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第九章 植物线虫的基本研究


第九章、植物线虫的基本研究方法
? 植物线虫的采集和保存:
应根据取样目的和具体的病害特点来制定取样计划和确定 取样方法。 1.病变组织的采集 病变部位,一般也是线虫的存在部位。如:根结,小麦粒 线虫危害引起的虫瘿等。 2.病根、根际土壤和大田土样的采集 在离地表5-20cm的根际取样,遵循少量多点的原则,每 块田取0.5-1kg土样,连同部分根系一起采集,采

样时一般 采集长势较差的植物。 3.样本的保存 采样时作好记录,时间、地点、作物,大型作物挂牌。样 本保存在5-10℃冰箱,袋口扎住,稍透点气。若无冰箱,则 放在阴凉处,打开袋口,最好马上分离。

植物线虫的分离 1.从植物病组织中分离线虫的方法
(1)直接解剖分离 分离根结等内寄生线虫的成熟雌虫,简单且快速,但只适 合分离病组织中虫体较大的线虫。

(2)漏斗分离
适用于分离植物材料和土壤中较活跃的线虫,方法简便,容易 操作,缺乏氧气,但不利于活动线虫的存活,分离效率低。

(3)浅盘分离 原理与漏斗法相同,但通气状况更 好,线虫容易活动,存活率高,分离效 率比漏斗法高,然而分离时间较长,所 获线虫悬浮液较脏。

2.从土壤中分离线虫 (1)直接过筛分离
? 60-100目筛,可收集到胞囊 ? 325-400目筛,可收集到大多数 ? ?
线虫 500目,可收集到根结线虫的卵 用洗瓶冲(两面都冲),筛稍倾 斜, 使冲致一角落,用瓶或皿收集。

可在短时间内处理大量样品, 但方法粗糙,所获线虫悬浮 液较脏。

(2)离心飘浮分离

(线虫比重约1.05) ? 简要步骤如下: (a)40g土样中加约150ml水,混成悬浮液, 2000转/min离心5分钟; (b)弃上清液(此时线虫沉于泥土中); (c)加入蔗糖液,马上搅匀,立即离心 (2000转/min离心5分钟), 此时线虫分布在糖液中; (d)立即过筛,冲洗,收集线虫。 该方法快速,可分离到较多 的线虫,所获得的线虫悬浮 液干净,但不容易获得活线虫。

? 线虫可飘浮在比重为1.12-1.20的蔗糖液中

(3)胞囊漂浮器分离法
(1)淋湿漂浮筒和下筛。 (2)漂浮简内灌满清水。 (3)在L筛中放风干土样100g左右,用强水 流冲洗,使土样全部被淋洗进漂浮筒内。进 入筒内的土粒因为轻重,逐渐沉向筒底,较 轻的胞囊和一些有机杂物则陆续向上漂浮, 经1—2min后全部漂浮于筒口水面上。 (4)经过上筛加水至漂浮筒内,使游离于 筒门表面的胞囊和杂物沿环须水槽流到下筛 (60目)上面。 (5)淋洗下筛内含有胞囊的残留物至 1000m1的三角瓶内,胞囊和杂物都漂浮在 瓶先端。 (6)用滤纸过滤,收集上述漂浮物,在滤 纸上待在。

(4)贝曼漏斗分离 (5)浅盘分离法 贝曼漏斗,过筛,离心这三种是最基 本的分离方法。

植物线虫玻片标本的制作
1、线虫的杀死和固定 (1)热杀死:60-65℃ 约3min;线虫悬浮液 内加沸水使温度为56-58℃, 3min后防入 冰箱或室温自然降温。 (2)固定:线虫杀死后应马上固定,防止变 形和变质。

? TAF固定液(三乙醇胺-福尔马林固定液)
福尔马林(40%甲醛) 7ml 三乙醇胺 2ml 蒸馏水 91ml 优点:短时间内可较好保持线虫的弹性 缺点:时间过长,会导致一些线虫内部结构 透明和表皮角质膜变质。

? FAA固定液(福尔马林-冰醋酸-酒精固定液)
95%酒精 福尔马林(40%甲醛) 冰醋酸 蒸馏水 优点:可保持线虫的刻线和环纹清晰 缺点:可能会使虫体洲缩变形 20ml 6ml 1ml 40ml

? FA固定液(福尔马林-冰醋酸固定液)
4:1用量 4:10用量

福尔马林(40%甲醛) 10ml 10ml 冰醋酸 1ml 10ml 蒸馏水 89ml 80ml 优点:可长时间保存线虫原形 缺点:可能使虫体颜色变暗,会使垫刃线虫的 口针变透明

? 杀死与固定同时进行
4:1的FA固定液(福尔马林-冰醋酸固定 液)加热到99℃后倒入高度浓缩的线虫悬 浮液

2、脱水 制作永久玻片和半永久玻片的线虫需要固定后 脱水,用于脱水的线虫必须固定24h以上。
甘油酒精脱水法: 甲溶液:酒精(95%)20ml,甘油1ml,蒸馏水79ml 乙溶液:酒精(95%)95ml,甘油5ml 取固定24h以上的线虫放进盛有甲溶液的小皿内,将 小皿放进干燥器隔板上,干燥器底部放95%酒精, 加盖后置35-40℃温箱内12-24h,取出小皿,换进 乙溶液,将小皿放进密闭的大器皿内,40℃保存3h 或更长,直至酒精完全蒸发。

3、玻片的制作 蜡圈制作法:直径1.5cm的打孔器,端部烧 热,迅速插到低熔点的石蜡(熔点54℃) 中,将熔化的蜡尽快黏附在载玻片中央, 做成蜡圈;在蜡圈中央加一小滴甘油;将 已脱水的线虫挑入其中;加盖玻片;加热 使蜡熔化;封片。

植物线虫的染色
由于线虫透明,一些内部结构较难观 察,因此可进行染色,增强反差。 多色蓝:染色后的线虫肠呈绿色,生殖器 官与卵原细胞或精原细胞呈蓝紫色,细胞 核为浅红色,染色体为蓝紫色,其他器官 如神经环、神经细胞等呈深蓝色或深紫色。 醋酸地衣红与丙酸地衣红

?

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植物组织内线虫的染色
方法多种,共同特点是经过染色处理,线 虫着色,植物组织不着色或着色很浅。 (1)次氯酸钠-酸性品红染色 (2)棉蓝或酸性品红乳酚油染色法 (3)弗莱明染色液 (4)猩红R染色液

线虫的计数
? 线虫样品的计数:线虫数量不多可在小培
养皿或线虫计数皿中,在解剖镜下直接计 数;数量多时,先充分搅拌和适当稀释 后,吸取5-10ml线虫悬浮液进行计数。 ? 根组织内线虫的计数:先进行染色,再在 解剖镜下计数每段根组织中的线虫数。

植物线虫形态计测
? 对于比较短而直的部位,可直接在高倍光
学显微镜下,通过目镜测微尺测量; ? 对于较长、弯曲的虫体,需要分段测量, 或通过显微绘图,将虫体画到纸上后再测 量。 ? De Man公式

植物线虫的培养
植物线虫一般都是专性寄生物,很难在纯培养 基上生长,只能在相应的寄主植物上生长。 (1)消毒:培养线虫前一般先进行消毒,保 证其是无外源的。通常是用0.1%-0.5%的硫 酸链霉素泡5-15min(不同的线虫,浸泡时 间不同),再用无菌水漂洗3次。 (2)培养

? 食真菌线虫的培养:滑刃目内一些线虫,
如松材线虫,可用灰葡萄孢培养。 ? 植物组织上线虫的培养:根结线虫可直接 接种于盆载的番茄或马铃薯根上反之;短 体科内的一些线虫,如穿孔线虫、短体线 虫可在胡萝卜愈伤组织上培养;潜根线虫 可在玉米离体根上培养。

植物线虫DNA的提取
? 大量DNA提取法:(1)分离培养的纯线虫,用
无菌水漂洗,3000r/min离心3min,弃上清液,将 装有虫的离心管投入液氮中30s,用研椎研磨,加 入700μl DNA抽提缓冲液和5 μl 蛋白酶k,混匀; (2)50℃水浴4-5h;(3)加入等体积Tris饱和 酚,轻轻混匀,12000rpm,4℃离心10min,取上 清液;(4)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1), 轻轻混匀,12000rpm,4℃离心10min,取上清 液;(5)加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和 2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,-20℃ 3h以上; (6)12000rpm,4℃离心10min沉淀DNA;(7) 用75%乙醇洗涤沉淀2次,待酒精挥发干后,用TE 溶解沉淀。

? 微量DNA提取法:首先配制WLB液(线虫裂解

液);然后在载玻片上滴16 ?l预冷的WLB液,挑 入3-5条线虫,用手术刀将线虫切成多段,迅速吸 取含尽量多的线虫片段的悬浮液8 ?l,加到含10 ?l无菌水的Eppendorf管中,再向管中加入2 ?l预 冷的1 mg/mL蛋白酶K,使总体积为20 ?l,迅速 放入-70 ℃冰箱10 min以上。接着将Eppendorf管 置于65 ℃恒温60 min,95 ℃恒温10 min,最后 12000 g离心0.5 min。此时即得到DNA悬浮液。

根结线虫接种和为害的记载标准
接种技术

根结线虫为害的记载标准

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