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根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究


根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究 摘要介绍了农杆菌介导的植物原位转基因方法发展状况、 技术环节以及在转 化机制上的研究结果,并对存在的问题以及应用前景进行了讨论。 关键词根癌农杆菌;植物;遗传转化 1 根癌农杆菌介导的基因转化原理 野生型根癌农杆菌是一种土壤病原细菌,它通过根部伤口侵入植物体,刺激寄 主在侵染部位形成冠瘿瘤,引发根癌病。该病在世界范围内普遍发生,患病植株株 体衰弱,严重时整株死亡,在生产上危害极大。冠瘿瘤的形成是根癌农杆菌染色体 外的遗传物质 Ti 质粒上的一段 DNA(T-D NA)转移到植物细胞,整合到染色体组并 进行表达的结果。这种具有天然转基因功能的质粒,改造后,在基因工程中可以用 作基因转移的载体。根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称 Ti 质粒。野生 型根癌农杆菌的 Ti 质粒含有 2 个与致瘤有关的区域:一个是 T-DNA 区,含有致瘤 基因;另一个是毒性区,在 T-DNA 的切割、转移、整合过程起作用,用于植物基因 转化的农杆菌 Ti 质粒中致瘤基因删除,并在 T-DNA 区域插入适当的选择标记和 多克隆位点。 2 根癌农杆菌介导的基因转化的特点 2.1 导入基因拷贝数低,表达效果好 农杆菌介导的转化向植物细胞导入的外源基因拷贝数大多只有 1~3 个,而其 他方法往往会有几十个,大量拷贝会导致转基因的沉默。 2.2 转化频率高 T-DNA 链在转移过程中受到蛋白质的保护及定向作用,可免受核酸酶的降解, 从而完整、准确地进入细胞核,转化效率较高。 2.3 导入植物细胞的片段确切,且能导入大片段的 DNA Ti 质粒上位于 2 个边界序列之间的外源基因片段均会转移到植物细胞,可避 免其他理化方法将非目的基因片段导入植物细胞而造成潜在遗传物质扩散的危 险。 3 影响农杆菌转化效率的因素 3.1 受体的来源及发育状态 应该选择活跃分裂的功能细胞,如愈伤组织胚性细胞、幼胚等,这些细胞处于 良好的脱分化状态,DNA 合成能力强,有利于 T-DNA 的整合。 3.2 农杆菌菌株的选择与质粒的构建 超毒力的农杆菌菌株和超毒双元载体,能够增强农杆菌的侵染能力和 T-DNA 的整合能力,较好地克服农杆菌对单子叶植物敏感性差的问题。 3.3 vir 基因活化物的使用 单子叶植物特别是禾本科植物受伤后分泌的诱导物质不足以形成有效的的 信号,诱导农杆菌 vir 基因的表达。在共培养的培养基中,添加一定量的酚类化合 物,能够取得良好的效果。 4 根癌农杆菌转化应用范围与方法的拓展 4.1 单子叶植物的转化 最早成功的转化是 Bytebier 等人用含有 nos-nptI 基因的重组 Ti 质粒感染石 刁柏愈伤组织,并且获得抗卡那霉素的再生植株。 4.2 真菌的转化 Bundock 等人成功转化了酵母、木霉、曲霉、镰孢霉、刺盘孢霉、脉孢霉以 及伞菌等多种丝状亚菌。 真菌的成功转化寻找到一种新的真菌基因工程改造方法, 可作为研究宿主与 T-DNA 转化互作关系的较好的分子体系。 4.3 裸子植物的转化 由于受到外植体培养、转化和选择频率等影响,Ti 质粒转化裸子植物一直受 到限制。 1999 年 Wenck 等人使用含有附加拷贝 virG 和(virD+virB)基因的 Ti 质粒 转化挪威云杉,获得 100 多个 Gus 表达株系,从而建立了裸子植物的转化体系。 5 根癌农杆菌转化应用中存在的问题 5.1 转化机理方面 在转化过程中,农杆菌本身的分子调控研究比较深入,但是有关植物因子的了 解尚处于初级阶段

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