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课题1微生物的实验室培养(上课专用)高中生物选修一专题二


专题2 :微生物的培养与应用

微生物基础知识

病毒
细菌

病毒界

微生物包括哪五类: 放线菌 真菌 原生动物

原核生物界 真菌界
原生生物界

特点:结构都相当简单,个体多数十分微小.通 常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到,有

的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿 素.不能进行光合作用.

细菌的外形与大小
细菌:单细胞不分枝的原核微生物。 细菌细胞微小而透明,通常用适当染料染 色后显微镜观察

细菌的构造
细菌细胞由外向里 依次有鞭毛、菌 (纤)毛、荚膜 、细胞壁、细胞 膜、细胞质,细 胞质中又有液泡 、储存性颗粒、 核质等。
图1-3 细菌的结构

*细胞壁
? ? ?
?

结构特点:坚韧且有弹性 细胞壁有哪些功能? ①固定细胞外形; ②保护细胞免受外力的损伤; ③阻拦大分子物质进人细胞;

?

④使细胞具有致病性及对 噬菌体的敏感性。

伤 寒 杆 菌 细 胞 壁 中 含 毒 素

有些细菌在一定的条件下,细胞里面形成一个椭圆形的休眠体,叫做芽孢。芽孢 的壁很厚,对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如,有的细菌的芽 孢,煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻,可以随风飘散。当环境适宜(如温度、水 分适宜)的时候,芽孢又可以萌发,形成一个细菌.

菌落:
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时,就会形成一个肉眼可见的,具有一定 形态结构的子细胞群体,叫做菌落。 ? 菌落是鉴定菌种的重要依据。
?

菌落
细菌的菌落特征因种 而异

放线菌
1、结构: ?单细胞原核 ?分支状的菌丝(基内菌丝、气生菌丝)

应用:
链霉素、土霉素、四环素、 氯霉素、红霉素、庆大霉素

微生物中发现了几千种抗生素,其中2/3是 由放线菌产生的

病毒的结构

病毒

SARS病毒、

禽流感病毒

朊病毒(蛋白质病毒)

2、病毒的增殖:

真菌

酵母菌和霉菌

青霉

如图是酵母菌电子显微 镜下的形态结构

生殖

孢子生殖

直立菌丝

营养菌丝

腐生生活

细菌的营养类型
根据细菌所利用的能源和碳源的不同 ,将细菌分为两大营养类型。 ? 自养菌(autotroph) ? 异养菌(heterotroph) ? 腐生菌 ? 寄生菌 大部分病原菌
?

(一)培养基
阅读教材P14~15相关内容,回答 以下问题: 1.何为培养基? 2.按照不同的培养基划分标准,培养 基有哪些种类、配制特点及其应用?

3.不同的培养基有不同的配方,但是 其基本成分都相同,都包括哪些营养 元素?有何作用?请举例说明。

一、基础知识:
(一)培养基 培养基(培养液)是由人工方法配制而 成的,专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。 1.培养基的类型和用途 (1)按物理状态来分:培养基可分为固体培 养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌 种分离、鉴定菌落等。 (2)按功能来分,可分为选择培养基和鉴别 培养基。 (3)按成分来分,可分为天然培养基和合成 培养基。

2.不同的微生物往往需要采用不同 的培养基配方 (参考教材附录内容)
3.不管哪种培养基,一般都含有水、 碳源、和氮源、 无机盐、等营养物质, 另外还需要满足微生物生长对pH、特殊 营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必 需,而自身不能合成的化合物,如维生素、 某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二 氧化碳、渗透压等的要求。

培养基
加入青霉素 加入高浓度食盐
不加氮源 不加含碳有机物的无 碳培养基 加入青霉素等抗生素

应用
分离酵母菌、霉菌等 真菌 分离金黄色葡萄球菌
分离固氮菌 分离自养型微生物 分离导入了目的基因 的受体细胞 分离杂交瘤细胞

加入氨基喋呤、次黄 嘌呤和胸腺嘧啶核苷

液体培养基

表面生长

均匀混浊生长

沉淀生长

固体培养基:菌落,菌苔

半固体培养基

无动力 有动力(弥散) (是否运动?)

4.培养基的用途 液体培养基:增菌 固体培养基:纯化,增菌 半固体培养基:动力检测,保种

(二)无菌技术
1.何为无菌技术?无菌技术包括哪些方 面?

2.什么是消毒?灭菌?两者有何区别?
3.常用的消毒与灭菌的方法有哪些? 有何要求? 4.请说出干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法 的操作步骤。

1.无菌技术的概念
无菌操作泛指在培养微生物的 操作中,所有防止杂菌污染的方法。 无论是随后将要学到的倒平板、平 板划线操作,还是平板稀释涂布法, 其操作中的每一步都需要做到“无 菌”,即防止杂菌污染。只有熟练、 规范地进行无菌操作,才可能成功 地培养微生物。

2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

(1)消毒定义: 利用化学或物理方法,杀死大部份 致病微生物的过程。区分为高程度消毒 (High-level Disinfection)、中程度 消毒(Intermediate-level Disinfection)、低程度消毒(Lowlevel Disinfection)三种方式。

(2)灭菌的定义:

以化学剂或物理方法消灭所有微 生物,包括所有细菌的繁殖体、芽孢、 霉菌及病毒,而达到完全无菌之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工 作中最普通也是最重要的技术。

3.常用的消毒与灭菌的方法
(1)消毒的方法
① 煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min
② 巴氏消毒法:70~75 ℃下煮30min 或 80 ℃ 下煮15min

③ 化学药剂消毒法:用75%酒精进行皮 肤消毒;用氯气消毒水源等 ④ 紫外线消毒

(2)灭菌的方法
①灼烧灭菌 ②干热灭菌: 160~170 ℃下 加热1~2h。

③高压蒸气灭菌: 100kPa、121 ℃下维持15~ 30min.

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌,它可以 杀灭所有的生物,包括最耐热的某些微生物的休 眠体,同时可以基本保持培养基的营养成分不被 破坏。 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了 防止杂菌,特别是空气中的杂菌污染,试管及玻 璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口,通常采用棉花 塞,也可采用各种金属、塑料及硅胶帽,它们只 可让空气通过,而空气中的其他微生物不能通过 。 而平皿是由正反两平面板互扣而成,这种器 具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

无菌技术
分类 灭菌法 高效消 毒法 中效消 毒法 定义 方法 物理法:热力、辐射、微 杀灭一切微生物 波、等离子体 化学法:醛类、烷化剂 杀灭一切致病微 紫外线、含氯剂、臭氧、 生物 复配剂等 杀灭除芽孢外的 超声波、碘类、醇类、酚 致病微生物 类

低效消 毒法

杀灭细菌繁殖体 单链季胺盐、双胍类、中 、亲脂病毒 草药、金属离子

1.关于微生物营养物质的叙述中, 正确的是 答案:D
A、是碳源的物质不可能同时是氮源 B、凡碳源都提供能量 C、除水以外的无机物只提供无机盐 D、无机氮源也能提供能量

2.下面对发酵工程中灭菌的理 解不正确的是 答案:B A、防止杂菌污染 B、消灭杂菌 C、培养基和发酵设备都必须灭 菌 D、灭菌必须在接种前

编号

成分 粉状硫

含量 10g

3.右表是某微生物培养基成 ① 分,请据此回答: (1)右表培养基可培养的微 ② 生物类型是 。 自养型微生物 (2)若不慎将过量NaCl加 ③ 入培养基中。 ④ 如不想浪费此培养基,可再 ⑤ 加入 。

(NH4) 2SO4 K2HPO4 MgSO4 FeSO4 CaCl2 H2O

0.4g

4.0g 9.25g 0.5g 0.5g 100ml

含碳有机物

⑥ ⑦

(3)若除去成分②,加(CH2O), 该培养基可用于培养 。 固氮微生物 (4)表中营养成分共有 类。 3 (5)不论何种培养基,在各种成分都溶化 后分装前,要进行是 。 调整pH (6)右表中各成分重量确定的原则 是 。 (7)若右表培养基用于菌种鉴定,应该增 依微生物的生长需要确定 加的成分是 。

琼脂(或凝固剂)

1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物 被其他外来微生物污染外,还有什么目的? 答:无菌技术还能有效避免操作者自 身被微生物感染。
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭 菌。如果需要,请选择合适的方法。 (1) 培养细菌用的培养基与培养皿 (2) 玻棒、试管、烧瓶和吸管 (3) 实验操作者的双手 答:(1)、(2)需要灭菌;(3)需要消毒。

3.微生物实验室培养的基本操作程序 1、器具的灭菌 2、培养基的配制 3、培养基的灭菌 4、倒平板 5、微生物接种 6、恒温箱中培养 7、菌种的保存

四、实验操作
(一)制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌)
牛肉膏蛋白胨固体培养基配方 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 将上述物质溶解后,添加自来水,定 容至1000mL

操作步骤
1.计算、称量 2.溶化 3.调pH: pH7.6 4.过滤:这一步可以省去。 5.分装:分装过程中注意不要使培 养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉 塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以 不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 6.加塞 7.包扎

8.灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角 锥瓶中,塞上棉花塞,包上牛皮纸, 再放入高压蒸气灭菌锅,在压力为 100kPa、温度为121℃,灭菌15~ 30min。将培养皿用旧报纸包裹,放 入干热灭菌箱内,在160~170 ℃下灭 菌2h。

倒平板技术
1.将灭过菌的 培养皿放在火 焰旁的桌面上, 右手拿装有培 养基的锥形瓶, 左手拨出棉塞。

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倒平板技术

2.右手拿锥形 1 2

瓶,使瓶口迅
速通过火焰。

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倒平板技术

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3.用左手的拇指 和食指将培养皿 打开一条稍大于 瓶口的缝隙,右 手将锥形瓶中的 培养基(约10~ 20mL)倒入培养 皿,左手立即盖 上培养皿的皿盖。

倒平板技术
4.等待平板冷 却凝固,大约 需5~10min。 然后,将平板 倒过来放置, 使皿盖在下, 皿底在上。

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9.倒平板: 待培养基冷却到50 ℃左右时,在酒 精灯附近倒平板。(倒平板操作见课本) 2d后观察平板,无杂菌污染才可用来接 种.

10.无菌检查: 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培 养24—48小时,以检查灭菌是否彻底。

问题讨论
1.培养基灭菌后,需要冷却到50 ℃ 左右时,才能用来倒平板。你用什么办 法来估计培养基的温度?

答:可以用手触摸盛有培养基 的锥形瓶,感觉锥形瓶的温度下降 到刚刚不烫手时,就可以进行倒平 板了。

2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通 过火焰?

答:通过灼烧灭菌,防止瓶 口的微生物污染培养基。

3.平板冷凝后,为什么要将平板倒置?

答:平板冷凝后,皿盖上会 凝结水珠,凝固后的培养基表面 的湿度也比较高,将平板倒置, 既可以使培养基表面的水分更好 地挥发,又可以防止皿盖上的水 珠落入培养基,造成污染。

4.在倒平板的过程中,如果不小 心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部 位,这个平板还能用来培养微生物吗? 为什么?

答:空气中的微生物可能 在皿盖与皿底之间的培养基上滋 生,因此最好不要用这个平板培 养微生物。

(二)纯化大肠杆菌

微生物的接种技术: 接种方法有: 平板划线法和稀释涂布平板法

平板划线的操作方法

一旦划破,会造成划线不均匀, 难以达到分离单菌落的目的; 二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落,菌落会沿着划破 处生长,会形成一个条状的菌落。

一旦划破,会造成划线不均匀, 难以达到分离单菌落的目的; 二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落,菌落会沿着划破 处生长,会形成一个条状的菌落。

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环?在划线操作结束时,仍然需 要灼烧接种环吗?为什么? 答:操作的第一步灼烧接种环是为了避免接 种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线 前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种 环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的 菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线 次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少, 以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环,能及时 杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和 感染操作者。

2.在灼烧接种环之后,为什么要等其 冷却后再进行划线? 答:以免接种环温度太高,杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时, 为什么总是从上一次划线的末端开始划线?
答:划线后,线条末端细菌的数目比线 条起始处要少,每次从上一次划线的末端开 始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而 逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来 的菌落。

稀释涂布平板法

1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌, 并按101~106的顺序编号。

2.用移液管吸取1mL培养的菌液,注入第 二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮 头,吹吸三次,使菌液与水充分混匀。

3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液,注 入102倍稀释的试管中,重复第2步的操作。 依次类推,直到完成最后一支试管的稀释。

注意:

移液管需要经过灭菌。操作时,
试管口和移液管离火焰1~2cm处.

问题讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附 近进行。结合平板划线与系列稀释的无 菌操作要求,想一想,第2步应如何进行 无菌操作?

应从操作的各个细节保证“无 菌”。例如,酒精灯与培养皿的距离 要合适、吸管头不要接触任何其他物 体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。

微生物的恒温培养

微生物的恒温培养

微生物的恒温培养

菌种的保存
1.临时保藏: 接种到固体斜面培 养基,菌落长成后臵 于4℃冰箱保存。 2.长期保存: 甘油冷冻管藏法

四、课题成果评价
(一)培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中

保温1~2 d后无菌落生长,说明培
养基的制备是成功的,否则需要重

新制备。

(二)接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、 形状、大小基本一致,并符合大肠杆菌 菌落的特点,则说明接种操作是符合要 求的;如果培养基上出现了其他菌落, 则说明接种过程中,无菌操作还未达到 要求,需要分析原因,再次练习。

(三)是否进行了及时细致的观察与记录
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的 大小会有明显不同,及时观察记录的同学 会发现这一点,并能观察到其他一些细微 的变化。这一步的要求主要是培养学生良 好的科学态度与习惯。

本课题知识小结:


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