.8 磷酸缓冲液

五 实验方法
1.凝胶的处理

sephadexG-75 干粉经蒸馏水室温充分溶胀 24h, 或沸水浴中 3h, 这样可大大 缩短溶胀时间,而且可以杀死细菌和排除凝胶内部的气泡。溶胀过程中注意不要 过分搅拌,以防颗粒破碎。凝胶颗粒大小要求均匀,使流速稳定凝胶充分溶账后 用倾泌法将不易沉下的较细的颗粒除去。将溶胀后的凝胶抽干,用 10 倍体积的 洗脱液处理约 1h,搅拌后继续用倾泌液除去悬浮的较小的细颗粒。 2.装柱 将层析柱垂直装好,关闭出口,加入洗脱液约 1cm 高。将处理好的凝胶用 等体积洗脱液搅成浆状,自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中,待底部凝胶沉积约 1cm 高时,再打开出口,继续加入凝胶浆,至凝胶沉积至一定高度(约 70cm) 即可。装柱要求连续,均匀,无气泡,无“纹路” 。 3.平衡 将洗脱液与恒流泵相连,恒流泵出口端与层析柱入口相连,用 2-3 倍床体积 的洗脱液平衡,流速为 0.5ml/min。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸,以防加样 时凝胶被冲起。 柱 装 好 和平 衡 后可 用蓝 色 葡 聚糖 2000 检查 层 析 行为 , 在层 析柱 内 加 1ml(2mg/ml)蓝色葡聚糖 2000,然后用洗脱液进行洗脱(流速 0.5ml/min),若色 带狭窄并均匀下降,说明装柱良好,然后再用 2 倍床体积的洗脱液平衡。 4.加样与洗脱 将柱中多余的液体放出,使液面刚好盖过凝胶,关闭出口,将 1ml 样品沿层 析柱管壁小心加入, 加完后打开底端出口, 使液面降至与凝胶面相平时关闭出口, 用少量洗脱液洗柱内壁 2 次,加洗脱液至液层 4cm 左右,按上恒流泵,调好流 速(0.5ml/min) ,开始洗脱。 上样的体积,分析用量一般为床体积的 1%~2%,制备用量一般为床体积的 20%~30%。 5.收集与测定 用部分收集器收集洗脱液,每管 4ml。紫外检测仪 280nm 处检测,用记录仪 或将检测信号输入色谱工信站系统,绘制洗脱曲线。 6.凝胶柱的处理 一般凝胶用过后,反复用蒸馏水通过柱(2~3 倍体积)即可,若凝胶有颜色

或比较脏,需用 0.5mol/L NaCl 洗涤,再用蒸馏水洗。冬季一般放 2 个月无长霉 情况,但在夏季如不用,则要加 0.02%的叠氮钠防腐。

六 注意事项
装柱时要注意凝胶的流速,不宜过快,同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布 的比较均匀。 凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同,否则由于更换溶剂,凝胶体积 会发生变化而影响分离效果。 样品的浓度和加样量的多少。是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当 大,但大分子物质的浓度大时,溶液的黏度也随之变大,会影响分离效果,要兼 顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好,加样量一般为柱床 体积的 1%-2%,制备用量一般为柱床体积的 20%-30%。 凝胶用完后可再加入防腐剂低温保存。 叠氮钠属于有毒性物质,在使用过程中需注意安全。

七 思考题
1.对于蛋白质的分离纯化,目前研究使用较多的还有哪些方法? 2.凝胶层析的主要原理是什么? 3.装柱的要点有哪些?怎样检查柱是否装的均匀?影响分离效果的主要因素有 哪些?


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